基因工程的技术操作(陶正)

基因工程操作技术（调整）1. 为什么要学习基因工程技术操作？1）只有在实验室才能真正学会和掌握基因工程的重要概念和相关原理。

2）只有在实验室才能真正增长知识和才干。

3）只有亲手做过的实验才能记忆犹新。

2. 珍惜实验课的体会：1)基因工程实验的开设来之不易。

2)实验课上的学习内容将为你今后的科学生涯打下宝贵的基础。

3. 实验室常见的仪器设备及用途：1)纯水仪：用途：制纯水注意事项：防止爆炸，防止发水。

2)天平：托盘天平（配平实用）电子天平（0.01、0.001、0.0001）3)磁力搅拌器（具有加热功能） 4）酸度计用途：配置药品调PH值注意事项：防止腐蚀保护电极4)高压灭菌锅（手动、半自动、全自动）用途：灭菌。

注意事项：使用前检查锅内水是否充足使用前设定好灭菌的温度、压力和时间打开和关闭灭菌锅是注意同时旋转对称的螺旋至少待灭菌无稍微冷却后方可去除5)超低温冰箱（--80。

C） 7）普通冰箱（--20。

C）用途：用于贮藏药品、材料等。

注意事项：确保冰箱门关严防止冻伤6)超净工作台：用途：用于植物组织培养、微生物接种。

注意事项：⑴确保使用状态时紫外灯必须关闭⑵保持清洁⑶不要用酒精擦拭有机玻璃挡板7)恒温培养箱：用途：用于液体培养基中对细菌的培养注意事项：使用前调好温度计转速8)高速冷冻离心机（台式、立式）用途：用于DNA、RNA等提取过程中的高速冷冻离心注意事项：⑴使用前要预冷，调好温度转速等⑵必须调平⑶使用后要关电源，擦拭干净（离心机内部的水珠）9)PCR仪：用途：用于基因扩增注意事项：⑴使用前设好程序⑵使用后关闭电源10)移液器：（0.2—1000μl）用途：用于微量液体的移取注意事项：⑴使用前必须看清楚量程，并在量程范围内使用。

⑵使用时要缓慢用力⑶切记避免有机溶剂腐蚀枪杆⑷使用后调至最大量程11)微波炉：用途：融化琼脂糖凝胶，或琼脂粉注意事项：⑴注意微波时间⑵避免污染物污染12)凝胶电泳装置：用途：用于核的电泳的检测注意事项：⑴使用前要注意电泳的方向与电泳槽的正负极是否吻合，设定拟使用的电压，电流等。

⑵使用时要戴PE手套，并注意不要产生大量的污染物。

13)UV投射仪及凝胶成像系统：用途：用于核算条带的观察及照相注意事项：⑴不要造成EB污染⑵使用时要先开电源，再开紫外，关闭是相反。

⑶使用后将凝胶几时拿走放回收处，并使仪器内部保持清洁。

14)烘箱：用途：用于烘干器皿注意事项：⑴防止器皿水分过多，造成短路。

⑵塑料凳器皿切记不要高温烘烤⑶玻璃器皿等高温烘烤后，注意及时断电，千万不能过夜。

15)分子杂交炉：用途：用于Southern、Northern等分子杂交。

注意事项：⑴正确设定杂交温度，时间等。

⑵防止同位素遗漏，污染。

16)恒温培养箱、培养室：用途：生物材料的培养注意事项：⑴正确设定培养温度、湿度、光照时间等培养条件。

⑵防止培养箱，培养是污染。

⑶注意温度的调节。

17)制冰机：用途：制碎冰。

注意事项：⑴使用时先接通水源。

⑵使用后要关闭水源。

18)蛋白质、核算分析仪：用途：测定核算及菌液的浓度。

注意事项：⑴使用时要先预热。

⑵使用前要调零。

⑶要调好光源。

19)测序仪：用途：对核算进行测序。

注意事项：防止污染、按程序操作。

20)基因枪：用途：用于转基因。

注意事项：无菌操作，保持清洁。

使用时检查是否漏气。

21)其他：恒温水浴锅、研钵研杵、液氮罐、电炉子、通风橱、涡旋器、同位素室及暗室。

4. 常见的有害化学物质：A．苯酚、氯仿、异戊醇。

B．溴化乙锭（EB）。

C．十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。

D．焦乙酸二乙脂（DEPC）.E．放射性元素32P、35S5. 安全规程：1)熟悉所有有害物质的标识。

2)在不知道正确操作程序时不要使用实验室的药品及仪器。

3)不要认为扩大污染源，或随意丢弃污染垃圾。

4)如果不小心将有害物质弄到皮肤或衣服上，马上采取有效措施处理。

5)严禁在实验室吸烟、饮食、以免误事和吸入有害物质。

6)不要穿拖鞋进实验室。

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一：实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。

二：实验原理：感受态细胞是经物理化学方法增强获取DNA能力的细菌细胞，其原理是处于0。

C的CaCl低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，此2时，细菌处于容易吸收外源DNA的状态。

三：实验仪器及药品：1.仪器：制冰机、恒温摇床、天平、酸度计2.材料：大肠杆菌DH5α，10ml离心管，1.5ml离心管溶液，80%甘油，LB液体培养基（1L），pH7.0-7.33.试剂：0.1mol/lCaCl2胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。

四：实验内容：1.用划线法将大肠杆菌DH5α接种于无抗性固体培养基上，与37。

C倒置培养1--2天。

2.从菌落上挑取一个单菌落接至3ml液体培养基中，37。

C振荡培养过夜。

3.取0.5ml菌液转到一个装有50mlLB液体培养基的锥形瓶中，37。

C振荡培养2--3h4.将菌液转移至10ml离心管中，冰上放置10min。

5.4。

C离心10min（4000r/min）回收细胞。

6.倒出上清液，将管倒置1min，以便培养液洗尽。

7.用冰冷的2ml0.1mol/lCaCl溶液悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min.28.4。

C离心10min（4000r/min）回收细胞。

（其上清）9.用冰冷的0.1mol/lCaCl0.4ml悬浮细胞（务必放在冰上）210.分装细胞：200μl/份，加30μl无菌甘油，混匀置-80。

C冰箱中保存，此细胞即为感受态细胞。

思考题：1.感受态细胞制备过程中的注意事项？整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。

所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

2.Ca2+感受态细胞中的作用？促进大肠杆菌转化。

实验二质粒DNA转化大肠杆菌实验目的：掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术。

实验原理：转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原理是细菌处于0。

CCaCl低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，转化混2合物的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物贴附于表面，经42。

C短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物，将细菌放置在培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得新表型得到表达，然后将细菌培养物涂在含有Amp的选择培养基中。

实验仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温箱、-70。

C冰箱、水浴锅实验材料：大肠杆菌DH5α，PUC1g质粒，离心管实验试剂：LB固体培养基20mg/ml X--gal40μl 200mg/mlPTG40μl实验内容：1.取200μl新配的感受态细胞加入DNA 2μl混匀，冰浴30min，同时用PUC1g做两个对照：受体对照：200μl感受态细胞+2μl无菌水溶液+2μl质粒DNA 质粒对照：200μl感受态细胞0.1MCaCl22.将管放在42。

C冰浴中90s。

3.冰浴2min。

4.每管加800μl液体培养基，培养45min5.加4μlIPTG和40μlX--gal混匀。

6.将混合液移至含有Amp（50mg/ml）的培养皿中，再用无菌涂布棒将菌液均匀涂满平板。

7.将适当体积（100μl）转化的感受态细胞涂在备好的培养基上。

8.倒置平皿37。

C培养12--16h，出现菌落。

转化数：=菌落数*稀释倍数*转化反应原液体积/涂菌板体积思考题：如何提高转化率？1）载体DNA及重组DNA 2)受体细胞 3）转化操作4）试剂纯度与器皿的洁净度实验三大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA。

实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA在拓扑学上的差异来分离它们，在pH值介于12.0--12.5这个窄小的范围，线性的DNA双螺旋结构解开而被断裂，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但现在两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密的结合在一起，当加入pH4.8的乙酸甲高盐缓冲液回复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA两条互补链仍保持在一起，因此，复兴迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会迅速而准确，它们缠绕成网状结构，通过离心，是染色体DNA与不稳定的大分子RNA，Pr--SDS复合物等一起沉淀下来被除去。

仪器材料与试剂：（一）：仪器：恒温摇床等。

（二）：材料：葡萄糖，Tris、EDTA、SDS 等（三）：试剂：1.溶液I：50mmol/l葡萄糖、25mmol/l三羟基氨基甲烷TrisHCL 10mmol/l乙二胺四乙酸EDTA（去除细胞壁，保护DNA）2.用前等体积混合(破坏细胞膜，使DNA变性)3.）冰乙酸（11.5ml）水（28.5ml）（使溶液恢复中性，使质粒DNA复性）1mmol/lEDTA ddH2O(灭)5.70%乙醇，放-20。

C冰箱中用后即放回。

6.胰RNA酶。

7.凝胶加样缓冲液：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝。

8.氯仿/异戊醇按24:1的体积进行配制。

实验步骤：1.将2μl含相应抗生素（50μg/ml）的LB培养基加入到试管中，接入上述含质粒的大肠杆菌，37。

C振荡培养液。

2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中4000r/min离心2min。

3.吸取培养液使细胞沉淀，尽可能干燥。

4.细胞沉淀悬浮于100μl溶液I中，充分混匀，室温放置10min。

5.加200μl溶液II盖紧管盖，混匀内容物，将离心管放在冰上5min。

6.加入150μl溶液III（冰上预冷），盖紧管盖，颠倒数次，是指混匀，冰上放置15min。

7.12000r/min离心5min，将上清液转移至另一离心管中。

8.向上清中加入等体积氯仿/异戊醇。

反复混匀，12000r/min离心5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上吸干液体。

9.向上请中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，-20。

C放置15--20min， 12000r/min离心5min，倒上清液，把离心管倒放在吸水纸上吸干液体。

10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀振荡并离心倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

11.加入20μlTE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰蛋白酶时DNA完全溶解-20。

C保存。

操作要点：1.溶液II必须新鲜配制，最好使用一次，将剩余的液体弃掉。

2.加入溶液III时，要把液体充分混匀，并在冰上孵育足够的时间，使沉淀完全，如果为充分将细菌裂解物与溶液II混匀，将会影响质粒DNA纯度。

实验结果：大肠杆菌质粒DNA提取的质量好坏需通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

思考题：1.为什么溶液II要现用现配？放置空气中的二氧化碳进入到氢氧化钠中，使氢氧化钠变性，降低溶液的PH，增加了破碎细胞膜的难度。