脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架构建组织工程软骨修复兔膝关节全厚软骨缺损

软骨无明显差别。２／３为成熟透明软骨，两侧整合 良好，细胞呈柱状排列，有潮线形成，软骨厚度接 近正常，基质染色与正常软骨无异。 三、Ｗａｋｉｔａｎｉ评分 根据番红花０、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原、染色判 断基质染色。 讨 论 关市软骨具有独特的三维基质细胞结构，基 质多而细胞少，即无血液供应又无淋巴回流，也没 有神经介质与体内内环境系统相联系。虽然细胞 终其一生都在产生新的细胞外基质，但对损伤并 不产生有效反应。如果损伤局限于软骨，而软骨 下骨并未受累时，仅仅邻近损伤的软骨细胞受到 刺激而发生轻微反应。当软骨下骨也受累时，才
冲洗过夜，常规石蜡包埋，５ｕｒｎ切片，ＨＥ、番红花Ｏ
染色、甲苯胺蓝及免疫ｌＲ化法作Ⅱ型胶原染色，光 镜下观察。 修复组织评估按Ｋｉｍ等制订的软骨修复组织 评估标准进行，分为①成熟的透明软骨：软骨细胞 在形态接近正常关节软骨组织；基质染色正常或 接近正常；细胞排列和关节透明软骨一样，呈垂直 排列，有潮线形成。②未成熟的透明软骨：新生修 复组织为透明软骨，但无关节软骨特有的细胞排 列结构，无潮线形成。③纤维软骨样组织：修复组 织由疏松包裹的成纤维细胞或向软骨分化的圆形 细胞组成。④纤维组织：修复组织基质中含有大 量成纡维细胞。 并按Ｗａｋｉｔａｎｉ评分及进行统计学处理，该评分 标准由五项指标组成，细胞形态、基质染色、，表面 平整度、新牛软骨厚度、与受区连接完整性；记分 范围从０到１４分，得分愈低，表示新生修复组织愈 接近正常。 五、统计学分析 数据用ＳＰＳＳ统计软件处理，采用单因素方差 分析，在ｎ＝０．０５水平上比较。 结 果 一、关节修复的大体观察
２ａＫＩ Ｉｎｔａｖａｔｉｏａｓｌ
第二届国际创伤骨科高峰沦坛（ＩＳＦＯＴ） Ｓｕｒａｍｉ（ｈ—ｆｏｒ ｏｍ日∞曲ｃ ｎⅢ一
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由于实验过程中动物出现疾病或死亡，实际 完成观察关节数为４４个。 空白对照３月组及６月组，共取材９个关节， ３，９只没有修复，４／９部分修复，修复很差，缺损凹 陷，不平整，边缘整合差。２／９修复较好，表面较为 平整，但乔光滑。修复组织与正常软骨差别明显， 边缘整合尚可。 单纯支架组３月组、６月组，共取材１１个关 节，１／１１缺损末修复（３月组），７１１１缺损部分修复， 修复组织有光泽，颜色、质地与正常软骨类似，但 表ｆ莳欠平程，有点状凹陷，交界区整合欠佳；３／１１ 缺损修复，有光泽，颜色、质地与正常软骨类似，与 正常软骨整合良好。 静态培养细胞支架组：３月组、６月组，成功取 材１８个关节，５／１８未完全修复，只修复约三分之 二缺损。７／１８修复组织见有点状凹陷，交界区整 合欠佳，６／１８修复组织完全修复，修复组织平整光 滑，有光泽，颜色、质地与正常软骨完全一致，交界 珏整合良好。 生物反应器培养细胞支架组：３月组、６月组， 成功取材６个关节，缺损区全部修复，２／６修复组 织见有点状凹陷，交界区整合良好，４１６修复组织 完全修复，修复组织平整光滑，有光泽，颜色、质地 与正常软骨完全一致，交界区整合良好。 二、关节修复的组织学观察Ｋｉｌｎ评估法的结 果见表２。 显微镜下所见：空白对照组，均为纤维或纤维 样软骨修复．无透明软骨。 单支架组：５／１１为透明软骨，３／１１两侧整合良 好，７／１１一侧整合良好，１例两侧均未整合（３月 组），６月组中３１６，软骨细胞号柞状排列，但未见潮 线，厚度接近正常，基质染色较正常稍浅。 静态培养细胞支架组：１８个关节ｏｍａｒｋ．
ｅｌｓ，ａｂｃａｍ）；旋转生物反应器购自美国Ｓｙｎｌｈｅｃｏｎ公 司。实验动物为新西兰大白兔，２．５ｋｇ以上，雄性， 购于解放军总医院实验动物Ｉｆｆ心。 二、方法 １．ＡＤＳＣｓ的分离培养：手术切取兔颈后皮下 脂肪５９，取材时严格保持无菌，取材后３０分钟内 进行干细胞分离。存超净工作台中，用显微剪刀 仔细剔除脂肪皇凡织表面的筋膜和小血管，Ｄ— Ｈａｎｋ’ｓ冲洗３遍以洗去红细胞的污染。剪碎，加 人５倍体积的０．０７５％的Ｉ型胶原酶．３７℃、搅拌 ３０ｍｉｎ，２０００ｄｒａｉｎ离心５ｍｉｎ，倾左上层脂肪及上清， Ｄ—Ｈａｎｋ’ｓ洗涤，１００目筛网过滤。１０００ｄｒａｉｎ离心 ｌＯｍｉｎ，沉淀用Ｄ—Ｈａｎｋ’ｓ洗２遍，将细胞重悬于 １０％ＦＢＳ的高糖ＤＭＥＭ培养基，种植于两瓶５０ｍＬ 培养瓶中，４８ｈ后换液。细胞长满８０％用０．２５％ 胰酶消化传代后换软骨诱导上立养基（含５ｎｇ／ｍＬ
ａｍ）。骨内部分全部微ｉＬ＋ＨＡ喷涂。 （４）足伸屈范罔’ｊ内外翻范围受到严格限制，
以增加稳定性（１９９４—１９９８）。 （５）滑动核做成生物活动光滑面及形状限制 式部件（１９９０—１９９６）。 六、ＳＴＡＲ假体设计理念的推动作用和疗效比 较 嗣后十余年中所施行的全踝置换病人越来越 多，翻修率明显下降，即使翻修，其间期也大大延 长，疗效渐趋稳定，已有１０—１５年随访报告，称达 到满意的中远期疗效。 ＳＴＡＲ假体的设计改进，推动了其他踝假体的 改进，其中包括ＨＩＮＴＥＲＧＲＡ踩假体、Ｓａｌｔｏ踝假体、 Ｂｕｅｃｈｅｌ—Ｐａｐｐａｓ踝似体、＇ＩＮＫ（ＮＪ）陶瓷假体等。例 如第三代Ｓａｈｏ踝假体的设计改进主要有如下三方 面： （１）着力减少踝部各种应力损害，假体设计取 向运动载倚型； （２）牛物力学固定设计；
ＦＧＦ一２，１０吲ｌＩｌＬ
Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｌｘ
ＴＧＦ一口１，５０ｕｇ／ｍＬ ＩＴＳ）。
Ｖｃ、１０—７Ｍ
２．脱细胞软骨基质支架的制备：将膝关节置 换术中切除的关节软骨用生理盐水冲洗干净后， 进行冻干处理，经粉碎机粉碎，筛取２００—１５０７ ｍ 大小的软骨微粒。加入ｌＯ倍体积的０．２５％胰蛋 白酶，在３７℃消化２４小时。离心后弃去胰蛋白 酶，再加入１０倍体积的１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００震荡７２ 小时，然后用蒸馏水反复清洗４８小时。按照软骨 微粒：蒸馏水１：３的比例混合后滴加在模板中，置 人冷冻干燥机进行冻干处理１２小时，制成直径 ４ｎｍｌ厚为２ｍｍ的支架，经８一ｗａ仕３１２ｍｎ的紫外线 照射８小时完成戈ｉ了软骨源性微载体的制备。经 ２５ｋＧｙ钴６０辐照灭菌后放置在４ｃｃ冰箱中备用。 ３．细胞支架复合体的构建及分组：收集诱导 １ｗ的ＡＤＳＣｓ。制成５×１０７／ｍＬ悬液，用５０ｕＬ微量进 样器由支架的中心部位将细胞悬液注入，３７％静 置１ｈ，随机分为静态培养组和生物反应器培养组， 静态培养组将支架细胞复合体置于１２孔板中，加 入软骨培养基。生物反应器组置人容积为ｌＯｍＬ 的反应仓中，加软骨诱导培养基，开始以每分钟５ 转旋转培养３ｄ后，阋至每分钟１０转。３７℃，５％
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Ｐ删ｉ，
脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架构建组织工 程软骨修复兔膝关节全厚软骨缺损
孙明学卢世甓康红军张莉袁攻许文静 赵斌郭全义 中国人民解放军总医院骨科研究所１００８５３
【摘要】 目的探讨以脂肪干细胞复合脱细 胞关节软骨支架构建组织工程软骨修复兔膝关节 软骨缺损的效果。 方法取兔颈后皮下脂肪，
第二届国际创伤骨科高峰论坛（ＩＳＦＯＴ）
２ｎｄ
Ｉｎｔｅｓ“ｓｌｌｎｌｌｌｉｔ Ｈ—ｆａｒ【ｋｌ●∞Ⅲｃ
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工全躁假体制作中也必须贯彻这种理念，方能使 假体的存活率提高。其主要改进有： （１）生物学固定，并扩大其固定面积，改进【１５ｊ 定方向； （２）假体的骨接触面全部改为喷涂微孔化，微 孔的大小为５０“ｍ一４００ ｐａｎ；同时，微７Ｌ表面｝ＬＡ喷 涂。 （３）为抵消主要为矢状位剪力，胫、距骨内有 矢向骨内柱，成竹节状，两只平行排列，间距约１６ １１１１１１—２２ ｍｍ；距骨侧假体为向跖侧矢向舵板（８ ｒａｉｎ
（３）胫、距骨切骨力求减少，以期假体与骨质
问的可靠固定（ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）。 近五年的文献报告中，ＳＴＡＲ假体和Ａｇｉｌｉｔｙ假 体的应用和报告增多，其次足Ｓａｌｔｏ假体和Ｂｕｅｃｈｅｌ —Ｐａｐｐａｓ（Ｂ—Ｐ）假体等。 纵观近几年所发生的踝假体设计改进，逐渐 出现趋ｌ司化。其主要表现是：①半限制型理念；② 多轴运动协同理念；③由２件套，转变为３件套； ④胫骨侧为平板形；⑤滑动核上面为平面，下面为 凹弧面；⑥距骨侧为凸弧形球面；⑦生物固定法；
【关键词】脂肪干细胞；软骨组织工程；支
架；关肖软骨缺损；生物反应器 由于软骨细胞再生能力有限，因此软骨的病 变微难自身修复。外科手段促进软骨修复多采用 软骨下骨钻孔、制造微骨折等技术打通髓腔，造成 局部出血从而加速修复进程。这砦方法虽然有一 定的疗效，但新生的软骨大部分足纤维软骨，短期 内可以缓解疼痛等症状，长期效果较差。近年来 ［｝Ｉ于组织工程技术和干细胞研究的飞速发展，给 软骨的修复带来了新的技术和方法。诱导成体十 细胞向软骨分化，构建组织工程软骨修复软骨病 变是目前组织工程领域的研究热点。脂肪干细胞 与骨髓基质干细胞均属于来自中胚层的成体下细 胞，研究证实两种干细胞的生物学特性及分化潜 能相似。但由于脂肪干细胞有着来源广泛，取材 简易，细胞获得量大等诸多优点而日益引起研究 者的广泛关注。近年来，研究者利用脂肪干细胞 在体内外成功构建了组织工程软骨，使之成为了 软骨组织工程领域又一理想的种子细胞。本研究
⑧要求对胫、距骨盼切骨尽量减少。
即使是陶瓷踝假体（日本），经过改进后的第 三代全踝假体采用新型氧化铝陶瓷，表面球珠化， 喷涂ＨＡ，于１９９１—２００１年开始应用于临床６２例 ７０踝，生物学固定方式，疗效明显优于第一、二代 假体。
第二届国际创伤骨科高峰论坛（ＩＳＩ：ＯＴ） ２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｅ ｒ Ｆｍ“ｆｏｒ ０Ｉｍ０口“ｃ Ｔｒａｕｔｍ
经Ｉ型胶原酶消化后获得脂肪干细胞。以人关节 软骨脱细胞基质为支架，复合经诱导的脂肪干细 胞，体外分别经过静态培养和牛物反应器培养，构 建工程软骨，对兔膝全厚关节缺损进行修复，并与 单支架及不处理组比较，术后３个６个月对修复 关节进行大体及组织学及免疫组化观察。 结果 不处理对照组全为纤维组织或纤维软骨样修 复，单支架组５１１１为未成熟的透明软骨，没有形成 成熟透明软骨；静态培养细胞复合支架组８３％为 透明软骨，其中３１１８为成熟透明软骨，１２１１８为未 成熟透明软骨；生物反应器培养细胞复合支架组 １００％为透明软骨，其中２／６为成熟透明软骨，４／６ 为未成熟透明软骨；Ｗａｋｉｔａｎｉ评分各组差异显著。 结论脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架良 好的修复了兔膝关节全厚软骨缺损，证明了其作 为软骨组织工程的种子细胞是完全可行的；应用 生物反应器技术，有助于构建组织工程软骨，促进 了软骨缺损的修复；脱细胞软骨基质支架是良好 的软骨组织工程支架，具有很高的应用价值。