牛卵母细胞的玻璃化冷冻研究
玻璃化冷冻度
玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。
各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。
人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。
玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。
解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。
C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。
比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。
冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。
这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。
玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。
冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。
玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。
牛卵母细胞冷冻保存研究进展
在不 孕症 治疗 方面 发挥 重 要 作用 ． 克服 ＾ 肛胎 冷 冻
保 存 带 来 的伦 理 、 德 和 法 律 上 的 争 议 和 限 制 。 道 １ 牛 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 方 法 １１ 慢 速 冷 冻 、 速 解 冻 法 ． 快 卵 母 细 胞 用 冷 冻 保 护 剂 平 衡 处 理 ． １ ｒｉ 以 【／ ｎ ａ
１ ２ 玻 璃 化 法 ．
体都 没 有恢复 到正 常形状 。由于正 常纺锤 体 的构建 既需要 染 色体 激 括微 管 蛋 白 聚合 反应 ， 又需 要 中心 粒物质 （ Ｃ ） Ｐ Ｍ 击组织 它 。 Ａｍａ ｎ等认 为 ， 牛卵母 细胞 微 管 大 部分 限 于减 数 分 裂 纺 锤 体 ， 构 成 Ｐ 而 ＣＭ 的 很少 。牛卵母 细胞经 冷却 和 复温后恢 复正常 纺锤体
在 细 胞 质 中 ， 管 是 由 与 自 由 微 管 池 平 衡 的 聚 微
合 微管 蛋 白组成 的 。 卵 母细胞 中 ， 在 微管 主要 组成纺 锤体 。 微管 是 正在发育 的 卵母 细胞 成熟 所必需 的 ， 将 引导决 定染 色体 如坷分 布 。微管骨 架具有 对环 境 条 件及 理化 因子作 出反应 而迅速 集合 和解 聚 的惊 人 能 力， 温度是微 管 动力学 中最敏 感 的因子之 一 。 由冷 冻 伤 害而引起 的任 何细胞 骨架 畸 型都将对 解冻 后 卵母 细 胞 的进一 步发育 造成 影 响 Ａｍａ ｎ等 （９ ４ 研究 了冷 却 及复 温对 牛体 外 成 １ ９） 熟 卵母 细胞 纺锤 体 的影 响 ， 结果表 明 ， 卵母 细胞 置 将
的能 力 ， 到 Ｐ Ｍ 量 的限制 。 受 Ｃ ２２ 婶透 明带 的影 响 ，
ＲａＩ Ｆ ｈ （ ９ ５ 首次 用 玻 璃 化 法 成 功 地 冷 和 ａ ｙ １８ ） Ｌ
牛GV期卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究
４４ － ５ ． ９ ４ ５
ｐ ｓ ＇ Ｐ ｄ ｔ Ｒ ｓ１ ９ ，２ ２ ｌ０ －１ ． ｌ ［ ］ ｅｉ ｒ ｅ，９ ７ ４ （） ２ ８２ ３ ｇ Ｊ． ａ ［］ 谢 华 ， ５ 何韶街． 组胺对 肥大细胞激 活的研 究［］ 中华微生物 Ｊ． 学和免疫学杂志 ，２０ ．４ ３ ｌ６ ． ０ ４ ２ （） １ ８ ｉ ｗ ｉｓ ｔ ｎ ｏ”ｈ ｄ ｅ ｓ ｅ ｌ ｇ ｉ ｏ ｈ ｍｉ ［ ］ Ｇａｌ ＳＪ ６ １ ．Ｎｅ ｎ ｉ ｈｓｉｔ ｔ ｅｒｄ ｌ ｆｔ ｅｍａｔｃ Ｈｓ —
冷冻法与细 管玻 璃 化 法（ ｔａ 之 间的差异 Ｓｒｗ）
自 Ｗｉ ｉｇ ａ 成 功冷 冻 保 存 小 鼠卵 母 细胞 以 ｔｎ ｈ ｍ ｔ １人 ］ 不显著 （ Ｐ＞ ０ ０ ） 在 开放 式拉 管 法（ Ｓ 来［ ， 们在 卵母 细 胞 冷 冻 保 存 方 面 进行 了广 泛研 ．５ ， ＯＰ ）
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动物 医学进 展 。０ ６ ２ （ ） ７ —１ ２ ０ ， ７ ７ ：７８
Ｐ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｉｉ ｅ ｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒ ｒ ｄ ｃｎ ｎ
牛 Ｇ 期 卵
（Ｒ Ｐ ０Ｈ） 乙二 醇 （ Ｇ） 甘 油 （ ） 、 Ｅ 和 ＧＬ ４种 冷 冻 化 冷 冻效 果 优 于程 序 化 冷 冻 。说 明 ＧＭＰ和
保 护 剂程 序 化 冷 冻 牛 ＧＶ 期 卵母 细胞 的 结 果 ０ Ｓ玻 璃化 冷 冻优 于 Ｓ ｒｗ 玻 璃 化 冷 冻 。说 Ｐ ｔａ
表 明， Ｇ 和 Ｐ ＯＨ 的 保 护 效 果 比 Ｇ 和 明可以采 用 ＧＭＰ方 法冷冻保 存牛 ＧＶ期 卵 Ｅ Ｒ Ｌ
ｃｏ ｎ ｉ ｎ ｎｔｌｒｇ ｌ ｉｎ ｏ ｓ ｅｌｄ ｖ ｌｐ ｅ ｎ ｈｅ ｒｅ ｖｒ ｍｅ ａ ｅ ｕａｔ ｆｍａ ｔｃ ｌ ｅ ｅｏ ｍ ｎｔａ ｄｐ － ｏ ｏ
不同冷冻方法对牛卵泡卵母细胞发育潜力的影响
成部分 ， 它不仅可为体外受精、 核移植、 转基因动物 研 究 等 旺 胎 工程 技 术提 供 具 有 发 育 能 力 的 卵 母 细
胞， 而且 还 可与精 液冷冻 、 胚胎 冷冻 保存一 起建 立种 质库 ， 为地 方 优秀 家 畜 保种 和珍 稀 濒危 野 生 动物 保 护提供 新 的途径 ｕ。尽 管有 人 已经用 不 同方法 冷 冻 １ ］ 保 存 小 、 人’ 牛Ｄ和 ｑ的成 熟 卵母 细 胞体 外 受 精 繁殖 后 代 获得 成 功 ， 解 冻后 卵母 细 胞 的发 育 潜 力 但 明显受 损 本 实验研究 了三 种不 同方法 冷冻 保存 的 牛 卵泡 卵母细 胞 的发育 潜 力
Ｖ） 油 中 平 衡 １ｍｉ 再 移 入 冷 冻 液 （Ｂ 甘 ０ ｎ， Ｐ Ｓ＋２ ０ ＮＣ Ｓ＋１ ％甘 油 ） ０ 中平 衡 ５ｒｎ， 入 冷 冻 细 管后 ， ｉ 装 ａ 用 Ｃ －８３程 序 冷 冻 仪进 行 冷冻 ， Ｌ－ ６ 首先 以 ２ ０ ． Ｃ／
中， 玻璃化冷冻效果最好， 受精率分别达到 １． 和 ｌ． ， ５Ｏ １１ 是值得进一步研 究的一种方法。
关 键 词 ：牛 ； 卵泡 卵母细胞 ； 冻方法 ； 育潜 力 冷 发
中围分类号 ：８ ３ ３ ￥２． 文献标识码 Ａ
卵母细 胞的冷 冻保存 是胚 胎生物 技术 的重要 组
糖＋ ０３ ． ３Ｍ 甘油 、Ｂ ＋ ０ ５Ｍ 蔗糖 中 ， 步脱 去 ＰＳ ． 三
甘油 ， 步 ５ 每 ～７ｒｉ。Ｂ法 和 Ｃ法 用 Ｐ Ｓ＋ ０ ５Ｍ ａｎ Ｂ ．
蔗糖 一步 脱除 冷冻 保护 剂 。 除保护 剂 的 ｃ 脱 ｏＣ用成 熟 培 养液 （ ９ ＋ｌ 发 情牛 血 清） ２次 ， Ｍｌ９ Ｏ 洗 在实 体 显微镜 下 检查 形态 是否 正 常 卵丘细 胞 未脱 落 ． 透明 带完整 ， 质均 匀 的卵母 细 胞 ， 为 形态 正 常 胞 判 １４ 卵 母细胞 的成熟 培养 ． 将形 态正 常的 Ｃ ＯＣ移 入 Ｍ１ ９ ０ （Ｃ ） ９ ＋１ Ｅ Ｓ 的
细胞松驰素B(CB)对水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响
关键词： 卵母 细 胞 ； 囊胚 ； 璃化 冷 冻 玻 摘 要 ： 究主要 探 讨 冷冻前 细胞 松 弛素 Ｂ（ Ｂ 预 处理 水 牛 Ｍ Ⅱ期 卵母 细 胞 对 其冷 冻 效 果 的影 响 。 研 Ｃ ）
Ｇ Ｐ组和 Ｇ Ｐ＋ Ｂ组卵母细胞解冻后的存活率（ ８ ８％ 、４ ２ ％ ） Ｍ Ｍ Ｃ ８ ． ９ ９ ．０ 和培养后发 育到囊胚 的比率
（ ． ２ 、４ ５ ％ ） ８ ８ ％ １ ． ５ 差异均 不 显著 （ ＞０ ０ ） 但 Ｇ Ｐ组 和 Ｇ Ｐ＋Ｃ Ｐ ．５ ， Ｍ Ｍ Ｂ组存 活 卵母 细胞 激 活后 的分 裂
率 差异 显著 （ ２ ６ ％ 、５ ５ ％ ， ＜０ ０ ） 所 以细胞 松 弛素 Ｂ预 处理 可 以提 高 Ｇ ３ ．９ ５ ．６ Ｐ ．５ ， ＭＰ冷 冻卵母 细胞 的
发 育能 力 ．
过去 科研 人员 常 常 集 中研 究 未 成 熟 卵母 细 胞 的
１ １ 试验 试 剂及药 品 ． 除 Ｔ Ｍ１ ９为 Ｇ Ｂ Ｏ公 司生 产 外 ， 他 所 有 无 Ｃ ９ ＩＣ 其 机盐 和生 物 化学试 剂均 由 Ｓｇ 公 司生 产 。 ｉ ｍａ
１ ２ 培 养液配 制 ．
冷冻 ， 而对 成 熟卵母 细 胞 的冷 冻 研 究 得 较 少 ， 原 因 其 是 ＭⅡ期 的卵母 细胞 中纺 锤 体对 低 温 和冷 冻 保 护 剂 极其 敏感 ， 果 在 冷 冻 过 程 中损 伤 了卵 母 细 胞 。 因 结 此 ， 何 降低低 温 和冷 冻保 护剂 对卵母 细胞 的损 伤就 如
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究的开题报告
奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研
究的开题报告
一、研究背景及意义
近年来，随着生殖技术的逐步发展和成熟，胚胎冷冻技术已经成为
了一种有效的保护和利用动物遗传资源的方法。
同时，该技术也被广泛
应用于人类的生殖医学领域，为不孕不育、遗传疾病等问题提供了可行
的解决方案。
在动物领域，奶牛是重要的经济动物之一，其肉、奶、皮毛等多个
产业都拥有广阔的市场。
而胚胎冷冻技术的应用不仅可以为奶牛的优良
种群提供保护，还可以实现对其生产效益的提高。
因此，奶牛胚胎冷冻
技术的研究具有重要的意义和应用价值。
二、研究内容及方法
1. 奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法的研究
卵母细胞玻璃化冷冻是指将卵母细胞置于高浓度保护剂溶液中，使
其渐进性脱水并达到可逆的冷冻/解冻状态，从而实现卵母细胞的保存和
利用。
本研究将对奶牛卵母细胞冷冻的基本条件进行研究，并通过体外
培养和移植实验，测试不同奶牛卵母细胞冷冻方案的效果和适用范围。
2. 奶牛胚胎程序化冷冻技术的研究
程序化冷冻技术是指将胚胎在发育过程中特定阶段静止，并将其置
于保护剂溶液中进行快速冷冻和解冻，以保证胚胎的完整性和发育能力。
本研究将针对奶牛胚胎发育过程中的不同阶段，设计多种具有代表性的
程序化冷冻方案进行研究，并通过移植实验，比较其效果和适用范围。
三、研究预期及意义
通过本研究的开展，可为奶牛胚胎冷冻技术的应用提供更为科学和有效的方法和技术路线，进一步保护和利用奶牛的遗传资源，推动奶牛产业的可持续发展。
同时，该研究在探索动物胚胎冷冻技术的理论和实践方面也将为生殖医学领域的进一步发展提供参考和借鉴。
冷冻保存对卵母细胞影响的研究进展
振光 显微镜 观察 到 ，经传统 的慢速 冷冻方 法冷 冻的
卵母 细胞在 融解 过程 中纺锤体 消失 ， 虽多数 可在 ３ｈ
生 的婴儿 仅三百 多例 。卵母 细胞体 积大 只是造成 卵
母 细胞 冷冻 困难 的重要 原 因之 一 。而 在冷 冻 、 冻 解
山 东省计 划 生育科研 所 生殖 医学中心 （５ ０ ２ 董 云玲 刘永 洁 ２００ ） 综述 李 娟 审校
摘 要 随着 辅 助 生殖 技 术 的发 展 ， 卵母 细胞 的冷 冻 技 术受 到 了广 泛 关 注并 被 广 泛 应用 。但 与 早 期 胚胎 的冷 人
冻保存相比 ， 卵母 细胞 的冷 冻 保 存具 有 复 苏 后 成活 率 低 、 精 率 低 、 胎 发 育 潜力 差 、 受 胚 妊娠 率 低 、 产 率 高 等 特 点 。冷 流 冻 和解 冻 过 程 以及 冷 冻 保 护 剂等 均 会 对 卵母 细胞 造 成 一 系 列形 态 学 、 细胞 学 以及 生理 、 化方 面 的 影 响 。 如 ： 冻 保 生 冷 护剂 、 冻融 过 程 等 可 对 卵母 细 胞 的 纺锤 体 、 细胞 骨 架 、 胞 内钙 离 子 、 白质组 、 胞代 谢 以及 卵母 细 胞 的活 性 和 发 育 细 蛋 细 潜 力 造 成 不 同 程度 的影 响 。研 究 卵 母 细 胞特 殊 的生 物 学特 性 以及 冷 冻 对其 造 成 的 影 响 ， 助 于 改进 卵 母 细 胞 的 冷 冻 有
冻存 以避 免卵子 浪费 。该项 技术还 可为 卵子赠送 提 供方 便 。 自 １８ ９ ６年 Ｃ ｅ ｈ ｎ等首次报 道冻融 人卵母 细 胞 获成 功妊 娠 已二 十余 年 ，这 项技 术 进展 缓慢 ， 出
玻璃化冷冻卵母细胞及卵巢组织研究进展
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ
ＧＡ ０ Ｊｉｎｇ，ＣＡ，Ｘｉａ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＧＡ ０ Ｊｉｎｇ）；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ矿Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，ｔｈｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＸｉｎｊｉ犹ｇ
细胞［２Ｊ的生存率和胚泡形成率。玻璃化冷冻前预平
但不影响卵子冷冻过程中的脱水，也不影响卵子的 再水化．包被的颗粒细胞对ＭⅡ期卵子的冷冻起一 定的保护作用。
卵巢组织玻璃化冷冻
衡时间及温度及膜渗透性会影响冷冻效果．寻求各 参数的平衡点对获得好的预平衡效果十分必要。
二、玻璃化冷冻保护剂的应用及改进
常用细胞内冷冻保护剂有：ＤＭＳＯ、甘油、丙二 醇（ＰＲＯＨ）、ＥＧ等，细胞外冷冻保护剂有蔗糖、海藻 糖等。多数学者认为，ＥＧ＋ＤＭＳＯ和大分子糖类是比
冻样本的体积。可更容易玻璃化。近期Ｆｕｊｉｈｉｒａ等［ｓ］ 研究发现．去除卵丘细胞的冷冻并不影响卵母细胞 复苏后的存活率。但可降低其胚胎的发育能力。
Ｐｕｐｐｅｎ．Ｌｉｎｇｈａｍ等对卵丘颗粒细胞研究表明，其不
寻找最适平衡时间也有助于改善冷冻效果。有研究 发现，采用逐步平衡法或洗脱法有助于改善冻融后 鼠ＧＶ期卵细胞、人ＭⅡ期卵细胞及人３一原核期卵
细胞骨架、膜完整性等的损伤。自玻璃化冷冻鼠胚
胎首次成功后，该技术已广泛应用于卵母细胞和卵 巢组织的冷冻。 玻璃化冷冻人卵母细胞 Ｙｏｏｎ等将体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）患者
早在１９７３年。Ｌｕｙｅｔ就证实液体的凝同可分为 两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序排 列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈 无序排列．保持未凝同前的状态。玻璃态介于液体
牛卵母细胞玻璃化冷冻保存影响因素的研究
０ ０５ ６ ／ Ｌ肝 素的 Ｍ１９液 ） Ｖ １ 含 １ ％Ｄ Ｓ ． ０９ ｇｍ ９ 、Ｓ（ ０ Ｍ Ｏ和
１％ Ｅ 的 母 液 ） Ｖ ２ 含 ２ ％ Ｄ Ｓ ２ ％ Ｅ 和 ０ Ｇ 和 Ｓ（ ０ Ｍ Ｏ、 ０ Ｇ
０３ ． Ｍ蔗糖 的母 液 ） ０ ８ Ｌ 各 ． ｍ 。将 欲冷冻 的卵母 细胞先 放 在母液 中 ， 然后取 ２～ ４枚卵母细胞放在 Ｖ １中平衡 Ｓ
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第２ ５卷第 ４期 ２０ ０ ８年 ８月
生 物 学 杂 志
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ Ｏ ＯＬ Ｙ Ｆ ＢＩ ＯＧ
Ｖｏ ＿ Ｎｏ ４ ｌ２５ ．
Ａｕ ２ ０８ ｇ， ０
牛 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 保 存 影 响 因素 的研 究
目前 ， 家畜胚 胎体外 规模 化生产 、 核移植研 究 和基 因库 的建立 发展非 常迅 速 ， 但所需 的大量卵母 细胞都 来 自屠 宰场中收集 的卵巢 。这 就必然受季节 变化导致 卵母 细胞质 量改变 和屠宰 时 间的限制 ， 以大 大阻碍 所 了研究工作 的开展 。而卵母 细胞冷 冻保 存 技术 ， 以 可
谭 秀 文 ， 晓牧 ， 刘 游 伟 ， 金 明 ， 发 春 黄 万
２０ ０ ） ５ １ ０ （ 东省 农 业科 学 院 畜牧 兽 医研 究 所 山东省 畜禽疾病 防 治与繁 育重 点 实验 室 ， 南 山 济
摘
要 ： 用毛 细玻 璃管法对牛 卵母 细胞进行玻 璃化冷冻保存 ， 采 解冻后再进行 体外受精 （Ｖ ） Ｉ Ｆ 和早期胚胎 的体外培
Ｆｋ ｕ ｕ等 。将 培养成熟 的 Ｃ Ｃ 用 ０ １ 的透 明质酸 Ｏｓ ．％ 酶去除部分 卵丘 细胞后进行冷冻保存 。试 验 中将 卵母 细胞体外分别培养 ０ ４ ８和 １ ｈ 冷 冻保 存 ， 、、 ５ 后 解冻后 移 入成熟培养 液 中， 分别 继续 培养 ２ 、８ １ ２ １ 、４和 ７ （ ｈ 总 培养时间约为 ２ ｈ 再 进行体外受精 。 ２） １２ 卵母 细胞冷 冻及解冻 ． １２ １ 冷冻 ．． 将 四孔板 （ ｏ Ｎ ｎ ） 于恒温 台上 ， Ｃ． ｕｃ 置 分
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
THANKS
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温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
牛卵泡卵母细胞冷冻保存的研究
ＰＳ Ｂ ＋体 积 分 数 ２ Ｎ Ｓ＋体 积 分 数 ５ 甘 油和 ０ Ｃ ＰＳ Ｂ ＋体 积 分 数 ２ Ｎｃ ＋体 积分 数 １ 甘 油 中 Ｏ Ｓ ０ 各 平 衡 １ ｎ 温 度 保 持 在 ３ Ｃ， 后 每 ５ ０ｍｉ， ０ 然 Ｏ个
率分 别 为 １ ． ，７ １ ．１ ６ ；１ １ ．２ ６ ，５ １ 和 ５６ ，． ，】 １ 结 果 还 表 明 ： 璃化 拎 冻 的 卵母 ４ ３ １ ． ２ ． １ ． １． １． ９ １ ｌ． 玻 细胞 损 伤 较 轻 。
［ 关键词］ 牛 ； 卵泡卵母细胞 ； 冻保存 ； 玲 体外受精 ［ 中国分类号 ］ ￥ ２． ４ ８３３ ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章编号 ］ｏ ｏ２ ８ （０ ２ ０ —０ １Ｏ １ｏ 一７ ２ ２ ０ ） ２０ ５一４
维普资讯 ຫໍສະໝຸດ 第 ３ ０卷生 第 ２期
Ｊｕ． ｆ ｏｔｗｓＳｉ ｅｈＵ ｉ ｆ ｇ【ａｄＦｒ（ ａ ｃ Ｅ ． ｏｒ ｏ Ｎｒ ｅｔ ｃＴｃ ｎ ．ｏＡ ｎ ｏ．Ｎ ｔ ｄ） ｈ — ｖ ｒ ＿ ｓ
西北农林科技太半学报（ 自然科 学版 ）
自Ｗｈｔ ｎ ｈ ｍ５ 首 次报 道来 自冷 冻解 冻 的小 ｉ ｉｇ ａ ］ ｔ
１ ２ 卵母 细胞 的冷 冻 ． 用下 述 ３种 方 法进行 冷 冻 。Ａ 法 ： Ｃ ） 把 （ｃ置于
鼠卵母 细胞 的活 仔 以来 ， 究 者 对人 及 家畜 的卵母 研 细 胞冷 冻保 存也 进 行 了探 索 ， 已获得 来 自冷 冻 解冻 的人卵母 细胞 婴儿 。家 畜主要 集 中在 牛上进 行 了 ］ 研 究 ， 获 得 了 为数 很 少 的 来 自冷 冻 的 牛 体 外 成 并
卵母细胞冷冻保存的方法
卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。
单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。
现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。
1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。
另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。
该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。
（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。
现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。
（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。
打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。
该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。
2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。
尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。
卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。
（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。
细胞松弛素B对玻璃化冷冻牛卵母细胞的影响
Ｂ Ａ（ ｏ ｏ ｅ ） ＭＥ Ｅ Ｓ Ｂ ｖｇ ｎ 和 Ｎ Ｎ ＡＡ（ ｉ ） ， 余 均 Ｇｂｅ 外 其 ｏ
为 Ｓｇ 公 司产 品 。 ｉｍａ
１ ２ 方 法 ．
ｆｃ ｉ ｉｃ ｔ ｎ Ｓ Ｖ） 玻 璃 微 细 管 法 （ ｌｓ — ａｅｖｔ ｆ ａｉ ， Ｓ 和 ｒｉ ｏ ｇａ ｓｍｉ
卵巢采 自新 疆 乌 鲁 木 齐 市 天 鹰 屠宰 场 ， 液 是 精 由新疆 维 吾 尔 自治 区 畜 禽 改 良 总 站 提 供 的 细 管 冻
精 。所用 试剂 除 Ｔ Ｍ１ ９ Ｇｂｃ ） Ｆ Ｓ Ｈｙ ｌｎ ） Ｃ ９ （ ｉｏ ， Ｂ （ ｃ ｅ ， ｏ
ｐ ｌ ｄｓｒｗ， Ｓ 、 体 表 面 玻 璃 化 法 （ｏｉ ｓ ｒ ｕｌ ｔａ ０Ｐ ） 固 ｅ ｓｌ ｕ— ｄ
１ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
寻找 容易 实现玻 璃化 并且 对 卵母 细胞 损 伤 较小 的玻 璃化 液 ， 以及 大 幅度 提 高 冷 冻 速 率 而 进 一 步 减 少 冷
冻对 卵母 细胞 的损 害 。在 此 期 间 ， 多种 玻 璃 化 冷 冻
方法 应 运 而 生 ， 开 放 式 拉 长 塑 料 细 管 法 （ ｐｎ 如 ｏ ｅ
冻 效果 的改善 。
关键 词 ： 母 细胞 ； 璃 化冷 冻 ； ； 胞松 弛素 Ｂ 卵 玻 牛 细
中 图 分 类 号 ：８ ４ ８ ￥ １． 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ ７５ ３ （ Ｏ Ｏ Ｏ — ０ ５０ １０ —Ｏ ８２ １ ）３０５ —５
随着胚 胎工 程技 术逐 步应 用 于家 畜 繁殖 和 育种 领 域并 形成 产 业化 ， 卵母 细 胞 的来 源 是 制 约 其 发 展 的重要 因素 ， 母 细 胞超 低 温 冷 冻 保 存 则 是 把 这 些 卵 技 术发 展 到 应 用 阶 段 不 可 缺 少 的 一 个 重 要 技 术 手
OPS
Ａｂｓ ｒ ｔ Ｂｏ ｉ ｅ ｏ ｙ ｅ ｕ ｔ ｅ ｉ ｔｏ ｏｒ６ ｈ ｏ ２ ｈ ｗ ｅ ｅ ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ｔｉｉｄ ｉ ｔａｃ ： ｖ ｎ ｏｃ ｔ ｓ ｃ ｌｕｒ ｄ ｎ ｖｉｒ ｆ ｒ ２ ｒ ｅ ｐ ｃ ｉｅｙ ｖｉｒｆｅ ｎ ＥＦＳ ４０，ＥＦＳ ０， ５
＞ ０． ０５）．
Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ：Ｏ ＰＳ； Ｖ ｉｒｆｃ ｔｏ ｔｉｉａ ｉｎ；Ｏ ｏ ｙｔ ｏ ｖｉ ｅ ｃ ｅ；Ｂ ｎ
哺乳 动 物卵 母 细胞 的有 效 冷冻 保存 是 保 护 品种 资源 和拯 救濒 危 动 物 不 可 缺 少 的技 术 保 障之 一 ， 是 加 快 家 畜品 种 改 良和胚 胎 移植 技术 产业 化 ｂ ｗｏ ｓｅ ｔ ｏ ｔ Ｓ （ ｐ ｎ ｐ ｌ ｄ ｓｒ ｗ） ３ ｎ ４ ｙ ｔ —ｔｐｍｅｈ ｄ ｗｉｈ ＯＰ ｏ ｅ ｕｌ ｔａ ．Ｔｈ ｅｔｒ ｓ ｌ ｒ ｒ ｍ ｏ ｙ ｅ ｅ ｅｂ ｓ ｅ ｕｔ ｗｅｅ ｆｏ ｏ ｃ ｔｓ ｓ
成 部 分 。 同 时 也 是 为 克 隆 、 基 因 动 物 生 产 和 显 微 转
存 的水平 。Ｎａ ａ ａａ２采 用 Ｄ Ｏ、 ｋ ｇｔ ＭＳ 乙酰 胺 为 主 体 抗冻 保护 剂 制成 玻 璃化 溶 液 （ １ 冷 冻小 鼠成 熟 卵 ＶＳ ） 母 细 胞 ， 冻 后 形 态 正 常 率 达 ８ ％ ， 形 态 正 常 的 解 ７ 将 卵母 细胞 进 行 体 外 受 精 ， 裂 率 达 ７ ％ ， 后 未 能 卵 ８ 此 继续 发 育 。Ｍｉａ ｅ等ｌ一 细 乙 二 醇 为 主 体 的抗 冻 ｙｋ ３用 液对 小 鼠卵母 细 胞 冷 冻保 存 ， 冻 后 形 态 正 常 率 仅 解 为 ４ ％。 而后 Ｐ ｄｏ等 用 Ｄ Ｏ代 替 乙 二醇 冷 冻 ｅｒ ＭＳ 后小 鼠 卵 母 细 胞 形 态 正 常 率 达 ４ ％ ， 裂 率 也 很 ２ 卵 低 。在 家 畜 方 面 ， ｕ ｕ等 一 丙 二 醇 为 主 体 抗 冻 Ｆｋ ５以 剂 ， 慢 速 冷冻 法对 牛 成熟 卵母 细 胞 冷冻 保存 ， 冻 用 解
玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法慢速冷冻法即玻璃化冷冻来自于自然的启示，科学家发现某些种类的青蛙可在冬季经历零下数十度冷冻，而在春季解冻，且机体没有任何损伤。
研究认识到，这种青蛙冷冻时体内存在丙三醇，代替水作为细胞内溶剂，而在春天苏醒后体内丙三醇消失。
“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。
玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。
1985年，玻璃化冷冻鼠胚胎首先获得成功。
目前，玻璃化冷冻保存细胞已成功应用于动物卵母细胞、血细胞及胚胎，眼角膜、皮肤、血管等组织中，而人类胚胎中的应用始于1990年，目前已经获得广泛成功。
玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。
快速冷却，低温时形成透明的玻璃状固体，冷却过程中黏度很高，但无冰晶形成，避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。
玻璃化冷冻主要操作步骤简单，包括：高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。
影响玻璃化冷冻效果的因素主要包括：①冷冻保护剂。
同一种组织细胞，冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。
细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质，如多糖类(蔗糖、海藻糖)、聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BSA)和Percoll 等；细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质，如二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇。
冷冻保护剂毒性也是人们对玻璃化冷冻担心的主要问题，但迄今大量的临床和动物实验均未发现这些冷冻保存剂对动物和人类胚胎有任何不良影响；②温度下降速度。
降温速度越快越好，可直接沁入液氮的方法，降温速度约为2500 ℃/min，而使用玻璃化冷冻仪降温速度可达135000 ℃/min；③胚胎载体。
对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小，与液氮间隔尽量少，操作简便且不易丢失胚胎，目前常用的有：拉细的麦管、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、直接微滴法、电镜网和Cryoloop。
不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻
不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻廖宏庆;林戈;陆长富;卢光琇【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2010(20)11【摘要】目的比较显微授精治疗周期中剩余的生发泡(GV)期不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻效率.方法将显微授精(ICSI)周期剩余的GV期卵母细胞随机分为3组:①在GV期玻璃化冷冻,解冻后进行体外成熟培养;②体外成熟培养至MII期后行玻璃化冷冻;③对照组:直接进行体外成熟培养(IVM).观察体外培养成熟卵母细胞及不同成熟阶段卵母细胞冷冻后的受精和发育潜力.结果对照组的成熟率为71.6%(53/74),其中16枚行显微授精(ICSI),受精率为87.5%(14/16),卵裂率为85.7%(12/14),囊胚形成率为14.3%(1/7);组1与组2的存活率分别为97.5%(39/40)和87.5%(35/40),差异没有显著性;但是组1的成熟率28.2%(11/39)显著低于(P<0.01)对照组的成熟率71.6%(53/74);组2的受精率74.1%(20/27)与对照组的受精率87.5%(14/16)相比,差异没有显著性.结论 ICSI周期剩余的GV期卵母细胞能在体外培养成熟并具有良好的发育潜力,将GV期卵母细胞体外成熟培养至MⅡ期更适合于玻璃化冷冻保存.【总页数】5页(P1614-1617,1621)【作者】廖宏庆;林戈;陆长富;卢光琇【作者单位】中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078;中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078;中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078;中南大学生殖与干细胞工程研究所,湖南,长沙,410078【正文语种】中文【中图分类】R71;Q2【相关文献】1.保存温度对卵母细胞体外成熟率的影响及牦牛卵母细胞体外成熟培养方式初探[J], 庞礴;赵新全;郭志林;屈雷;于鸿浩;郭松长2.年龄及月经周期时相对不成熟卵母细胞质量及体外成熟的影响 [J], 艾继辉;罗丽兰;刘建新3.人类不成熟卵母细胞体外成熟影响的因素初探 [J], 谢常青;林戈;杨苏安;阳翎;卢光琇4.牛卵母细胞体外成熟,体外受精培养的胚胎玻璃化冷冻试验 [J], Mahm.,AR;皮光辉5.未成熟卵母细胞体外成熟前后玻璃化冷冻的比较 [J], 施丽;公方强;莫毅;牛向丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生育力保存中玻璃化冷冻载杆的研究趋势及监管挑战
生育力保存中玻璃化冷冻载杆的研究趋势及监管挑战
张坤智;晁园;孙晓晴;俞卉;王越;齐伟明
【期刊名称】《医疗卫生装备》
【年(卷),期】2023(44)1
【摘要】阐述了生育力保存过程中关键医疗器械玻璃化冷冻载杆的演化历程,分析了现有的“开放式冷冻、开放式保存”“开放式冷冻、封闭式保存”及“封闭式冷冻、封闭式保存”3种玻璃化冷冻载杆的优势与弊端,提出了玻璃化冷冻载杆的改良趋势并提供了研究思路,立足监管挑战剖析了玻璃化冷冻载杆监管关注点,为提升生育力保存的有效利用率及国产辅助生殖医疗器械的发展提供了助力。
【总页数】6页(P81-86)
【作者】张坤智;晁园;孙晓晴;俞卉;王越;齐伟明
【作者单位】浙江省医疗器械审评中心审评二科
【正文语种】中文
【中图分类】R318.6;TH789
【相关文献】
1.卵子玻璃化冷冻保存生育力的研究进展
2.卵子冷冻在女性生育力保存中的作用研究进展
3.封闭式载杆玻璃化冷冻和程序化冷冻的临床效果比较
4.比较四种冷冻载体在水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中的效果
5.胚胎载杆玻璃化冷冻复苏移植术的护理体会
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１ ８・
中国奶牛 －０６年第 １ 期 ２０ １
牛卵母细胞的玻璃化冷冻研究
霍飞 海丽且木 ， ， 一 陈静波 ， 一 杨焰 肖海霞 王玉红 ， ，
（． １ 新疆农业大学动物科学学院， 乌鲁木齐 ８０ ５ ；． ３０ ２ ２ 新疆天康 畜牧生物技术股份有 限公司， 乌鲁木齐 ８ ００ ； ３０ ０ ３新疆畜牧科学院， ． 乌鲁木齐 ８０ ０ ） ３ ００
轻拉至长度为约 ３ ｃ ０ｍ时， 保持拉力数秒以待细管回冷变 硬， 最后从中问用锋利的刀片切断， 将细管的头部切除， 得
到了两根细管。制作好的细管用 ７％ ５ 的酒精浸泡过夜消毒， 自 然千 寺 直径约 ０ ｒ ）玻璃 Ｏ Ｓ 佣（ ．ｍ。 ８ ａ Ｐ 管管径为 ０ ｍ 。 ． ｍ ３
１２ 方 法 ．
１８ 年 Ｒ ｌ和 Ｆｈ 玻璃化 冷冻保存法的发明［不但 ９５ ａ ｌ ａｙ ６ ３ ， 大大地将操作时间缩短到了 ３ｍ ｎ 内， ０ ｉ之 而且方法简易， 设备简单， 容易在生产中推广使用， 并且为卵母细胞的冷 冻保存提供了有效手段， 日益受到人们的重视， 已 因而 并
解冻液
： ０ ５ ｏＬ的蔗糖溶液； ＷＭ 为 ． ｍ ｌ ２ ／ ＷＭ 为
细胞 的一端直接浸入 ＷＭ 中平衡 １ ｉ。 ｍｎ 然后用捡胚针 将卵母细胞移人 ＷＭ 中平衡 ５ ｉ。 ｍｎ 再用成熟培养液洗 ３ ， 遍 然后移人体外受精液中准备进行体外受精。 １ 统计分 析 ． ３
收稿 日期 ：０６ ０— ８ ２０ — ６ ２
维普资讯
１１１ 卵母细胞 ．．
将屠宰场获得的牛卵巢置于 ３ 。 ５Ｃ的取卵巢液 中， 在３ ｈ内带 回实验室 。 用取卵巢液冲洗卵巢 ３ 遍后用一 次性 ｌｍ 注射器采用负压抽取法从卵巢表面 ２ ８ ｍ ＯＬ ｍ 的卵泡 中抽取卵泡液， 注入灭菌捡卵皿中。 在体视镜下 捡出 ｌ 层颗粒细胞 以上 、 透明带完整 、 胞质均匀的卵母 细胞 。将卵母细胞在成熟培养液中洗 ３ 遍后放人培养
中 图分类 号 ：８ ３２ ．＋ 文献标 识码 ： 文 章编号 ：０ ４ ４ ６ （０ ６ ｌ － ０ ８ ０ ￥ ２ ．１ ４ ３ Ａ １０ — ２ ４ ２ ０ ） １ ０ １ — ２
摘要： 本试验通过牛 卵母 细胞玻璃化冷冻过程 中采用载体 、 冷冻时卵母 细胞所带颗粒细胞层数和其成熟培养时间 这 ３个方面对牛卵母细胞的玻璃化冷冻进行 了 探讨。（ ） 同载体的对 比： １不 玻璃 Ｏ Ｓ管和塑料 Ｏ Ｓ Ｐ Ｐ 管冷冻效果较
好。 玻璃 Ｏ Ｓ管冷冻卵母细胞 ， Ｐ 解冻后形态正常率、 体外受精后 卵裂率和囊胚率分别为 ９． ４ ． １ ％、１ ％和 １． ％。 ２ ３ ４２ 塑 ５ 料ＯＳ Ｐ 管冷冻卵母细胞 ， 解冻后形 态正常率 、 体外受精后 卵裂率和囊胚率分别为 ８． ％、０ ０ ９ ９ ４ ． ％和 １． ％。（ ） ０ ９ ４４ ５ ２保 留 ２３ 层颗粒细胞的卵母细胞玻璃化冷冻的冷冻效果较好 ， 其冷冻解冻后 形态正常率 、 体外受精后 卵裂率和囊胚 率分别为 ９ ． ％、０１％ １． ％。（ ） ０ ９ ４． 和 ５１ ７ ３ ３ ３ 体外成熟培养 ２ ｈ的卵母细胞冷冻效果较好 ， ２ 其冷冻解冻后形态正常率 、
中 国奶 牛 ・ Ｏ 年 第 ｌ 期 ２ ６ Ｏ ｌ
・ ９・ １
通过冷冻 、 解冻后继续培养 １～ ０ ， ８ ２ ｈ记录形态正常
体 外 受精 后 卵裂率 和 囊胚 率 分别 为 ９ ． ％、 １ ０ ４１ ４ ． ％和 ｌ．３ ４ ８ ５２％。
关键词 ： ； 牛 卵母细胞 ； 玻璃化冷冻 ； 颗粒细胞 卵母 细胞冷冻保存 的研究 自Ｗｈ ｔ ｇａ ｔ ｉ ｎｈｍ￣ ｔ ｉ 首次利 箱中进行体外成熟培养。 １ ． 基础液及解冻液的制备 ．２ １ 基础液 ：基础操作液为含 ３ ｇ Ｌ Ｓ ｍ ／ Ｂ Ａ的 Ｄ Ｐ Ｓ ｍ — Ｂ＋ ３０ ｇ ０ｍ ／ Ｌ聚蔗糖 （ｉ ｌ ＋ ． ｏ Ｌ蔗糖。 Ｆｃ １ ０ ｍ ｌ ｏ） ５ ／ 玻璃化液 （ ｓ ：Ｓ 为 １％乙二醇（ Ｇ）ｌ％二 甲 ｖ ）Ｖ ０ Ｅ ＋０
基 亚 砜 （ ＭＳ ＋ 础 液 ； Ｓ 为 １％乙二醇 （ Ｇ） １％ Ｄ Ｏ）基 Ｖ２ ５ Ｅ ＋５
二 甲基 亚砜 （ ＭＳ ＋ Ｄ Ｏ） 基础 液 。
用慢速冷冻法成功地保存小 鼠卵母细胞并 获得产仔 以 来， 迄今人们已在这方面做 了大量 的工作， 但是卵母 细 胞冷 冻保存的研究 远远 不及胚 胎 冷冻保存 的水 平 。
取得很大进展。 研究者对人及家畜的卵母细胞冷冻保存 进行了探索， 已获得来 自 冷冻解冻的人卵母细胞婴儿 。 谭世俭（０２ 闭 ２０ ）采用 Ｏ Ｓ Ｐ 法对牛卵母细胞和体外胚胎 冷冻保存 ， 取得了较好 的结果。目前的玻璃化冷冻法主 要使用 Ｏ Ｓ 、 Ｐ 管 电镜铜网、 冷冻金属环法、 冷冻微粒 箔一
作为承载工具 ， 以达到超快速降温的目的 ０】 ，。 １ １ １ 材料 与 方法
ｌｌ 材料 ＿
０１ｍ ｌ ． ｏ Ｌ的蔗糖溶液 。 ５ ／ １ ． 开放式细管的制作 ．３ １ 制作开放式 （ｐｎ ｕｌ ｒ ， Ｐ ）细管的材料为 ｏｅ ｌ ｄ ｔ ｗ Ｏ Ｓ ｐ ｅ ｓａ ０５ Ｌ ． ｍ 的塑料细管。 ２ 用加热装置对细管进行均匀加热， 两手
１ ． 冷冻方法 ： ．１ ２ 试验在 ３℃恒温台上操作。用捡胚针 ７ 将 卵母 细胞移人 Ｖ 中平衡 ３ｓ Ｓ液 ０ 后移人 Ｖ Ｓ 液中平
衡 ３ｓ ０。利用虹吸原理将卵母细胞吸人 Ｏ Ｓ 中， Ｐ管 直接
投入液氮冷冻保存 。 １ ． 解冻方法 ： Ｐ 管由液ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ中取出后 ，将含有卵母 ．２ ２ ＯＳ