壳聚糖水凝胶作为药物载体在药物控释方面应用的研究

壳聚糖水凝胶作为药物载体在药物控释方面应用的研究
1.立项依据
在自然界中，多糖分布极为广泛，它是一种天然的聚合物，具有独特的结构和特殊的特性，多糖物质在人们的生活的各个方面发挥着重要的作用。

甲壳素（chitin)是一种碱性多糖，也是地球上第二大天然再生资源（纤维素的含量第一），其分布广泛，存在于甲壳动物（如虾、蟹等的外壳）、藻类等低等植物及微生物（菌类的细胞壁）中。

甲壳素的C-2位的羟基被乙酰基取代，同植物纤维素的结构相似，它在地球上的含量极为丰富，每年自然界的生成量可多达1000亿吨。

甲壳素呈无定形的白色或淡黄色固体粉末，按其来源不同，分为α和β两种构型，其分子链以螺旋形式平行排列，分子中有大量的乙酰基和羟基，分子内氢键作用较强，具有十分紧密的晶体结构，不溶于烯酸、碱、水和一般的有机溶剂，只能溶解于强酸以及少数有机溶剂中。

甲壳素为N-乙酰-D-葡萄糖胺的聚糖，其结构式为：
由于其良好的生物相容性、低毒性，对酶的敏感性，在用作制备水凝胶材料方面，引起人们广泛的兴趣。

在这些高分子中，多糖还具有其独特的优点，如无免疫原性，无传播动物源病菌的潜在危险性等。

其中的一个多糖就是壳聚糖。

壳聚糖（chitosan)是由2-乙酰氨基葡萄糖和2-氨基葡萄糖和通过β-1,4糖苷键连接而成，结构与纤维素类似，其化学结构式为：
甲壳素在强碱性环境下，可通过脱乙酰而得到壳聚糖，壳聚糖是甲壳素最为重要的衍生物。

壳聚糖具有其他天然高分子材料的优点，又不会引发免疫反应。

壳聚糖（CS）不同于其他多糖，其分子结构中存在氨基，可被质子化，能形成聚电解质络合物。

壳聚糖是一种无毒、可生物降解、具有良好的生物相容性及良好的生物粘附性的天然高分子材料，在生物医药，环境工程以及生物技术领域都有广泛的应用，使之成为药物控制释放领域中的理想载体。

将壳聚糖羧甲基化，可制备得到水溶性很好的羧甲基壳聚糖(CMCS)，一方面羧基的引入极大提高了壳聚糖在水中的溶解性，另一方面，羧甲基壳聚糖分子中既含有氨基又含有羧基，是一种两性高分子聚合物，应用比壳聚糖更加广泛。

甲醛、戊二醛、马来酸酐、钙离子等常用来作为制备壳聚糖系水凝胶的交联剂。

但甲醛、戊二醛等的毒性较大，这影响了水凝胶在生物医药领域中的应用。

而经钙离子交联得到的水凝胶机械性能较差，而且容易与体内的阳离子(如钠离子等)发生离子交换，使水凝胶迅速崩解，从而使凝胶中负载的药物快速释放，影响药物的缓释效果。

1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)是一种无毒的肽键缩合剂，本身并没有成为交联的一部分，常作为氨基和羧基的交联。

为了避免有毒的交联剂的使用，拓宽羧甲基壳聚糖在生物医药领域的应用，所以本研究以水溶性好的羧甲基壳聚糖(CMCS)为原料，以EDC为交联剂，制备得到新型的EDC/羧甲基壳聚水凝胶。

水凝胶是由带有亲水性基团(—COOH、—OH、—CONH2)的水溶性单体通过聚合反应并以物理或化学交联的方式所形成的具有三维网络结构的高分子聚合物。

水凝胶能显著地溶胀与水中或者生物体液中溶胀并能保持大量水分而不被溶解。

近年来，智能水凝胶引起了科研者的大量关注，因为智能水凝胶能够感知周围环境如温度、磁场、电场、pH、离子强度等刺激的微小变化并对环境刺激产生响应特性。

水凝胶的响应性能是通过凝胶的可逆体积相变来实现的，并使它在传感器、人造肌肉、药物控制释放、组织工程、催化体系、酶的固定等方面具有广阔的应用前景。

由于传统的给药方式有口服和注射等，使治疗药物的毒性不仅存在于肿瘤部位，而且会散布于身体的各个部位，对正常身体部位产生一定程度的损伤。

同时由于药物浓度在体内广泛分布，到达肿瘤部位的药物浓度就会变小，可能导致其
低于药物的治疗浓度，以致使它达不到应有的效果。

温敏性载药水凝胶可以对药物的释放起到一定的缓释作用，使药物释放变得缓慢；也可以根据病变部位与正常组织不同而识别病变器官，从而有选择性地进攻，使药物浓度更有效地分布，增强药物治疗效果，同时达到原位控制治疗，减小药物的毒副作用，因此，制备能够负载药物并具有药物缓释性能的药物载体，在临床医学和制药学中是非常需要的。

智能水凝胶由于其能够在相对苛刻的条件下，保护药物并将药物在原位缓慢释放药物而倍受青睐。

2.项目研究的内容和方案
由于壳聚糖具有良好的生物活性和生物相容性等优良特点，因此被广泛的应用于生物医药等领域。

然而壳聚糖的亲水性较差，仅能溶解在酸性介质溶液中，不溶于水，不溶于中性和碱性的环境中，限制了其子在生物领域和生物大分子药物传输递送上的应用。

由于壳聚糖分子具有丰富的活性羟基和氨基基团，通过化学方法，对其分子进行修饰，制备壳聚糖衍生物，这不仅提高了壳聚糖的溶解性，同时新引入的取代基团也增加了壳聚糖新的活性特点和性能。

通过羧基化反应对壳聚糖结构进行改性：由于壳聚糖上的羟基或氨基可与氯代烷酸（氯乙酸）、乙醛酸等反应，将极性的羧酸基团引入分子链上。

羧甲基壳聚糖的制备原理图如下（1）：
图（1）
其中羧甲甲基化研究比较广泛，由于羧基基团和壳聚糖反应位置的不同，在反应中，可以生成量子羧甲基壳聚糖，分为：O-羧甲基壳聚糖(O-CM-Chitosan)、N-羧甲基壳聚糖(N-CM-Chitosan)和N,O-羧甲基壳聚糖(N,O-CM-Chitosan)。

通过查阅文献发现Ha-Na NaS等首先将壳聚糖用亚硝酸钠(NaN02)和硼氢化钠(NaBH4）降解得到到低分子量的壳聚糖(LMCS)；然后将低分子量的壳聚糖用60％的氢氧化钠碱化处理后，和氯乙酸反应制备得到了低分子量的羧甲基壳聚糖(LM-O-CMCS)，其具有很好的水溶性和低的细胞毒性。

根据Qingping Song在90℃
的条件下，用氯乙酸代替相对昂贵的乙醛酸，和壳聚糖反应4h，制备得到了N-羧甲基壳聚糖(N-CM-Chitosan),同时取代度高达1.32以上。

本文以EDC为交联剂，活化羧甲基壳聚糖为单体，加入引发剂过二硫酸铵，使壳聚糖上的羧基和自身的氨基发生交联反应制备得到EDC/羧甲基壳聚糖水凝胶，水凝胶交联原理图如下（2）。

通过傅立叶红外光谱、X衍射和扫描电镜对EDC/羧甲基壳聚糖水凝胶结构进行了表征。

通过单因素实验测定了交联剂和壳聚糖衍生物溶液浓度对凝胶时间的影响以及测定相应的溶胀度，系统研究了EDC/羧甲基壳聚糖水。

图（2）
实验中采用制备的羧甲基壳聚糖水凝胶包裹顺铂药物，测试了其水凝胶在不同pH条件下体外释药性。

将所制备的羧甲基壳聚糖水凝胶放置在不同pH环境下(pH=2盐酸溶液和pH=7.4磷酸盐缓冲溶液)，观察其溶胀率，可以看出所制备的羧甲基壳聚糖水凝胶具有良好的pH敏感性。

同时将载药干凝胶置于pH=7.4
的磷酸盐缓冲液中研究释药动力学，同时对水凝胶的药物释放过程进行模拟，由于水凝胶的释药过程大致可分为内扩散和外扩散两个主要步骤，即药物从水凝胶的内部扩散到水凝胶的表面，再从水凝胶的表面扩散到接受液中。

关于水凝胶的释药过程尚无合适的理论机制去描述，而是用一些经验方程来拟合。

常用的有零级、一级动力学方程、Higuchi 方程、Peppas半经验方程、Ritger-Peppas经验方程等。

本研究根据所得实验数据规律，对一级动力学模型进行适当修正后来对羧甲基壳聚糖水凝胶的释放药物过程的描述。

3.项目目标
（1）通过化学修饰，改善壳聚糖的结构，制备具有良好亲水性的羧甲基壳
聚糖；
（2）通过聚合反应，制备新型EDC/羧甲基壳聚糖水凝胶；
（3）通过包埋，使抗癌药物顺铂包埋在已制备的新型EDC/羧甲基壳聚糖水凝胶，同时研究其pH敏感性；
（4）制备的药物进行体外释放研究。

4.拟解决的关键问题
由于壳聚糖亲水性较差，不溶于水，仅能溶解在酸性溶液中，限制了其在生物领域和生物大分子药物传输递送上的应用。

同时壳聚糖分子含有大量的羟基和氨基，对其分子进行修饰，制备水溶性好、亲水性强的壳聚糖衍生物可有效改善这一问题。

然而壳聚糖分子在进行羧基化的过程中出现多个羧甲基壳聚糖异构体，是产率降低，同时所得的壳聚糖不够单一，给后期实验的水凝胶结构的分析带来困难。

由于羧甲基壳聚糖是壳聚糖羧基化的产物，能较为广泛pH范围内能完全溶解，然而pH的变化是通过壳聚糖中游离羧基，氨基进行控制的，通过控制羧甲基壳聚糖单体的量，研究制备的新型pH敏感性EDC/羧甲基壳聚糖水凝胶，同时对水凝胶的药物释放过程进行模拟有一定的困难，因为关于水凝胶的释药过程尚无合适的理论机制去描述，而是用一些经验方程来拟合。

常用的有零级、一级动力学方程、Higuchi 方程、Peppas半经验方程、Ritger-Peppas经验方程等。

由于研究过程中误差很大，对经验方程的确定有难度。

5.可行性分析
据文献报道，壳聚糖分子结构中存在大量的活性氨基和羟基基团，通过羧基化反应，使壳聚糖在碱性NaOH水溶液中，与氯乙酸进行羧基化反应。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖羧基化的产物，能较为广泛pH范围内能完全溶解，这是因为羧甲基壳聚糖是壳聚糖羧化得到的一种两性聚电解质，水凝胶中存在大量的羧基、氨基以及羟基基团，在不同的pH环境条件下具有不同的解离程度，从而导致所制备的水凝胶具有良好pH敏感性。

由于凝胶网络内部壳聚糖分子结构中富含氨基基团，pH减小时，氨基被质子化，静电作用和亲水作用加强，使得水凝胶更易吸水溶胀；pH增大后，壳聚糖链中游离的氨基增多，与壳聚糖链上羟基的氢键作用增强，使得壳聚糖分子链间发生卷曲缠结，导致整个水凝胶失水退溶胀。

包
埋有顺铂的pH敏感性的羧甲基壳聚糖水凝胶纳米粒子，被作为负载化学治疗药物的载体合成出来，当药物进入人体后，由于癌细胞周围的pH要比正常细胞pH 低，药物可以能有选择的在肿瘤区域中释放，通过此想法希望羧甲基壳聚糖能够被用来作为需在特定pH 环境中控释药物的载体。

6.特色与创新
本研究讨论了壳聚糖的结构改性，增加壳聚糖的水溶性，通过控制反应条件，制备产物单一的羧甲基壳聚糖。

在合成羧甲基壳聚糖水凝胶，通过加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)无毒，为了避免有毒的交联剂的使用，拓宽羧甲基壳聚糖在生物医药领域的应用。

同时羧甲基壳聚糖具有pH敏感性，可以将载有药物的水凝胶能在体内特定pH环境下进行药物的缓慢释放，从而达到原位治疗疾病的效果。

7.预期研究结果
通过羧基化反应合成改性后的壳聚糖，经过聚合作用制备羧甲基壳聚糖水凝胶，测定其水凝胶的溶胀度比为改性的壳聚糖大，同时改性后的羧甲基壳聚糖在不同pH下的药物释放率的研究，发现载有顺铂的羧甲基壳聚糖水凝胶在pH小的药物释放率高于pH大的。

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