利用大肠杆菌细胞工厂生产吲哚-3-乙酸的研究

中国生物工程杂志China Biotechnology,2021,41(1)：12-19
DOI：10.13523/j.cb.2008123利用大肠杆菌细胞工厂生产口引唏乙酸的研究
*
吴弘轩|杨金花|沈培和李清晨'黄建忠|祁峰
(1福建师范大学生命科学学院工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心福州350117)
(2福建师范大学细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室福卅350108)
摘要目的：利用重组大肠杆菌全细胞转化色氨酸生产IAA O方法：在大肠杆菌胞内构建两条全
新的IAA合成途径，即11引喙-3-乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径和色胺(tryptamine,TRP)途径。

结果：IAM途径涉及两个酶，分别是色氨酸-2-单加氧酶(IAAM)和酰胺酶(AMI1),构建好的
重组大肠杆菌TPA4以2g/L的色氨酸为底物，可以产生0.8O3g/L的IAA；敲除控制色氨酸合成副
产物碍I喙的tnaA基因后，菌株MPA-3的IAA产量达到1.43g/L,提高了78%。

第二条TRP途径
合成1AA涉及三个酶：左旋色氨酸脱竣酶(TDC),二胺氧化酶(AOC1)和"引味-3-乙醛脱氢酶
(1AD1)。

包含这条途径的重组大肠杆菌TPTA-2以2g/L的色氨酸为底物能够合成13.0mg/L的IAA O在菌株MPTA-3中，最终产生了21.Omg/L的1AA,产量增加了61.5%。

结论：首次通过IAM途径和TRP途径利用重组大肠杆菌全细胞催化生产IAA,其中IAM途径的1AA产量较高，有
较高的工业化应用前景。

关键词色氨酸"引喙-3-乙酸”引喙-3-乙酰胺中图分类号Q819
U引喙-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)又称植物生长素，是植物用以调控生长发育和生理活动的重要化学物质'0IAA可以激发并调控植物体内众多的生理反应，比如:通过刺激细胞分裂和伸长(改变细胞壁等)来促进植物器官的分化和形成；促进配子发生、幼苗生长和花发育；对干旱、盐碱、重金属及其螯合物的胁迫缓解和作出应答;维持植物的向光性、向地性和极性运输等X。

不仅如此,生长素还可以通过与其他激素的相互作用调节植物修复等其他生理活动。

从植物或其特定的内生菌株中提取获得的IAA,对植物的生长控制和人工定向培育具有很好的效果，所以IAA被广泛应用在现代农业生产中］。

然而，在植物和特定细菌中，IAA生物合成受到pH、碳限制和渗透胁迫等复杂环境的胁迫调节'，并且1AA各个合成途径基因的表达方式以及转录调节因子也会限制IAA的合成，所以植物或内生菌株中自发合成IAA的量很少。

而使用化
收稿日期:2020-08-14修回日期：2020-10-27
*国家自然科学基金(21406130)资助项目
**通讯作者，电子信箱:f.qi@(.on 色胺全细胞催化大肠杆菌
学合成1AA的方法涉及到多步反应，得率很低并且会对环境造成污染。

所以，在1AA已知合成途径的基础上，利用微生物代谢工程和合成生物学的方法，构建能够合成1AA的微生物细胞工厂，实现IAA的高效生产，具有产业化应用前景。

除了植物本身可以合成IAA,多种微生物如植物中的内生菌也可以产生IAA,如假单胞菌(Pseudomonas sp.)、固氮菌(Azotobacter sp.)、固氮螺菌(Azospirillum sp.)、农杆菌(Agrobacterium sp.)等。

在植物和细菌中，目前已知存在五种依赖色氨酸的IAA生物合成途径。

这些途径均以色氨酸为底物，分别通过色氨酸的衍生物眄際-3-乙酰胺(IAM)」引I垛-3-丙酮酸(IPA)、色胺(tryptamine),U引喙-3-乙醛月亏和阿喙-3-乙醛获得1AA|0：(图1)。

目前报道的微生物大部分通过IAM和1PA途径合成IAA1"''21,如引起增生的植物病原细菌(A.tumefaciens,P.syringae suhsp.savastaiwi和 E. herbicola)等，并且这两条合成途径已经得到了很好的验证和表征，而其他合成途径在大肠杆菌中异源表达的研究却极少报道。

本文首次通过构建阿喙-3-乙酰胺
2021,41(1)吴弘轩等:利用大肠杆菌细胞工厂生产口引嗥-3-乙酸的研究13
(IAM)途径，将来自萨氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)的iaaM基因和来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的amil基因连接到pTrc99a质粒载体上，得到质粒pTrc-iaaM-amil,并以tac启动子表达amil基因,最终得到质粒P Trc99a-IAA2o
另外本研究构建TRP途径，将来自于长春花(Catharanthus roseus)的tdc基因、黑曲霉菌(Aspergillus niger)的aocl基因和黑粉菌(Ustilago maydis)的iadl 基因共同构建在大肠杆菌表达载体pTrc99A上，同时都增加£ac启动子增强基因的表达，最终得到质粒pTrc99a-IAA4o
图1卩引喙乙酸的合成途径
Fig.1Biosynthetic pathways of indole-3-acetic acid
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株和质粒本文中大肠杆菌E.coll TOP10用于克隆质粒和全细胞催化，大肠杆菌MG1655作为生产IAA的工程菌株。

质粒P Trc99a用于载体的构建及基因的表达。

合成的基因均来自通用生物系统(安徽)有限公司，本文所用的菌株和质粒如表1所示。

1.1.2试剂和仪器Q5超保真DNA聚合酶购自NEB 公司；Gibson Assembly无缝连接酶购自NEB公司；质粒提取和胶回收试剂盒购自Omega公司；色氨酸和氨节青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他化学试剂均为国产或分析纯产品；检测仪器使用Waters e2695高效液相色谱，色谱检测器为2998PDA Detector o
1.1.3培养基和培养条件LB培养基(NaCl10g/L,蛋白腺10g/L,酵母提取粉5g/L)用于培养大肠杆菌，在37七，220r/min的摇床培养。

Tris/HCL缓冲液(pH =7.5)用于大肠杆菌的全细胞催化，底物均为2g/L的色氨酸。

质粒为氨节青霉素抗性，所有的培养基氨节青霉素终浓度100^g/mL o
1.2方法
1-2.1载体的构建
(1)IAM途径。

pTrc99a-IAAl和P Trc99a-IAA2载体的构建:采用NEB公司的Gibson Assembly无缝连接技术构建重组质粒。

用连接引物iaaM-FJaaM-R扩增出带有20bp同源片段及RBS序列的maM基因，再用连接引物V-iaaM-F、V-iaaM-R(以载体pTrc99A为模板)扩增出带有20bp同源片段的载体片段V-iaaM。

将基因片段和载体片段混合，通过Gibson Assembly技术，得到P Trc99a-iaaM质粒。

扩增出带有20bp同源片段及RBS序列的amiE基因(Pseizdomonos aeruginosa PAO1)和amil基因，通过Gibson Assembly技术，将amiE基因和amil基因分别与pTrc99a-iaaM质粒连接，得到质粒pTrc99a-iaaM-amiE和pTrc99a-iaaM-amil。

最后以pYC6a质粒为模板，用连接引物扩增出tac
启动子片
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表1菌株和质粒
Table1Strains and plasmids used in the study
Strain/Plasmid Description Reference
E.coli TOPIO F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC)<p801acZAM15AlacX74rec A l araD139A(ara-leu)7697
galU galK X-rpsL(StrR)end A l nupG Invitrogen
Invitrogen
E.coli MG1655F-X-ilvG-rfb-50rph-1Invitrogen TPA-1 E.coli TOPIO pTrc99a-iaaM-amiE This study TPA-2 E.coli TOPIO pTrc99a-iaaM-amil This study TPA-3 E.coli TOPIO pTrc99a-IAAl This study TPA4 E.coli TOPIO P Trc99a-IAA2This study MPA-1 E.coli MG1655pTrc99a-IAAl This study MPA-2 E.coli MG1655pTrc99a-IAA2This study MPA-3 E.coli MG1655AtnaA pTrc99a-IAA2This study TPTA-1 E.coli TOPIO P Trc99a-IAA3This study TPTA-2 E.coli TOPIO pTrc99a-IAA4This study MPTA-1 E.coli MG1655pTrc99a-IAA3This study MPTA-2 E.coli MG1655P Trc99a-IAA4This study MPTA-3 E.coli MG1655AtnaA pTrc99a-IAA4This study pTrc99a Ptrc promoter,AmpR Invitrogen pTrc99a-IAAl pTrc99a-iaaM-tac-amiE This study pTrc99a-IAA2pTrc99a-iaaM-tac-amil This study P Trc99a-IAA3pTrc99a-tdc(cs)-tac-aoc1-tac-iad1This study pTrc99a-IAA4pTrc99a-tdc(cr)-iac-aocl-tac-iad1This study
段,连接在amiE基因和基因之前,最终得到质粒pTrc99a-iaaM-Zac-amiE(pTrc99a-IAAl)和pTrc99a-iaaM-tac-amil(pTrc99a-IAA2)。

(2)TRP途径。

pTrc99a-IAA3和pTrc99a-IAA4载体的构建：用连接引物tdC-F、tdC-R扩增出带有20bp 同源片段及RBS序列的tdc(Ceriporiopsis subvermispora)基因，再用连接引物V-tdC-F、V-tdC-R(以载体P Trc99A 为模板)扩增出带有20bp同源片段的骨架片段V-tdc (cs)。

将基因与骨架片段混合，加入连接酶，得到质粒pTrc99a-tdc(cs)。

扩增出带有20bp同源片段及RBS 序列的aocl基因片段，通过Gibson Assembly与质粒pTrc99a-tdc(cs)连接，得到质粒pTrc99a-tdc(cs)-aoc1。

扩增出基因片段,与质粒pTrc99a-tdc(cs)-aocl连接后得到质粒pTrc99a-tdc(cs)-aocl-iadl。

以pYC6a质粒为模板，用对应的连接引物扩增得到tac启动子序列，将tac启动子片段与骨架混合，加入连接酶，最终将tac启动子插入到基因aocl和iadl之前，得到质粒pTrc99a-IAA3。

以tdc(Catharanthus roseus)基因为模板,扩增出皿(cr)基因片段，通过Gibson Assembly技术,将质粒pTrc99a-IAA3质粒的tdc(cs)基因替换为tdc (cr)基因,最终得到质粒pTrc99a-IAA4o所有的引物见表2。

1.2.2构建工程菌株及全细胞催化
(1)1程菌株的构建。

将基因片段与骨架片段混合后，加入6(jl L的Gibson Assembly连接酶(总共IO ji L),在50七金属浴反应lh。

将连接产物全部加入到TOP10感受态细胞中，轻微吹打混匀，冰浴30min o 在42七水浴锅中热击90s，置于冰上冰浴2min后，加入700|xL的LB,在371,150r/min的恒温振荡器中复苏lh0最后将菌液均匀的涂抹在含有氨节青霉素的LB 平板上，在37咒培养箱培养12~15h。

挑取长出的单菌落做PCR验证和测序验证质粒序列。

(2)全细胞催化。

将质粒pTrc99a-IAAl、pTrc99a-IAA2、pTrc99a-IAA3和pTrc99a-IAA4转化到大肠杆菌
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表2引物序列
Table2Primers used in the study
Primers iaaM-F
iaaM-R
V-iaaM-F
V-iaaM-R amiE-F
amiE-R
V-amiE-F
V-amiE-R amil-F
amil-R
V-amil-F
V-amil-R
tac-amiE-F tac-amiE-R
V-tac-amiE-F V-tac-amiE-R tac-amil-F tac-amil-R
V-tac-amil-F V-tac-amil-R tdC-F
tdC-R
V-tdC-F
V-tdC-R
aocl-F
aocl-R
V-aocl-F
V-aocl-R
iadl-F
iadl-R
V-iadl-F
V-iadl-R
tac-aocl-F tac-aocl-R
V-tac-aocl-F V-tac-aocl-R tac-iadl-F
tac-iadl-R
V-tac-iadl-F V-tac-iadl-R
Sequence(5Z-3Z) ggaaacagaccatggaattcaaggagatgtacgatcatttcaaca gatccccgggtaccgagctcttaataacgataacttgcat atgcaagttatcgttattaagagctcggtacccgg aaatgatcgtacatctccttgaattccatggtctgtttcctgt aaggatcctctagagtcgacaaggagatgcgtcacggcgatatttc ccgccaaaacagccaagcttttatcaggcctccttctccagtc tggagaaggaggcctgataaaagcttggctgttttggcgg gaaatatcgccgtgacgcatctccttgtcgactctagaggatcctt aaggatcctctagagtcgacaaggagatggcaaccaataatgattt ccgccaaaacagccaagcttttaaatgaatgctgccaga gtctggcagcattcatttaaaagcttggctgttttggc ttattggttgccatctccttgtcgactctagaggatcctt aaggatcctctagagtcgaccacagctaacaccacgtcgt tcgccgtgacgcatctccttggttaattcctcctgttacg cgtaacaggaggaattaaccaaggagatgcgtcacggcga acgacgtggtgttagctgtggtcgactctagaggatcctt aaggatcctctagagtcgaccacagctaacaccacgt ttattggttgccatctccttggttaattcctcctgttacg cgtaacaggaggaattaaccaaggagatggcaaccaataa acgacgtggtgttagctgtggtcgactctagaggatcctt gatccgaagcagcggcaaaaaggaggatggatatcgaagcatttcg ttgcatgcctgcaggtcgacttactgcacgtctttactaa ttagtaaagacgtgcagtaagtcgacctgcaggcatgcaa gcttcgatatccatcctcctttttgccgctgcttcggatc acctgcaggcatgcaagcttaaggagatgctgccgcatccg tctcatccgccaaaacagccttaaatatgggcattacgac gtcgtaatgcccatatttaaggctgttttggcggatgaga ggatgcggcagcatctccttaagcttgcatgcctgcaggt ccatatttaaggctgttttgaaggagatgccgaccctgaatctg gaaaatcttctctcatccgcttaaatcggtgccggct gccagccggcaccgatttaagcggatgagagaagatttt ttcagggtcggcatctccttcaaaacagccttaaatatgg acctgcaggcatgcaagcttcacagctaacaccacgt ggatgcggcagcatctccttggttaattcctcctgttacg cgtaacaggaggaattaaccaaggagatgctgccgcatcc acgacgtggtgttagctgtgaagcttgcatgcctgcaggt ccatatttaaggctgttttgcacagctaacaccacgtcgt ttcagggtcggcatctccttggttaattcctcctgttacg cgtaacaggaggaattaaccaaggagatgccgaccctgaa acgacgtggtgttagctgtgcaaaacagccttaaatatgg
tdc-F gatccgaagcagcggcaaaaaggaggatgggcagcattgatagtac tdc-R ttgcatgcctgcaggtcgacttatgcttctttcagcagat
V-tdc-F atctgctgaaagaagcataagtcgacctgcaggcatgcaa
V-tdc-R tcaatgctgcccatcctcctttttgccgctgcttcggatc
Y-F ataatgttttttgcgccgac
Y-R atctgtatcaggctgaaaat 感受态细胞中，用接种环沾取适量菌液,在含有氨节青霉素的LB平板上画线,37咒培养12~15h。

挑取合适大小的单菌落接入含有氨节青霉素的液体LB中，在37r,220r/min摇床培养12h。

取适量菌液接入含有50mL LB的250mL三角瓶中，加入氨节青霉素，371, 220r/min摇床培养。

当OD丽=0.5~0.6时，加入IPTG（异丙基-0-D-硫代半乳糖甘），终浓度为0.5mmol/L o 然后放至30X：,220r/min的恒温振荡器培养15~20h o 收集菌体，用50mL的缓冲液（Tris/HCL,pH=7.5）重悬细胞，加入色氨酸，在30t,220r/min摇床反应，间隔12h取样检测IAA产量。

1.2.3HPLC检测使用的测量仪器为Waters e2695型高效液相色谱，检测器为2998PDA Detector。

使用RD-C18,5jjLm,4.6mmx250mm的色谱柱进行分离检测样品。

所使用的流动相为水（0.1%甲酸）（%A）和甲醇（％D）。

流速lmiymin,柱温40t,进样量10p.L,检测波长270nm,运行时间23min,使用梯度洗脱的方法分离检测样品。

2结果与分析
2.1通过IAM途径全细胞催化生产IAA
分别将MPA-1、MPA-2和MPA-3菌株进行全细胞催化，在30T,220r/min的恒温振荡器培养，每隔12h 取ImL菌液，将菌液在8000g离心5min。

吸取上清，用的滤头过滤。

用高效液相色谱仪（HPLC）检测IAA产量。

如图2b所示，菌株MPA-1的底物色氨酸在6h就消耗殆尽，只产生了中间产物阿喙-3-乙酰胺（IAM）,且IAM浓度维持在1.7g/L左右，没有终产物IAA。

而在菌株MPA-2中（图2c）,色氨酸逐渐被消耗殆尽。

IAM随着时间先增加后减少，这是由于底物初始量不足和转化成IAA,最终产生了0.939g/L的IAA。

将P Trc99a-IAA2转化到敲除tnaA基因的MG1655大肠杆菌中，得到菌株MPA-3（图2d）。

在优化全细胞转化条件，pH=7.5时，该菌株的IAA产量最高。

色氨酸在12h消耗殆尽,IAM逐渐增加，在12h后开始减少，IAA 逐渐增加，在48h时产量最高达到1.430g/L。

IAM途径中，色氨酸先被色氨酸-2-单加氧酶转化成IAM,随后在酰胺酶的作用下生成IAA。

Chakraborty 等g以TOP10作为表达菌种，产生了10.68mg/L的香草醛。

为了获得更好的生产IAA的菌种，本研究同时利用MG1655和TOP10作为细胞工厂生产IAA。

先将菌株TPA-1和TPA-2进行全细胞催化，两株菌都积累
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中国生物工程杂志China Biotechnology Vol. 41 No. 1 2021
了大量的中间产物IAM,这与Tsavkelova 等Z 描述的 一致,iaaM 基因可以将色氨酸转化成大量的IAM 。

根
据报道,Andrade 等和Neu 等皿证明amiE 基因和
基因表达的酶可以水解酰胺类物质。

然而只有
TPA-2产生了极少量的IAA(0.015g/L)，可能是酰胺酶
基因表达较弱。

为了增强酰胺酶基因的表达，在armE 基因和amil 基因前增加tac 启动子后，得到质粒
pTrc99a-IAAl 和 pTrc99a-IAA2，再将菌株 TPA-3 和 TPA4进行全细胞催化。

在同时增强酰胺酶基因的表
达后，菌株TPA-3仍然无IAA 生成,而菌株TPA4产生 了 0. 803g/L 的IAA,说明amiE 基因不能够使IAM 转 化成1AA,而am 〃基因可以将IAM 转化成IAA 。

可能
是amiE 基因表达的酰胺酶与IAM 的亲和力较低而无
法起作用。

同时显75了 "c 启动子不能强化am"基因 的表达，而Me 启动子却能够显著增强基因的表
达,最终使IAA 产量达到了 0. 803g/L,与TPA-2相比提
高了 53.5倍。

用大肠杆菌MG1655作为工程菌株进行 全细胞催化时,MPA -2可以产生0.939g/L 的IAA,产量 比菌株TPA4提高了 16. 9%。

为了进一步提高IAA 的 产量，敲除了大肠杆菌MG1655中控制色氨酸合成阿嗥 的加必基因”〕，同时优化转化条件,IAA 的产量达到
T 1.430g/L,比菌株TPA4提高了 78%。

然而在48h
后IAA 浓度下降，可能是底物不足,导致无IAA 生成, 并且IAA 开始分解。

最终以大肠杆菌M1655作为生产
IAA 的细胞工厂。

s /s )u o
>
2
Indole —3—acetic acid
L —T r yptop h an Indole-3-acetamide ,18
3b
24
—■— Tryptophan -•—IAM
TAA
(
-J
/3)u.
2«h u 30u o o
6
6
12 18 24—30 36 42 48
0.0
54 60
Time(h)(c)
2.0-
s/s)u.
a l e h U Q O U O o
Time(h)
(b)
0.0.
6 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
Time(h)
(d)
图2通过阿喙乙酰胺途径生成IAA
Fig. 2 Biosynthesis of IAA via indole -3-acetamide pathway
(a) Schematic presentation of the indole-3-acetamide pathway constructed in the recombinant strain E. coli MG1655 to synthesize IAA ( b ) The consumption of tryptophan and production of IAM and IAA in the strain MPA-1 ( c) The consumption of tryptophan and production of IAM and IAA in the strain MPA-2 ( d) The consumption of tryptophan and production of IAM and IAA in the strain MPA-3
2.2通过TRP 途径全细胞催化生产IAA
220r/min 的摇床培养，每隔12h 取样，将菌液在8 000g 离
将TPTA-1和TPTA-2菌株进行全细胞催化，在30T ,
心5min 。

吸取上清，用0. 22pn 的滤头过滤。

用高效
2021,41(1)吴弘轩等：利用大肠杆菌细胞工厂生产阿嗥-3-乙酸的研究17
液相色谱仪(HPLC)检测IAA产量。

菌株TPTA-1的底物色氨酸无消耗，且无色胺及产物IAA的生成。

将TPTA-2,MPTA-2和MPTA-3进行全细胞催化，用HPLC 检测IAA产量。

如图3c所示，12h时，均产生少量的IAA,随着催化时间的增加IAA的积累也逐渐增加，在60h时，TPTA-2,MPTA-2和MPTA-3分别产生了13.Omg/L、16.5mg/L和21.Omg/L的IAA。

TRP途径先将色氨酸脱竣成色胺，色胺在二胺氧化酶的作用下生成n引喙-3-乙醛。

阿喙-3-乙醛在细胞内容易被细胞内的多种还原酶还原成色醇，所以需要引入阿唏-3-乙醛脱氢酶将U引喙-3-乙醛氧化生成IAA i,810首先选择来自Ceriporiopsis subvermispora和长春花的两种色氨酸脱竣酶'，9'201o将含有质粒P Trc99a-IAA3和P Trc99a-IAA4的菌株TPTA-1和TPTA-2进行全细胞催化。

检测结果TPTA-1的底物色氨酸无消耗，也无TRP 和IAA的生成,TPTA-2有IAA生成。

说明在大肠杆菌
030-
H H H H25
L-Tryptophan Tryptamine Indole-3-acelaldehyde Indole-S-acetic acirl 中，来自Ceriporiopsis subvermispora的tdc(cs)基因无法将色氨酸转化为TRP,而来自长春花的tdc(cr)基因可以将色氨酸转化成TRP,并通过TRP途径最终产生IAA。

来自长春花的脱按酶可以将色氨酸转化成大量的色胺，并且来自黑粉菌的阿唏-3-乙醛脱氢酶可以高效地将阿喙-3-乙醛转化成IAA12'1。

然而在tac启动子地调控下IAA产量仍然不高，这可能是因为二胺氧化酶的转化效率太低，不能生成足够的眄I喙-3-乙醛，导致IAA的产量很低。

再将P Trc99a-IAA4质粒分别转化到MG1655和敲除tnaA基因的MG1655中，得到重组菌株MPTA-2和MPTA-3后再分别进行全细胞催化。

在12h 菌株MPTA-2和MPTA-3产生的IAA与TPTA-2无显著性差异。

随着时间增加,MPTA-2和MPTA-3逐渐表现岀了优势，在60h时，生成的IAA分别比TPTA-2增加726.9%和61.5%，结果说明对TRP途径细胞工厂的选择，MG1655仍然优于TOP10o
TPTA-2
MPTA-2
MPTA-3
20
5
o
Pirc Ptac Ptac
5・
0・
01236486072
Timefh)
(c)
图3通过TRP途径生成IAA
Fig.3Biosynthesis of IAA via tryptamine pathway
(a)(b)Schematic presentation of the tryptamine pathway constructed in the recombinant strain E.coli MG1655to synthesize IAA(c)The production of IAA in the TPTA-2,MPTA-2and MPTA-3strains
3讨论
IAA是一种重要的植物生长素，用以调控植物的生长发育，然而植物和特定细菌的IAA生物合成量很低，利用构建微生物细胞工厂合成IAA,能够实现大量生产IAA的目标，具有较好的产业化前景。

在植物和微生物中已知有五条依赖色氨酸的IAA合成途径，即分别通过IPA JAM、TRP、0引喙-3-乙醛厉和n引喙-3-乙醛生成IAA。

目前在微生物中，只有IPA途径和IAM途径比较明确且已有报道，Romasi等归：利用大肠杆菌通过异源表达IPA途径合成IAA,在大肠杆菌中共表达两个包含有IPA途径关键基因的质粒，在含有2g/I.色氨酸的LB 培养基中最终产生了 1.8g/L的IAA。

迄今为止，在大肠杆菌中利用其他途径合成IAA的报道极少。

Malhotra等。

和Markus等:"通过引入IAM途径，分别在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和巴西固氮
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螺菌(azospirillum brasilense)中异源表达IAA,然而产生的IAA都低于0.lg/L o本文首次报道在大肠杆菌胞内构建外源1AM途径和TRP途径，并利用全细胞催化的方法使重组大肠杆菌成功生产IAA。

在IAM途径中，推测酰胺酶为限速酶，通过对酰胺酶的选择活性验证，只有来自拟南芥的am"基因可以将IAM转化成IAA,并且在mc启动子的调控下，使ami/基因高效表达，从而获得高产量的IAA。

在TRP途径中，首先对左旋色氨酸脱竣酶进行筛选，只有来自长春花的Me基因可以将色氨酸转化成TRP,并在二胺氧化酶和口引喙-3-乙醛脱氢酶的作用下生成IAA,然而在Me启动子的调控下，IAA产量仍然很低，推测二胺氧化酶不能高效利用和转化底物导致TRP途径受阻。

合成生物学研究中代谢途径关键酶的选择是核心研究内容,TRP途径中关键酶基因aocJ的重新筛选是更好地利用该途径生产IAA的关键。

本文以大肠杆菌作为细胞工厂外源表达IAM途径和TRP途径生产IAA的工作，为高效利用微生物细胞生产氨基酸衍生物的研究提供了新思路。

参考文献
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Study on the Production of Indole-3-acetic Acid Using E・coli Cell Factory
WU Hong-xuan1YANG Jin-hua1SHEN Pei-jie1LI Qing-chen1HUANG Jian-zhong1QI Feng1,2 (1School of Life Science,National and Local Joint Engineering Research Center of Industrial Microbial Fermentation Technology,
Fujian Normal University,Fuzhou350117,China)
(2Provincial University Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation,
College of Life Sciences,Fujian Normal University,Fuzhou350108,China)
Abstract Objective:Indole-3-acetic acid(IAA)was produced from tryptophan in the metabolically engineered£*.coli MG1655using whole-cell catalysis.Methods:Two novel IAA biosynthetic pathways,the indole-3-acetamide(IAM)pathway and the tryptamine(TRP)pathway,were constructed in E.coli MG1655. Results:The IAM pathway involves two enzymes,tryptophan-2-monooxygenase(IAAM)and amidase(AMI1). 2g/L tryptophan as a substrate was used by the constructed recombina n t E.coli strain TPA4.TP A-4can produce0.803g/L of IAA；however,in the strain MPA-3that was knocked out the gene tnaA which divert flux from tryptophan synthesis,the yield of IAA reached1.43g/L,an increase of78%compared with the control. The second TRP pathway biosynthesis of IAA involves three enzymes:L-tryptophan decarboxylase(TDC), diamine oxidase(AOC1)and indole-3-acetaldehyde dehydrogenase(IAD1).The recombinant E.coli TPTA-2 that included the TRP pathway can only synthesize13.Omg/L IAA with2g/L tryptophan as substrate.In the strain MPTA-3with disruption of tnaA gene,21.Omg/L of IAA was finally produced,and the yield increased by 61.5%.Conclusion:It is the first report to realize production of IAA using the metabolically engineered E.coli through the IAM pathway and TRP pathway via whole-cell catalysis.IAA production from the IAM pathway is relatively higher,and it probably has an industrial application prospect.
Key words Tryptophan Indole-3-acetic acid Indole-3-acetamide Tryptamine Whole cell
catalysis。