应用绿色荧光蛋白标记迟缓爱德华菌感染斑马鱼
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［10］ ［9］
200 Ω 、 250 μ F 的 条 件 下 进 预冷 15 min 。 在 21 KV 、 行电 击 转 化 。 电 击 后 迅 速 加 入 30ħ 预 热 的 SOC 培 28ħ 振 荡 培 养 1 h 。 8 000 r / min 离 心 5 养基复 苏， min ， 弃掉 800 μ L 培养基， 剩余 200 μ L 重悬， 取 100 μ L 接种于羧苄平板（ 含羧苄青霉素 50 μ g / mL ） 上， 28ħ 过夜 。 挑取单 菌 落， 接种于含羧苄青霉素的液 体培养基中 28ħ 过 夜 培 养， 阳 性 克 隆 命 名 为 E． tCD GFP 。 1. 4 1. 4. 1 GFP 标记迟缓爱德华菌的检测与筛选 PCR 鉴 定： 挑 取 单 菌 落， 用 上 游 引 物 5'5'-
GTCATGCGTGATGCAATG3' 和 下 游 引 物
CATTTATTTGTATAGTTC3' 对阳性克隆进行 PCR 扩 94ħ 45 s ， 56ħ 50 s 和 增， 反应条件为 95ħ 4 min ， 72ħ 90 s ， 30 个 循 环， 72ħ 延 伸 10 min ， 然后在 1. 0% 琼脂糖凝胶上进行电泳 。 1. 4. 2 荧光检测： 在荧光光切显微镜（ 400 ˑ ） 下， 以未 导 入 gfp 基 因 的 Et-CD 为 阴 性 对 照， 以含 pFPV25. 1 质粒的大肠杆菌为阳性对照， 用绿色荧光
［11］
图片 。 1. 4. 3 质粒稳 定 性 实 验： 参 照 李 静 等
［13］
。 质粒 pFPV251. 1
将标记好
（ 羧卞青霉素抗性） 为荧光标记质粒， 由埃尔朗根 -纽 伦 堡 大 学 Hensel 教 授 惠 赠， 详细资料见参考文 献
［12］
的细菌先在含有 羧 苄 青 霉 素 的 TSB 中 28ħ 培 养 过 然后在不 含 羧 苄 青 霉 素 的 培 养 基 中 28ħ 培 养， 夜， 接种量为 1 /1000 （ 体 积 比 ） ， 每 24 h 转 接 一 次 。 同 时涂布于含羧苄青 霉 素 的 平 板 上， 挑取单菌落于荧 光显微镜下 观 察， 记 录 荧 光 数。 质 粒 稳 定 率 = 发 绿色荧光菌落数 / 总菌落数 ˑ 100% 。 1. 5 感染动力学
（ 1． 山东农业大学动物科技学院， 泰安
271018 ； 2. 泰安市水产研究所，泰安 325000 ）
271000 ；
3. 浙江省海洋水产养殖研究所， 温州 【摘要 】 目的
建立斑马鱼模型研究迟缓爱德华 菌 的 致 病 性 及 感 染 途 径 。 方 法
应用绿色荧光蛋白标记迟
缓爱德华菌， 追踪观察其感染斑马鱼的动力学过程 及 病 理 组 织 学 变 化 。 结 果 鳃和皮肤中定植 。 结论 马鱼肠道 、
GFP 蛋白通道检测 Et-CD 中 GFP 的 表 达 情 况， 并拍摄
1
1. 1
材料与方法
菌株 、 质粒及实验用鱼 迟缓爱德华菌真鲷 分 离 株 （ E． t-CD ） 由 上 海 复
旦大学王玉 燕 博 士 惠 赠 。 将 E． t- CD 划 线 接 种 于 28ħ 培养过夜， 胰蛋白胨大豆肉汤琼脂（ TSA ） 平板， 挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （ TSB ） 28ħ 200 r / min 培养 至 A 600 nm 达 1. 0 的 对 数 生 长 中， 中期， 用 PBS 洗涤三次后备用
【Abstract 】 Objective
To establish a zebrafish model of Edwardsiella tarda infection to study the pathogenicity and The infection process and histopathology were visualized in the zebrafish infected by Histopathological observation revealed hydropic degeneration ，
第 19 卷
2011 年 10 月 第5期
中国实验动物学报 ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA
October ， 2011 Vol． 19 No． 5
檵殝
檵檵檵檵殝 研究报告 檵殝
应用绿色荧光蛋白标记迟缓爱德华菌感染斑马鱼
1 1 2 3 3 3 王雪鹏 ， 丁雷 ， 邹兰柱 ， 陈少波 ， 谢起浪 ， 闫茂仓
possible route of infection． Methods
E． tarda labelled with green fluorescent protein． Results
atrophy and necrosis of liver cells ， scattered hyperplastic nodules ， congestion ， edema and loss of lymphocytes in the spleen． The gastrointestinal tract was the first site where the pathogen was detected ，followed by gill and skin． Conclusions Zebrafish can be used as an animal model for studying the pathogenicity of E． tarda infection． The results of our study provide evidence that intestine ，gill and skin may be the main route of infection by E． tarda ． 【Key words 】 Edwardsiella tarda ； Green fluorescent protein ； Zebrafish ； Pathogenicity ； Infection
GFP 将 E． t- CD 划线接种于含羧苄青霉素的 TSA
。 实验用 3 日龄斑马鱼（ AB 系） 由扬州大学付
成 年 健 康 斑 马 鱼 （ AB 系 ） 购 自 南 京 立霞博士惠 赠， 明海水族有限公司 。 1. 2 病理学观察 根据半数 致 死 量 （ LD 50 ） 测 定 结 果 调 整 迟 缓 爱 12. 5 德华菌 E． t-CD 株 浓 度 到 5. 0 ˑ l0 CFU / mL ， μ L / 尾腹腔注射成年斑马 鱼 15 尾， 相同实验条件下 用 PBS 处 理 斑 马 鱼 5 尾 作 为 阴 性 对 照 。 人 工 感 染 后 36 h ， 观察斑马鱼的临床症状， 对发病死亡和对照 组的鱼进行剖解 。 取 内 脏 团， 按常规方法制作石蜡 切片，4% 甲醛（ PBS 稀 释 ） 溶 液 4 ħ 固 定 3 d ， 经过 各级乙醇脱水， 二甲苯透明， 石蜡包埋， 切片 （ 厚度 5 μm ） ， 每尾鱼各制备 30 张， 苏木素 -伊红 （ HE ） 染 色， 21 生 贴片， 固封 。 将 制 备 的 切 片 置 于 Olympus CX物显微 镜 下， 进 行 病 理 组 织 学 检 查， 用 MIE3. 01. 0 版软件完成图像捕获和处理 。 1. 3 迟缓爱德华菌的转化 参照李静等来自檵檵檵檵殝434
中国实验动物学报 2011 年 10 月第 19 卷第 5 期
Acta Lab Anim Sci Sin ， October ， 2011 ， Vol． 19. No． 5
的发光蛋白， 不需要外源底物或辅助因子； 作为荧光 GFP 既具有敏感的标记检测率， 又没有放 标记分子， 射性的危害， 因此可 实 现 在 体 内 实 时 检 测 标 记 菌 株 的情 况， 能很好地进行菌体跟踪研究 等
［6 8］
， 是一种重要的条
， 现已被广泛应用于遗传
。该菌在水环境中分
学、 发育生物学 、 毒物学 、 肿瘤学 、 免疫学和细胞凋亡
布广泛， 并 且 宿 主 种 类 很 多， 包 括 鱼 类、 贝 类、 两栖 类、 爬行类等多种水生动物， 以及人类和其他哺乳类
［3］ 动物， 宿主被感染后 可 引 发 败 血 、 肝脓疡 、 呼吸道
迟缓爱德华菌（ Edwardsiella tarda ，E． tarda ） 是 1962 年 由 革 兰 阴 性 、无 荚 膜 、兼 性 需 氧 杆 菌， Hoshina 首次 从 鳗 鲡 中 分 离 到 件致病性 人 畜 共 患 病 原 菌
［2］ ［1］
与其他模型生物（ 如果蝇 种公认的实 验 动 物 模 型， 和线虫） 相 比， 斑马鱼具有类似哺乳动物的天然免 疫和获得性免 疫 系 统 的研究 。 绿色荧光蛋白（ Green Fluorescent Protein ，GFP ） 能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿 GFP 是 能 在 活 细 胞 中 表 达 色荧光 。 作为报 告 基 因，
感染
［4］
［5］ 、 胃肠炎 等 疾 病 。 斑 马 鱼 （ Zebrafish ） 是 一
［基金项目］山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（ BS2011 HZ012 ） ； 中国博士后基金（ 2011490162 ） ； 浙江 省 近 岸 水 域 生 物 资 源 开 发 与 保 护重点实验室开放基金（ 2010 F30003 ） ； 浙江省科技厅创新团队建设与人才培养项目（ 2009F20009 ） 。 ［作者简介］王雪鹏（ 1980 － ） ， 男， 研究方向： 水产动物疾病学与免疫学 。 E-mail ： xpwang@ sdau． edu． cn ［通讯作者］闫茂仓 。 E-mail ： yanmaocang@ 126. com
Visualisation of zebrafish infection with GFPlabelled Edwardsiella tarda
WANG Xue-peng 1 ，DING Lei1 ，ZOU Lan-zhu 2 ，CHEN Shao-bo 2 ，XIE Qi-lang 2 ，YAN Mao-cang 2 （ 1. College of Animal Science ＆ Technology ，Shandong Agricultural University ，Tai ’ an 271018 ，China ； 2. Taian Fisheries Research Institute ，Tai'an 271000 ； 3. Zhejiang Mariculture Research Institute ，Wenzhou 325000 ）
。 Ronan
利用 GFP 成功标 记 了 弧 菌 研 究 其 感 染 斑 马 鱼
的过程 。 本研究构建了 GFP 标记 的 迟 缓 爱 德 华 菌， 以斑 马鱼为动物模型研 究 其 感 染 宿 主 的 动 态 过 程， 并对 其所诱发的临诊症 状 、 组织病理变化等方面进行了 探究， 为进一步阐述斑马鱼作为标准实验动物模型， 研究迟缓爱德华菌的致病性及感染动力学奠定了一 定的理论和实验基础 。
病 理 组 织 学 检 查 以 肝 脏 水 肿 变 性，
肝细胞萎缩 、 坏死 、 脱落， 脾脏散在增生性结节 、 充血 、 水 肿、 淋 巴 细 胞 大 量 缺 失 等 病 变 为 主； 感 染 后， 该菌先后在斑 斑马鱼可作为 研 究 迟 缓 爱 德 华 菌 致 病 性 的 动 物 模 型 。 肠 道 、 鳃和皮肤可能是 迟缓爱德华菌先后感染斑马鱼的主要途径 。 【关键词 】 迟缓爱德华菌； 绿色荧光蛋白； 斑马鱼； 致病性； 感染 【中图分类号 】Q9533 ， S94 【文献标识码 】A 【文章编号 】10054847 （ 2011 ） 05043304 Doi ： 10． 3969 / j． issn． 10054847． 2011． 05． 017
200 Ω 、 250 μ F 的 条 件 下 进 预冷 15 min 。 在 21 KV 、 行电 击 转 化 。 电 击 后 迅 速 加 入 30ħ 预 热 的 SOC 培 28ħ 振 荡 培 养 1 h 。 8 000 r / min 离 心 5 养基复 苏， min ， 弃掉 800 μ L 培养基， 剩余 200 μ L 重悬， 取 100 μ L 接种于羧苄平板（ 含羧苄青霉素 50 μ g / mL ） 上， 28ħ 过夜 。 挑取单 菌 落， 接种于含羧苄青霉素的液 体培养基中 28ħ 过 夜 培 养， 阳 性 克 隆 命 名 为 E． tCD GFP 。 1. 4 1. 4. 1 GFP 标记迟缓爱德华菌的检测与筛选 PCR 鉴 定： 挑 取 单 菌 落， 用 上 游 引 物 5'5'-
GTCATGCGTGATGCAATG3' 和 下 游 引 物
CATTTATTTGTATAGTTC3' 对阳性克隆进行 PCR 扩 94ħ 45 s ， 56ħ 50 s 和 增， 反应条件为 95ħ 4 min ， 72ħ 90 s ， 30 个 循 环， 72ħ 延 伸 10 min ， 然后在 1. 0% 琼脂糖凝胶上进行电泳 。 1. 4. 2 荧光检测： 在荧光光切显微镜（ 400 ˑ ） 下， 以未 导 入 gfp 基 因 的 Et-CD 为 阴 性 对 照， 以含 pFPV25. 1 质粒的大肠杆菌为阳性对照， 用绿色荧光
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图片 。 1. 4. 3 质粒稳 定 性 实 验： 参 照 李 静 等
［13］
。 质粒 pFPV251. 1
将标记好
（ 羧卞青霉素抗性） 为荧光标记质粒， 由埃尔朗根 -纽 伦 堡 大 学 Hensel 教 授 惠 赠， 详细资料见参考文 献
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的细菌先在含有 羧 苄 青 霉 素 的 TSB 中 28ħ 培 养 过 然后在不 含 羧 苄 青 霉 素 的 培 养 基 中 28ħ 培 养， 夜， 接种量为 1 /1000 （ 体 积 比 ） ， 每 24 h 转 接 一 次 。 同 时涂布于含羧苄青 霉 素 的 平 板 上， 挑取单菌落于荧 光显微镜下 观 察， 记 录 荧 光 数。 质 粒 稳 定 率 = 发 绿色荧光菌落数 / 总菌落数 ˑ 100% 。 1. 5 感染动力学
（ 1． 山东农业大学动物科技学院， 泰安
271018 ； 2. 泰安市水产研究所，泰安 325000 ）
271000 ；
3. 浙江省海洋水产养殖研究所， 温州 【摘要 】 目的
建立斑马鱼模型研究迟缓爱德华 菌 的 致 病 性 及 感 染 途 径 。 方 法
应用绿色荧光蛋白标记迟
缓爱德华菌， 追踪观察其感染斑马鱼的动力学过程 及 病 理 组 织 学 变 化 。 结 果 鳃和皮肤中定植 。 结论 马鱼肠道 、
GFP 蛋白通道检测 Et-CD 中 GFP 的 表 达 情 况， 并拍摄
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材料与方法
菌株 、 质粒及实验用鱼 迟缓爱德华菌真鲷 分 离 株 （ E． t-CD ） 由 上 海 复
旦大学王玉 燕 博 士 惠 赠 。 将 E． t- CD 划 线 接 种 于 28ħ 培养过夜， 胰蛋白胨大豆肉汤琼脂（ TSA ） 平板， 挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （ TSB ） 28ħ 200 r / min 培养 至 A 600 nm 达 1. 0 的 对 数 生 长 中， 中期， 用 PBS 洗涤三次后备用
【Abstract 】 Objective
To establish a zebrafish model of Edwardsiella tarda infection to study the pathogenicity and The infection process and histopathology were visualized in the zebrafish infected by Histopathological observation revealed hydropic degeneration ，
第 19 卷
2011 年 10 月 第5期
中国实验动物学报 ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA
October ， 2011 Vol． 19 No． 5
檵殝
檵檵檵檵殝 研究报告 檵殝
应用绿色荧光蛋白标记迟缓爱德华菌感染斑马鱼
1 1 2 3 3 3 王雪鹏 ， 丁雷 ， 邹兰柱 ， 陈少波 ， 谢起浪 ， 闫茂仓
possible route of infection． Methods
E． tarda labelled with green fluorescent protein． Results
atrophy and necrosis of liver cells ， scattered hyperplastic nodules ， congestion ， edema and loss of lymphocytes in the spleen． The gastrointestinal tract was the first site where the pathogen was detected ，followed by gill and skin． Conclusions Zebrafish can be used as an animal model for studying the pathogenicity of E． tarda infection． The results of our study provide evidence that intestine ，gill and skin may be the main route of infection by E． tarda ． 【Key words 】 Edwardsiella tarda ； Green fluorescent protein ； Zebrafish ； Pathogenicity ； Infection
GFP 将 E． t- CD 划线接种于含羧苄青霉素的 TSA
。 实验用 3 日龄斑马鱼（ AB 系） 由扬州大学付
成 年 健 康 斑 马 鱼 （ AB 系 ） 购 自 南 京 立霞博士惠 赠， 明海水族有限公司 。 1. 2 病理学观察 根据半数 致 死 量 （ LD 50 ） 测 定 结 果 调 整 迟 缓 爱 12. 5 德华菌 E． t-CD 株 浓 度 到 5. 0 ˑ l0 CFU / mL ， μ L / 尾腹腔注射成年斑马 鱼 15 尾， 相同实验条件下 用 PBS 处 理 斑 马 鱼 5 尾 作 为 阴 性 对 照 。 人 工 感 染 后 36 h ， 观察斑马鱼的临床症状， 对发病死亡和对照 组的鱼进行剖解 。 取 内 脏 团， 按常规方法制作石蜡 切片，4% 甲醛（ PBS 稀 释 ） 溶 液 4 ħ 固 定 3 d ， 经过 各级乙醇脱水， 二甲苯透明， 石蜡包埋， 切片 （ 厚度 5 μm ） ， 每尾鱼各制备 30 张， 苏木素 -伊红 （ HE ） 染 色， 21 生 贴片， 固封 。 将 制 备 的 切 片 置 于 Olympus CX物显微 镜 下， 进 行 病 理 组 织 学 检 查， 用 MIE3. 01. 0 版软件完成图像捕获和处理 。 1. 3 迟缓爱德华菌的转化 参照李静等来自檵檵檵檵殝434
中国实验动物学报 2011 年 10 月第 19 卷第 5 期
Acta Lab Anim Sci Sin ， October ， 2011 ， Vol． 19. No． 5
的发光蛋白， 不需要外源底物或辅助因子； 作为荧光 GFP 既具有敏感的标记检测率， 又没有放 标记分子， 射性的危害， 因此可 实 现 在 体 内 实 时 检 测 标 记 菌 株 的情 况， 能很好地进行菌体跟踪研究 等
［6 8］
， 是一种重要的条
， 现已被广泛应用于遗传
。该菌在水环境中分
学、 发育生物学 、 毒物学 、 肿瘤学 、 免疫学和细胞凋亡
布广泛， 并 且 宿 主 种 类 很 多， 包 括 鱼 类、 贝 类、 两栖 类、 爬行类等多种水生动物， 以及人类和其他哺乳类
［3］ 动物， 宿主被感染后 可 引 发 败 血 、 肝脓疡 、 呼吸道
迟缓爱德华菌（ Edwardsiella tarda ，E． tarda ） 是 1962 年 由 革 兰 阴 性 、无 荚 膜 、兼 性 需 氧 杆 菌， Hoshina 首次 从 鳗 鲡 中 分 离 到 件致病性 人 畜 共 患 病 原 菌
［2］ ［1］
与其他模型生物（ 如果蝇 种公认的实 验 动 物 模 型， 和线虫） 相 比， 斑马鱼具有类似哺乳动物的天然免 疫和获得性免 疫 系 统 的研究 。 绿色荧光蛋白（ Green Fluorescent Protein ，GFP ） 能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿 GFP 是 能 在 活 细 胞 中 表 达 色荧光 。 作为报 告 基 因，
感染
［4］
［5］ 、 胃肠炎 等 疾 病 。 斑 马 鱼 （ Zebrafish ） 是 一
［基金项目］山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（ BS2011 HZ012 ） ； 中国博士后基金（ 2011490162 ） ； 浙江 省 近 岸 水 域 生 物 资 源 开 发 与 保 护重点实验室开放基金（ 2010 F30003 ） ； 浙江省科技厅创新团队建设与人才培养项目（ 2009F20009 ） 。 ［作者简介］王雪鹏（ 1980 － ） ， 男， 研究方向： 水产动物疾病学与免疫学 。 E-mail ： xpwang@ sdau． edu． cn ［通讯作者］闫茂仓 。 E-mail ： yanmaocang@ 126. com
Visualisation of zebrafish infection with GFPlabelled Edwardsiella tarda
WANG Xue-peng 1 ，DING Lei1 ，ZOU Lan-zhu 2 ，CHEN Shao-bo 2 ，XIE Qi-lang 2 ，YAN Mao-cang 2 （ 1. College of Animal Science ＆ Technology ，Shandong Agricultural University ，Tai ’ an 271018 ，China ； 2. Taian Fisheries Research Institute ，Tai'an 271000 ； 3. Zhejiang Mariculture Research Institute ，Wenzhou 325000 ）
。 Ronan
利用 GFP 成功标 记 了 弧 菌 研 究 其 感 染 斑 马 鱼
的过程 。 本研究构建了 GFP 标记 的 迟 缓 爱 德 华 菌， 以斑 马鱼为动物模型研 究 其 感 染 宿 主 的 动 态 过 程， 并对 其所诱发的临诊症 状 、 组织病理变化等方面进行了 探究， 为进一步阐述斑马鱼作为标准实验动物模型， 研究迟缓爱德华菌的致病性及感染动力学奠定了一 定的理论和实验基础 。
病 理 组 织 学 检 查 以 肝 脏 水 肿 变 性，
肝细胞萎缩 、 坏死 、 脱落， 脾脏散在增生性结节 、 充血 、 水 肿、 淋 巴 细 胞 大 量 缺 失 等 病 变 为 主； 感 染 后， 该菌先后在斑 斑马鱼可作为 研 究 迟 缓 爱 德 华 菌 致 病 性 的 动 物 模 型 。 肠 道 、 鳃和皮肤可能是 迟缓爱德华菌先后感染斑马鱼的主要途径 。 【关键词 】 迟缓爱德华菌； 绿色荧光蛋白； 斑马鱼； 致病性； 感染 【中图分类号 】Q9533 ， S94 【文献标识码 】A 【文章编号 】10054847 （ 2011 ） 05043304 Doi ： 10． 3969 / j． issn． 10054847． 2011． 05． 017