脂溶性蟾毒配基的纯化工艺研究
蟾酥中蟾毒配基类化合物的抗肿瘤研究进展
华 蟾 毒 它 灵 （ ｉｏｕｏａｎ Ｃ Ｔ） 华 蟾 毒 精 Ｃｎｂ ｆｔｉ， Ｂ 、 ｌ （ ｉｏｕａｉ，Ｂ 、 蟾 毒 配 基 （ ｅｉｕｏｅｉ， Ｃｎｂｆｇｎ Ｃ Ｇ） 脂 Ｒ ｓ ｆｇｎｎ ｂ
Ｒ ＢＧ） 。 等 ２ 抗肿 瘤研 究
发生 的膜转位 活化可 能参 与 了 Ｂ ｌ ｃ－ ２的脱 磷 酸化 ， 但 确 切机制需 进一 步研究 Ｊ 。
凋亡 细胞 占总数 的 ９ ． ％ 。 ３６
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２ １２ 对 白血 病 Ｋ ６ ．． ５２细胞 的作 用
ｂｆｌ ｕａｎ以浓 ｉ
增殖 ， 进 细胞分化 ¨ 。 促 Ｊ ｂ ｆｌ 显 著 的 细胞 毒 性 ， 剂 量 为 １ ｇ ｕａｎ有 ｉ 在 ６
时 ， 以全部 杀灭 Ｈ －０细 胞 ； 可 Ｌ６ 此外 ， ｕａ ｎ在适 Ｂ ｆｉ ｌ
下降 ， 二者 呈显著负 相关 ， 此结果 提示 ｂｆｌ ｕａｎ可通 ｉ
过促进 抑癌基 因 ｐ １ Ｆ ２ ＷＡ １的表 达 ， 而 抑制 细胞 从
长抑 制作用 ，Ｂ Ｃ Ｇ对 Ｈ －０的 Ｉ５ Ｌ６ Ｃ ０是 １２ ｇＬ， ．５ ／ 能非 常显著地 减 少 Ｈ －０细胞 ｓ期 ＤＮ 含 量 及 Ｌ６ Ａ 增 殖 指数 ， 导癌 细胞凋亡 ，Ｂ 诱 Ｃ Ｇ对 Ｈ －０细 胞 的 Ｌ６
胞， 可使 Ｈ － Ｌ６ ０细胞被诱导分化成粒细胞样细胞 ， 也具备 吞 噬 能 力 ， 而在 形 态 学 方 面 证 明 ｂ ｆｌ 从 ｕａｎ ｉ 的 诱 导 分 化 作 用 。用 ｂ ｆｌ ｕａｎ处 理 Ｈ －０细 胞 ， ｉ Ｌ６ ｐ１ Ｆ ２ＷＡ Ｉ基 因表 达显著 升 高 ， Ｐ Ｎ 表 达 显著 而 Ｃ Ａ
（ 日 子本 草》 等， 《 华 ） 为蟾蜍科 动物 中华 大蟾蜍 （ ｕｏｂ ｆ ａ ａ ｚｎ ａ ｔ ） Ｂ ｆ ｕｏ ｇｒ ｒ ａｓＣ ｎｏ 和黑 眶蟾 蜍 （ ｕｏ ｇｉ ｒ Ｂ ｆ ｍ ｌ ｏｔ ｔｓＳ ｈｉｅ） 干燥 分 泌 物 。其 性 味甘 ｅａ ｓ ｃ ｃ ｅ ｒ 的 ｎ ｉｕ ｄ 辛 、 ， 毒， 有解毒、 痛、 窍醒神 的作用。 温 有 具 止 开
脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵不同配伍的镇痛作用比较
2014 年 1 月
山东中医药大学学报
第 38 卷第 1 期
200906）。 丙二醇（山东省化工研究院），冰乙酸（天津市富
宇精细化工有限公司）。 1.2 动物 昆明种小鼠，18～22 g（鲁抗实验动物中 心，合格证号：SCXKL2008002）。 2 方法与结果 2.1 药物溶液的配制 2.1.1 华蟾酥毒基溶液的配制：精密称取华蟾酥毒 基 4.16 mg，置于 5 mL 容量瓶中，加 20%丙二醇溶液 使溶解，加 20%丙二醇溶液至刻度，摇匀，即得。 2.1.2 脂蟾毒配基溶液的配制：精密称取脂蟾毒配 基 1.75 mg，置于 5 mL 容量瓶中，加 20%丙二醇溶液 使溶解，加 20%丙二醇溶液至刻度，摇匀，即得。 2.1.3 蟾毒灵溶液的配制：精密称取蟾毒灵 0.44 mg， 置于 5 mL 容量瓶中，加 20%丙二醇溶液使溶解，加 20%丙二醇溶液至刻度，摇匀，即得。 2.1.4 0.6%醋酸溶液的配制：取 0.6 mL 冰乙酸置于 100 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。 2.2 镇痛实验（醋酸扭体法［6］） 取昆明小鼠，雌、雄 各半，随机分组，每组 10 只，给药。 30 min 后，每只 小鼠均腹腔注射 0.6%的醋酸 0.2 mL。 记录各组小鼠 在 20 min 内的扭体次数，计算抑制率。
［收稿日期］ 2013－08－19 ［基金项目］ 十一五重大新药创制项目（编号：2009ZX09301－013）
［通信作者］ 林桂涛，教授，硕士研究生导师，主要从事中药新药
研 制 与 开 发 的 研 究 ，Tel：13606376578 ，E－mail：linguitaoli@。
酥中三种成分的含量及三者之间的组成比例差异较 大，因而影响用药的安全性和有效性［4］。 提纯三种成 分，并进行创新药物研究是保证其用药安全性和有 效性的重要手段。 探讨三者的组成比例对其作用的 影响是其成药性研究的重要内容之一［5］。 本实验研 究了三种成分配伍使用的镇痛效果，报道如下。 1 材料 1.1 药物及试剂 华 蟾 酥 毒 基 、脂 蟾 毒 配 基 （购 于 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 ， 纯 度 ≥98%； 批 号 分 别 为 110803－200605、110718－201108），蟾毒灵（购于南 昌贝塔生物科技有限公司，纯度≥98%；批号 10081－
蟾酥药理作用研究进展
蟾酥药理作用研究进展摘要：现代药理学研究表明，蟾酥具有抗肿瘤、强心、局布麻醉、镇痛等多种作用。
综述了近年来国内外学者对蟾酥药理作用的研究概况。
关键词：蟾酥；化学成分；药理作用蟾酥一词来源于《草本衍义》，属名贵中药。
根据2010版《中华人民共和国药典》记载，蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾或黑眶蟾蜍的干燥分泌物。
多于夏、秋二季捕捉蟾蜍，洗净，挤取耳后腺和皮肤腺的白色浆液，干燥，加工制得。
中医认为其性味为辛，温，有毒，归心经，具有解毒、消肿、止痛、开窍醒神之功效。
蟾酥主要具有强心、麻醉、解毒、止痛、抗菌、增强免疫及抗肿瘤等药理作用。
一、蟾酥的主要有效成分蟾酥所含成分比较复杂，通过对蟾酥的分离和鉴定，目前已确定的主要化学成分为以下几类：一是蟾蜍二烯羟酸内酯类。
该类化合物依据是否与有机酸相连可以细分为蟾蜍毒素类和蟾蜍毒配基类化合物。
蟾蜍毒素类包括蟾毒、蟾毒配基脂肪酸酯和蟾毒配基硫酸酯等；蟾毒配基类，是蟾蜍毒素在加工炮制过程中的分解产物，如，脂蟾毒配基、华蟾毒精和蟾毒灵为蟾酥的3种主要活性单体。
二是20，21-环氧蟾蜍内酯类。
包括20，21-环氧蟾毒内酯类；20S，21-环氧脂蟾毒配基；20R，21-环氧脂蟾毒配基；3-0-甲羧基-20S，21-环氧脂蟾毒配基；3-0-甲羧基-20R，21-环氧脂蟾毒配基；3-0-20S，21-环氧脂蟾毒配基。
三是吲哚类衍生物。
有蟾酥碱(蟾蜍色胺)、蟾酥甲碱(蟾酥季胺)等。
四是其它化合物。
蟾酥还含有氨基酸、有机酸、肾上腺素、吗啡、多肽及多糖等。
二、蟾酥的药理作用（一）强心作用蟾酥及其二烯内酯化合物有类似洋地黄的强心作用，因为其结构与强心甙甙元相似，破坏其结构中的二烯内酯环，则丧失对心脏的作用，其优点是无积累、作用快，利尿作用比洋地黄显著。
蟾毒配基类和蟾蜍毒类化合物均有强心作用，前者作用更明显，且毒性低，能直接加强心肌收缩力。
一般认为蟾毒配基可以抑制心肌细胞膜上的Na+-K+-ATP酶，从而使心肌细胞内Na+浓度增高，Ca2+则通过Na+/Ca2+交换体转运进细胞，细胞内钙浓度增加，心肌收缩力增加，从而发挥强心作用。
高效液相色谱-串联质谱法测定肝组织中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基
ＷＡ Ｎ Ｇ Ｗｅ ｉ １ ，Ｌ Ｉ Ｕ Ｍｉ ｎ ｇ — ｄ ｏ ｎ ｆ ，Ｙ Ａ Ｎ Ｙ ｏ ｕ － ｙ ｉ １ ，Ｙ Ｅ Ｙ ｉ ｌ ，Ｚ Ｈ Ａ ｏ Ｊ ｕ ｎ — ｈ ｏ ｎ ， Ｘ Ｉ ｏ Ｎ Ｇ Ｈ ｕ ｉ １ ，Ｘ Ｉ Ａ ０ Ｍｉ ｎ １ ，Ｌ Ｉ Ａ ０
Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄｓ Ｔｈ ｅ ｈ ｏ ｍｏ ｇ ｅ ｎｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｌ ｉ ｖ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕｅ ｗ ｉ ｔ ｈ ｉ ｎ ｔ ｅ ｍａ ｌ ｓ ｔ ａ ｎｄ ａ ｒ ｄ ｄ ｅ ｘ ａ ｍｅ ｔ ｈ ａ ｓ ｏ ｎ ｅ ｗａ ｓ ｅ ｘ ｒａ ｔ ｃ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｄ ｉ ｃ ｈ ｌ ｏ ｒ ｏ ｍｅ ｔ ｈａ ｎ ｅ ．Ｔｈ ｅ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ｍｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｌ ｗｅ ｒ ｅ ｐ ｕ ｒ ｉ ｉｅ ｆ ｄ ｔ ｒｏ ｈ ｕ ｇ ｈ Ｐ ｒ ｏ Ｅｌ ｕ ｔ Ｃ】 ８ ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ
ｉ ｎ ｌ ｉ ｖ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｈ ｉ ｇ ｈ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｎ ｃ ｅ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ － ｔ ａ ｎ ｄ ｅ ｍ ｍａ ｓ ｓ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｙ（ ＨＰ Ｌ Ｃ— ＭＳ ／ ＭＳ ） ．
王 薇 。 刘明东 。 ， 颜 有 仪 ， 叶 ， 肖 懿 ， 赵 俊 红 ， 熊 卉 敏 ， 廖 林川 ６ １ ０ ０ ４ １ ；２ ． 四川大学华西药学院， 四川 成 都 ６ １ ０ ０ ４ １ ） （ １ ． 四 川 大 学华 西基 础 医 学与 法 医学 院 ， 四 川 成都 摘 要 ： 目的 建 立灵 敏 、 准 确 的 高效 液 相 色谱一串联 质 谱 法 （ Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ ） 测 定肝 组 织 中华 蟾 酥 毒 基 和 酯 蟾 毒 配基 含 量 的 方 法 。 方 法 肝 组 织 匀浆 液 中加 入 内标 地 塞 米 松 ， 用 二 氯 甲烷 提 取 后 挥 干 ， 残渣加 入 甲
蟾酥药理作用及制剂工艺的应用研究进展
蟾酥药理作用及制剂工艺的应用研究进展作者：张薇薇来源：《赢未来》2017年第08期摘要：蟾酥指的是由蟾蜍科动物的皮肤或耳后腺分泌出来的一种中药物质，比如黑框蟾蜍等，具有止痛、解毒和开窍醒神等效果，因此在临床上得到广泛应用，比如牛黄消炎片、六神丸等中成药的主要成分之一就是蟾酥，可用于治疗腹痛腹泻、恶心呕吐、咽喉肿痛、痈疽疗疮和中暑等疾病。
本文主要深入分析了蟾酥药理作用及制剂工艺的应用研究进展。
关键词：蟾酥；药理作用；制剂工艺；应用；研究进展一、蟾酥药理作用（一）对心血管的药理作用首先，强心作用：若蟾酥使用量大，则对青蛙、猫等动物具有麻醉效果，促使心跳缓慢；若使用量小，则可以强化蟾蜍离体心脏的收缩功能，另外，蟾蜍毒素类化合物和蟾毒配基类化合物强心功能较显著，可通过钙离子等进入心肌细胞，增强心肌收缩功能，而蟾酥中就含有中远华蟾毒配基，根据相关实验表明，蟾酥能促使受体与钾通道结合，强化蟾蜍心脏收缩力；其次，升压作用：蟾酥升压作用与四周血管收缩、心动等有关，作用原理与肾上腺素差不多，能够通过受体阻断剂进行阻断，升压效果随着使用量的增加而明显；最后，增强心肌血液循环作用：蟾酥具有抗凝功能，能延长纤维蛋白原凝聚时间，增加蛋白溶酶的活性，促进心肌营养性血流量和冠状动脉管流量的增加，改善心肌缺血情况，可治疗由血栓引发的一系列疾病，比如心肌梗死等。
（二）鎮痛根据蟾酥脂溶性提取物镇痛效果实验研究可知，该提取物可减少鼠扭体的次数，促使其热板痛阀值的增大，根据另一个研究实验表明，蟾酥可与维拉帕米合用起到协同镇痛效果，蟾蜍对鼠腹痛和足痛存在显著的镇痛作用，然而蟾酥注射液对蛙神经动作电位不存在影响。
（三）抗肿瘤1、对抗白血病蟾酥注射液可限制白血病细胞的合成，且能促使其死亡，对使用量和时间等存在依赖性，根据不同成分蟾酥抑制白血病研究显示，蟾蜍相关几种纯化物和皮脂腺产物能借助细胞周期阻滞凋亡作用，对白血病细胞繁殖起到抑制效果，这是因为细胞外信号调解激酶（ERK）对蟾蜍灵诱导K562细胞的死亡具有负向调节作用[1]。
蟾酥的提取工艺研究
Ｓ ｃ ｈ ｎ ｅ ｉ ｄ ｅ ｒ ） 的耳后 腺及皮 肤腺 分泌 的 白色浆 液 ， 经加 工干燥 而 成 。具 有解毒 ， 止痛 ， 开窍 醒神 的功效 。用
于痈 疽 疔 疮 ， 咽 喉 肿痛 ， 中暑 神 昏 ， 痧胀腹痛吐泻。
１ ． ２ 材料
蟾酥 药材 购于 山东平 邑 ， 经 山东 中医药
关键词 ： 蟾酥 ； 正 交试 验 ； 提 取 工 艺 中 图分 类 号 ： １ ： ｔ ２ ８ ４ ． ２ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： ２ ０ ９ ５— ５ ３ ７ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２— ０ ０ ６ ６～ ０ ０ ３
Ｓｔ ｕｄ ｙ ｏ ｎ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ Ｂｕ ｆ ｏ ｎｉ ｓ Ｖｅ ｎ ｅ ｎ ｕｍ
正交试验法优选蟾酥脂溶性成分提取工艺
３ 讨 论
通过对 薄 层 色谱 条 件 的筛 选பைடு நூலகம்， 现 以 甲苯一 酸 发 醋 乙酯一 甲酸 （ ４：１ 为 展开 剂 时 ， 品在 硅 胶 Ｇ 板 、 ５： ） 样 硅胶 Ｈ板 、 聚酰胺 膜上 均可 有效 分离 ， 在 聚酰 胺膜 但 上结 果更 稳定 。 通过对提取驱虫斑鸠菊总黄酮的提取溶媒 、 提取时
参 考文献 ：
［ ］ 中华 人 民 共 和 国 卫 生 部 药 品 标 准 ． 吾 尔 药 分 册 Ｅ ］ １ 维 ｓ．
１ ９９ ４７， ０ ９ ． １５ ．
加 ４ 氢 氧化钠 溶液 ４ ０ｍＬ， ０ｇ・ ． 加体积 分数 ６ Ｏ
乙醇稀释 至刻 度 ， 匀 ， 摇 放置 １ ｎ 照分 光光度法 （ ５ｍｉ； 中
国药典 ２０ ００年版一部 附录 Ｖ ）在波 长 ５０ｎ 处测 Ｂ， １ ｍ
定吸光度 ， 以吸光度 为横 坐 标 ， 量浓 度 为纵 坐标 ， 质 绘
（ 收稿 日期 ：０ ６０ —０ ２０ —６１ ）
制标准 曲线 。以浓 度 Ｃ（ ｇ 对 吸光 度值 Ａ作 线性 回 ｍ）
归， 所得 回归方 程为 Ｃ＝ ０ ７ ７４×Ａ＋ ０ ０ ２９ ｒ一 ． ９ ． ０ ， ０ ９ ９３ 性范 围为 ０ ０ ０６ ～Ｏ ５ ６５ｍｇ ． ９ 线 ． ５ ５ ． ０ 。 ２ ２ ５ 精 密度试 验 ．． 取 同一供 试 品溶 液重 复 测定 ６ 次 ， 吸光 度均值 为 ０ ５ ２４ Ｒ Ｄ＝０ ４ （ 一６ ， 其 ．８ ， Ｓ ．９ ） 结果表 明精 密度 良好 。 ２ ２ ６ 稳定 性试 验 ．． 取 同一供 试 品溶液在 不 同时 间 进行测 定 ， １ 在 ０ ｈ内 吸光 度 均值 为 ０ ５ ３２ Ｒ Ｄ一 ． １ ， Ｓ
蟾稣脂溶性提取物的分离分析及其镇痛、抗肿瘤作用研究
肿瘤细胞 的分化 和 凋亡 。
用， 进而为开发出有应用前景的专一性强的高效低 毒的新药提供实验数据， 文特就蟾酥的脂溶性化 本 合物在 麻 醉镇 痛 方 面 ， 以及 它对 Ｈｅ ｌ 胞， ａ细 Ｔ淋 巴 瘤细胞的生长抑制作用方面进行了研究 ， 为进一步
开发蟾酥及各有效成份 的药用价值 ， 扩展临床应用 范围提供实验数据和理论依据。
１ 材 料和方 法 １ １ 实验材料 及仪 器 ．
蟾酥 ， 中药材公司饮片厂。布洛芬片 ； 湖北 硅胶 Ｈ； 氯仿 ： 乙醚 ： 丙酮 ＝ ： ： ； ３ ３４ 硫酸乙醇 ， ， 丙二 １２一
醇， 冰醋酸； ｅ 细胞 系由武汉大 学生科 院分子病 Ｈｌ ａ 毒学实验室惠赠 ； 巴瘤细胞 ， Ｔ淋 由武汉大学生科院 分子病毒学实验 室惠赠 ； 台盼蓝 ， 士 Ｆ Ｋ 公 司 瑞 ｌ ａ ｕ 产； 昆明种小白鼠， 体重 ｌ ２ ， ８～ ２ｇ 由湖北 医科大学 基础医学院动物房提供 ；Ｏ 培养箱 ， Ｃ 倒置光学显微 镜， 索氏提取液 ， 旋转蒸发仪。
色膏状物 ４ ３８ ， 即为蟾蜍的脂溶性提取物。 ．３３ｇ此 取 １ 膏状物点样进行薄层层析 ， ｇ 薄层板用硅 胶 Ｈ铺成 ， 展开剂体积 比为 乙醚： 丙酮 ＝ ： 和氯 ６１
蟾酥的现代研究
蟾蜍灵、华蟾蜍精、惹斯蟾蜍甙元、华蟾蜍它灵及日本蟾蜍它灵静脉注射（0.05毫克/公斤），均可引起麻醉兔的呼吸兴奋和血压上升。呼吸兴奋是中枢性的。惹斯蟾蜍甙元除对兔外，对猫也能兴奋呼吸，其作用比尼可刹米、戊四氮、洛贝林等还强，并能拮抗吗啡的呼吸抑制。它们升高血压的作用以蟾蜍灵最强，其次为华蟾蜍精、惹斯蟾蜍甙元、华蟾蜍它灵，而以日本蟾蜍它灵最差。惹斯蟾蜍甙元的升压作用主要是末梢性的，但也有中枢性成分。正常人静脉注射蟾蜍它灵0.25～0.5毫克，升高收缩压而不影响舒张压，说明主要由于心脏兴奋。在麻醉狗，还可看到在血压上升时内脏血管收缩，此作用不受肾上腺素阻断剂的影响。蟾蜍色胺与上者不同，它能引起肾上腺素释放，且使动物对肾上腺素更加敏感。蟾蜍特尼定与它相似；但由于其毒性很强，超过5微克/公斤即可引起兔血压下降。在蛙腹直肌、脊髓猫、竖毛肌轴素反射、离体兔肠标本上，均可证明它有烟碱样作用，而且比烟碱本身还强。华蟾蜍色胺能兴奋神经节，故能升高麻醉猫及去脑狗的血压。
此外，蟾蜍还含有肾上腺素（Adrenaline）、γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid）、辛二酸．从蟾酥中还分出吗啡（Morphine）。
理化鉴别
（1）该品断面沾水，即呈乳白色隆起。
（2） 取该品粉末0.1g，加甲醇5ml ，浸泡1小时，滤过，滤液加对二甲氨基苯甲醛固体少量，滴加硫酸数滴，即显蓝紫色。
8、抗炎作用
蟾酥甾醇类物质能抑制血管通透性，对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌感染的家兔，皮下注射蟾酥注射液9mg/kg能阻止病灶扩散，使周围红肿消退，抑菌效果明显、迅速，对一些抗生素不敏感或对抗生素已产生耐药性的化脓性疾患，该品亦有抑制效果。用甲醛液滤纸片法观察到蟾酥有抑制肉芽形成的效果，其皮下注射的半效抑制量（ID50）为159mg/kg，醋酸氢化可的松的ID50为35.7mg/kg 对受醋酸刺激的组织血管通透性亢进有抑制作用。强心配糖体可使血管收缩，故对烧伤及其它创伤，与抗感染药合用，可收到良好的抗炎效果。并能抑制毛细血管通透性增高，减少炎性渗出，有益于消除肿胀，是否与兴奋垂体。肾上腺皮质系统而改善其功能有关，尚需进一步研究。另据报告，蟾酥制剂能激活小鼠腹腔游走巨噬细胞，提高其吞噬能力，已知被激活的巨噬细胞和处理抗原，又能直接杀死细菌和抑制细菌生长。
蟾酥的实验研究
蟾酥抗肿瘤作用的研究进展
中药蟾酥（ ｅｅ ｕ ｕｏｉ） Ｖ ｎｎ ｍ Ｂ ｆ ｓ是蟾蜍 科动物 中华 大蟾 蜍 曰 ｎ ， 降 。
６ ’ ａ ａｉ ｎ ａｔ 或 黑 眶 蟾 蜍 ） ｅ ｎｓｃ ｓＳｈｅｄｒ ｇ ｒ ｒａ ｓ ｎｏ ｇ ｚ Ｃ ｒ ｍ ｌ ｏｔｔ ｃｎｉｅ 的 ２ １ 肝癌 范健等用乳化聚合法 制备的华蟾酥 精明胶微球选择 ａ ｉｕ ． 耳后腺或皮肤腺所分泌的 白色浆液 ， 多于夏 、 秋二季捕捉蟾蜍 ， 挤 性 地 栓塞 肝窦 前 动 脉 ， 示 了较 好 的 抗肝 癌作 用 。用 华 蟾 素注 射 显
蟾毒配基类 （ ｕｏｅｉｓ ： ｂｆ ｎｎ ） 为脂溶性 成分 。蟾 酥中含有 其中 细胞凋亡 ， ｇ 其诱导作用可能是通过线粒体通路实现的。
１ 种成分 ， 中含量最 高的前 ３种成 分 ： 蟾毒精 （ Ｂ） ４ １ ５ 其 华 Ｃ （ ．％ ５ ６ ） 脂蟾毒配基 （ Ｂ （ ． ％ ～ ． ％ ） ．％ 、 Ｒ Ｇ） １７ ５５ 和蟾 毒灵 （ Ｌ Ｂ）
摘要 ：蟾酥为我国的传统中药， 临床上用于肿瘤的治疗并取得了良好的效果。文章综述了蟾酥抗肿瘤作用及近年来的
研 究进 展 。
关 键词 ： 蟾酥； 抗肿瘤 中图分类 号 ： ２ ５ ５ Ｒ ８ ． 文献标 识码 ： Ｂ
文章编 号 ：０ ８０ ０ （０ ０ ０ － ０ ．２ １０ －８ ５ ２ １ ） １ ２ ４０ ０
Ｓ Ｃ ７ １ 胞 具 有 显 著 的 细 胞 毒 作 用 ， 态 学 和 Ｄ Ａ 片 段 化 ＭＭ ７ ２ 细 形 Ｎ
蟾酥 自２ Ｏ世纪 ８ ０年代投入临床应用 以来 ， 在抗肿瘤 的治疗 检 测 证 实 Ｂ Ｌ诱 导 的细 胞 死 亡 以 凋 亡为 主 ； 癌基 因 ｖ １ ａ／ ｉｚ 抑 ２ｗｆ ｃ ｌ ｐ 中取 得 一 定 疗效 。现 将 蟾 酥抗 肿瘤 作 用 的研 究 综述 如下 。 在Ｂ Ｌ诱 导下 表 达 上 调 。初 步 证 实 ， Ｌ通 过 上 调 ｐ １ ａ／ ｉ Ｂ ２ｗ ｔ ｅ ｚ表 ｌ ｐ
反相高效液相色谱法测定蟾酥中的3种蟾毒内酯
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酯蟾毒配基 和蟾毒灵 含量的方法
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色谱柱 以 乙 腈
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醋酸缓 冲液 ( p H
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华 蟾酥 毒基 酯 蟾 毒 配 基 和 蟾 毒 灵 的 线 性 范 围分 别 为
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建立心益好胶囊中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量测定方法
续表5535.87 253.9 773.7成分样品 含量 (pa )加入量 (pg )测得量 (pg )回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)绿原酸535.447615612705690. 89750151535.5”761561280569851535. 59507571031529850535.445075710289754535.4”255.977858965675. 22.6样品含量的测定 取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算样品含量，结果(见表4)。
表4样品含量测定结果(u=5,mg/片)样品批号( R ，S 6告依春甘草酸绿原酸4100050502538052773051045410006050252305278705106741000705025310527690510602.7峰纯度检测供试品溶液在上述色谱条件下，(R,S )-告依春、甘草酸、绿原酸均达到分离度要求，并且均达到基线 分离,经二极管阵列检测器对色谱峰纯度的检测，三个成分峰的纯度均符合要求。
3 讨论3.1提取条件的选择通过参考文献和查阅相关资料3,1 ,得知超声处理的提取效果与回流提取率并无显著差异，且回流提取操作繁琐，误差较大，所以本研究选用超声处理作为主要提取方法。
本课题采用正交试验法考察了不同体积的甲醇(24%、54%、84% )和超声时间(24 miv 、44 miv 、64 min)的色谱情况,结果54 %甲醇为溶剂时,峰形好、基线稳,超声时间44 mix 时能达到最大提取率。
因此，提取条件为54%甲醇作 提取溶剂，超声 4 mnn 。
312 色谱条件的选择3.2.1流动相的选择:考察了甲醇6.40%磷酸溶液、甲醇-4. 49%磷酸溶液、乙腈6. 49%磷酸溶液等流动相洗脱体系作 为流动相时的色谱情况31。
结果乙腈V 49%磷酸溶液洗脱时，三种成分的色谱峰峰形均较好。
一种天然蟾毒基内酯类化合物的制备方法[发明专利]
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专利名称：一种天然蟾毒基内酯类化合物的制备方法专利类型：发明专利
发明人：林国强,叶文博,赵群飞,张建革,贺庆利,王超申请号：CN202210129037.9
申请日：20220211
公开号：CN114395011A
公开日：
20220426
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种天然蟾毒基内酯类化合物的制备方法，从廉价易得的商业甾体骨架原料，如雄烯二酮4‑AD或3β‑羟基‑5β‑雄甾烷‑17‑酮等出发，通过生物‑化学接力合成或者化学合成方法经过简单转化得到中间体3β,14α‑二羟基‑5β‑雄甾烷‑17‑酮类化合物，然后再通过化学半合成完成E 环即六元二烯内酯环的上载，最终实现蟾毒基内酯类化合物的合成。
该制备方法操作简单，收率较高，可用于大规模制备该类天然产物，具有广泛的应用前景。
申请人：上海中医药大学
地址：201203 上海市浦东新区蔡伦路1200号
国籍：CN
代理机构：上海一平知识产权代理有限公司
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蟾毒灵平衡溶解度和表观油水分配系数的测定
２０16年1月山东中医药大学学报第40卷第1期蟾毒灵是蟾酥中抗肿瘤作用最强的内脂成分之一［1-2］，属强心苷类成分，其镇痛作用为可卡因的30～60倍［3］；研究表明，蟾毒灵有可能成为治疗白血病的药物［4］。
但是目前关于蟾毒灵成药性等基础研究较少，为此对蟾毒灵的平衡溶解度、表观油水分配系数等物理化学参数进行测定，以期为蟾毒灵的成药性评价提供参考。
1仪器与材料高效液相色谱仪（日立有限公司），恒温水浴锅（江苏金坛中大仪器公司HH 系列），超级恒温槽（天津永昌实验仪器公司），离心机（北京医用离心机厂LDZ4-0.8），水浴恒温振荡器（江苏金坛市中大仪器公司THZ -82），超声波清洗仪（昆明市超声仪器有限公司KQ -500B ），pH -2C 酸度计（上海理达仪器公司），电子分析天平（日本岛津210型）。
蟾毒灵对照品（宝鸡市晨光生物科技有限公司，批号：20110823），甲醇（色谱纯，天津四友化学品公司），正辛醇（国药集团-化学试剂有限公司，批号：10015318），纯净水（哇哈哈集团有限公司），乙腈（色谱纯，美国Acetonitrile 公司），其余试剂为分析纯。
2方法与结果2.1蟾毒灵的测定方法2.1.1色谱条件流动相：乙腈-水（50∶50）；检测波蟾毒灵平衡溶解度和表观油水分配系数的测定孙沛霖1，战兵2，林桂涛1（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.山东迪沙药业有限公司，山东威海264205）［摘要］目的：测定蟾毒灵的平衡溶解度及表观油水分配系数。
方法：采用高效液相色谱（HPLC ）法测定蟾毒灵在水和各种有机溶剂中的平衡溶解度，采用摇瓶法测定蟾毒灵在正辛醇-水/缓冲盐溶液中的表观油水分配系数。
结果：25℃、37℃条件下，蟾毒灵平衡溶解度碱性环境下大于酸性环境，但均大于10μg/mL ；蟾毒灵的溶解速度较慢，需34h 才能达到饱和。
pH 对蟾毒灵的表观油水分配系数影响较小，不同pH 环境中，蟾毒灵logP 为2.5～3.0。
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脂溶性蟾毒配基的纯化工艺研究作者：王艳华段佳林卫国朱艳荣殷英郭超关月奚苗苗文爱东翁琰来源：《中国民族民间医药·上半月》2016年第07期【摘要】目的：研究从蟾酥中提取分离高纯度蟾毒灵（B）、华蟾酥毒基（C）和脂蟾毒配基（R）的纯化工艺条件。
方法：以三种蟾毒配基的总含量和转移率为考察指标，采用单因素考察法，结合蟾酥药材的特点、化学成分及工艺成本等多方面的综合因素，考察蟾酥药材的提取、萃取及硅胶柱层析分离的具体工艺条件及参数。
结果：蟾酥药材经10倍量（v/m）80%乙醇加热回流1h，再用10倍量（v/m）乙酸乙酯萃取3次，最后用硅胶柱层析进行分离后，三种蟾毒配基的总含量可达92.26%，总转移率为80.54%。
结论：此法能很好地从蟾酥中分离纯化蟾毒配基，大大提高了三个蟾毒配基的纯度。
【关键词】蟾毒配基；含量；转移率；提取；萃取；硅胶柱层析【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）13-0015-03Abstract：Objective To study on the purification technology of Chansu in order to obtain the high purity ofbufalin （B）， cinobufagin （C） and resibufogenin （R）. Methods The single factor investigation method， combining with comprehensive factors such as the characteristics of raw material， chemical composition and technological cost was used to investigate the detailed conditions and parameters of extraction， separation and silica gel column chromatographyltechnologies with the content and the transfer rate of three bufadienolides as index.Results The final separated products contained a high purity of 92.26% for a sum of B， C and R and a high total transfer rate of 80.54% after the raw materials were separated by 10-fold （v/m）80% ethanol reflux extraction for 1h， 10-fold （v/m） ethyl acetate extraction for 3 times and loaded on silica gel columnchromatography. Conclusion Bufadienolides could be well separated from the raw material of Chansu， and the purityof bufadienolides could be greatly improved with this method.Keywords： bufadienolides； content； transfer rate； extraction； separation； silica gel column chromatography蟾酥是我国的传统中药材，由蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarzinas Gantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的皮肤腺及耳后腺分泌的白色浆液加工干燥而成[1]，具有兴奋呼吸、致幻、镇痛、强心、升压、抗休克、局部麻醉、镇咳、抗肿瘤等一系列的药理活性[2]，其化学成分按溶解性能不同分为脂溶性和水溶性两大类。
虽然脂溶性成分仅占20%左右，但在发挥药理活性方面却起主导作用，其中又以蟾毒灵（bufalin，B）、华蟾酥毒基（cinobufagin， C）和脂蟾毒配基（resibufogenin， R）含量较多、活性较强，且具有高效低毒的特点。
目前蟾酥的提取工艺研究报道很多[3-6]，但对蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基进行提取和纯化并提高三种蟾毒配基混合物纯度的研究并不多。
研究以三种蟾毒配基的总含量和转移率为考察指标，采用单因素试验系统研究了蟾酥的提取纯化工艺，旨在得到高纯度的三种蟾毒配基混合物，为工业化生产提供了一定的参考。
1 仪器与试药1.1 仪器日立D-7000高效液相色谱仪（L-7100 泵、L-7420紫外检测器、L-7200自动进样器，日本Hitachi公司）；HiQ sil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本KYATECH公司）；AT-130柱温箱（天津市鑫洲科技有限公司）；FA1104N电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；FW-100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DZ-1BC真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；玻璃柱（5 cm×90 cm，第四军医大学玻璃仪器制备室）。
1.2 材料蟾酥（安徽省毫州市中药饮片厂）；蟾毒灵对照品（批号：1054-070211，中药固体制剂制造技术国家工程中心）；华蟾酥毒基对照品（批号：110803-200605）、脂蟾毒配基对照品（批号110718-200507）购自中国药品生物制品检定所；柱层析用硅胶（100-140目，200-300目）、薄层层析用硅胶G（青岛海洋化工厂）。
甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果2.1 蟾毒配基的薄层色谱法鉴别取蟾毒灵、华蟾酥毒基与脂蟾毒配基对照品，加甲醇分别制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；再取蟾酥分离物细粉12mg，加甲醇稀释并定容至10mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。
照薄层色谱法（《中国药典》2015版一部附录VIB）试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-丙酮（4∶ 3∶ 3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。
2.2 蟾毒配基的含量测定2.2.1 色谱条件色谱柱：HiQ sil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；预柱：Fusion-RP 4 mm×3.0 mm；流动相：乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液（45∶55； pH： 3.2）；流速：1mL/min；检测波长：296nm；柱温：40℃；进样量：10μL；理论塔板数以蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰计算均不低于4000。
2.2.2 对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的蟾毒灵与华蟾酥毒基对照品各3mg、脂蟾毒配基对照品5mg分别置10mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得三种蟾毒配基单独的对照品储备液；分别精密量取1.0mL单独的对照品储备液，置同一个10mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得三种蟾毒配基混合的对照品储备液；精密量取1.5mL 混合对照品储备液，置5mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得理论上每1mL分别含蟾毒灵与华蟾酥毒基9μg、脂蟾毒配基15μg的对照品溶液。
2.2.3 标准曲线的考察分别精密量取“2.2.1”项下三种蟾毒配基混合的对照品储备液0.2、0.5、0.75、1.5、2.5mL置5mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀。
分别精密吸取稀释后的溶液及混合对照品储备液10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品溶液峰面积对浓度作图，蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的线性关系回归方程分别为：A1= 6287.7 C1- 664.1，r1=0.9999；A2 = 6957.6 C2- 2102.2，r2=0.9997；A3= 6535.6 C3-2751.2，r3=0.9998。
结果表明：蟾毒灵与华蟾酥毒基均在1.2～30.0μg、脂蟾毒配基在2.0～50.0μg范围内浓度与峰面积线性关系良好。
[JP3]2.2.4 供试品溶液的制备精密称定蟾酥提取物或萃取物细粉约25mg，置圆底烧失的重量，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，分别精密量取2.0、1.5及0.5mL续滤液置10mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。
分离物供试品溶液精密称定蟾酥分离物5mg置10mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1.0mL置10mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤即得。
2.3 提取工艺的考察2.3.1 提取溶剂的选择称取小于60目的蟾酥药材细粉5g，分别采用10倍量（v/m）的氯仿或70%、80%和90%乙醇加热回流1h，放冷至室温，抽滤，滤液蒸干，滤液干燥物及残渣置真空干燥箱干燥12h，按2.2项下方法测定提取物中蟾毒配基的含量。
结果表明，随着乙醇浓度的增大，提取物中蟾毒配基总含量从22.01%增加到30.18%，而转移率从85.24%降到76.36%；使用索氏提取器以氯仿为溶剂进行提取时，虽然干燥物中三种蟾毒配基的总含量可达到61.89%，但提取转移率小于60%。
综合考虑，乙醇为中药提取中最常用的溶剂，具有价廉、易得、安全、无毒、无污染等特点，因此本试验选择80%乙醇为提取溶剂。
2.3.2 粉末粒度的确定在试验操作中所采用的粉碎机可在短时间内将药材粉碎到粒径小于60目，其中多数分布在80～100目，因此我们仅对60～80目，80～100目及小于100目的细粉进行了考察。
称取这三种粒度的蟾酥药材细粉各5g，采用10倍量（v/m）80%乙醇加热回流1h，放冷置室温，抽滤，滤液蒸干，滤液干燥物置真空干燥箱干燥12h，按“2.2”项下方法测定提取物中三种蟾毒配基的含量。
结果表明：三种蟾毒配基的总含量和总提取率没有明显差异，均在27%和84%左右。
因此确定将蟾酥药材粉碎到粒度小于60目。
2.3.3 提取回流时间的确定称取小于60目的蟾酥药材细粉5g，采用10倍量（v/m）80%乙醇分别加热回流0.5、1、2h，放冷至室温，抽滤，滤液蒸干，滤液干燥物置真空干燥箱干燥12h，按2.2项下方法测定提取物中三种蟾毒配基的含量。
结果表明：当提取时间小于1h时，提取物中三种蟾毒配基的纯度及转移率较低，但超过1h时，又均未有明显增加。