枸杞多糖对高眼压大鼠视网膜神经节细胞的影响

枸杞多糖对高眼压大鼠视网膜神经节细胞的影响
赵瑛;刘立夏;黄燕;李瑞梅;姚伟莉;鲁燕;路雪婧
【摘要】目的观察LBP对高眼压大鼠视网膜RGCs的保护作用.方法本研究通过前房加压灌注生理盐水的方法建立急性大鼠高眼压模型,随机选取10只健康SD大鼠作为空白对照组,常规饲养.将造模成功的30只大鼠随机分为3组,每组10只,分别给予以下治疗:LBP治疗(LBP组);银杏叶片治疗(银杏叶片组),生理盐水治疗(模型组).每组通过灌胃方式给药或生理盐水,1次/天,连续7天,再用苏木精-伊红染色及免疫组化技术检测视网膜组织中RGCs凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达.结果 LBP组Bcl-2高表达,bax低表达,Bcl-2/Bax比值大于1,与模型组比较有统计学差异(P<0.01);与银杏叶片组比较,LBP组Bcl-2、bax、Bcl-2/Bax比值均有显著差异(P<0.05).LBP对视网膜RGCs的保护作用优于银杏叶片组.结论细胞凋亡可能在视网膜高眼压损伤过程中起着重要作用,LBP对高眼压大鼠视网膜RGCs有保护作用.
【期刊名称】《中医眼耳鼻喉杂志》
【年(卷),期】2012(002)001
【总页数】3页(P24-26)
【关键词】LBP;RGCs;高眼压大鼠
【作者】赵瑛;刘立夏;黄燕;李瑞梅;姚伟莉;鲁燕;路雪婧
【作者单位】610075,四川成都,成都中医药大学;610075,四川成都,成都中医药大学;610075,四川成都,成都中医药大学;610075,四川成都,成都中医药大学;610075,
四川成都,成都中医药大学;610075,四川成都,成都中医药大学;610075,四川成都,成都中医药大学
【正文语种】中文
【中图分类】R774
青光眼是一患病率较高的致盲性眼病,目前治疗方式主要是降低眼压,以减缓视神经
进行性损伤。

然而,临床上有一部分患者眼压正常或眼压已降至正常,但仍不能阻止
其视神经进行性损伤,因而,有必要寻求保护视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的有效药物。

我们前期的研究已经证明枸杞多糖(lycium bararum polysaccharides,LBP)能提高高压处理体外培养视网膜RGCs的存活率,在此,我们
将LBP作用于高眼压大鼠,观察其对高眼压大鼠视网膜RGCs的保护作用,以期为青光眼视神经保护提供新药。

1 材料与方法
1.1 主要试剂
Bcl-2兔抗大鼠IgG、Bax兔抗大鼠IgG(均购自北京博奥森生物技术有限公司)、
生物素化山羊抗兔IgG、生物素化山马抗小鼠IgG、HRP/A-V、DAB(均购自北京中衫金桥生物有限公司)、银杏叶片(购自桂林兴达制药厂)、LBP
1.2 动物分组及给药
选用健康成年SD大鼠,雌雄各半,2～3月龄,体重180g～220g,由成都达硕实验动
物有限公司提供。

随机选取10只健康SD大鼠作为空白对照组(D组),每天常规饲养。

将造模成功的30只大鼠随机分为3组,每组10只,分别给予以下治疗:LBP治
疗(2000 mg/Kg)即LBP组(A组);银杏叶片治疗(210 mg/Kg)即银杏叶片组,(B组),生理盐水灌胃即模型组(C组),各组通过灌胃方式给药或生理盐水,1次/天,连续7天。

予以腹腔注射过量水合氯醛处死,空白对照组在实验最后一并处死,无菌条件下按步
骤摘除眼球。

1.3 急性高眼压动物模型
采用前房灌注生理盐水法造模[1]。

将大鼠固定在操作台上,暴露右眼。

将生理盐水瓶悬置于液平面至大鼠角膜顶点垂直距离136 cm处(此高度可在大鼠眼内形成
100 mmHg的眼内压[2],将连接生理盐水瓶输液管的5号头皮针针尖沿角膜缘刺
入前房,为避免损伤虹膜和晶状体,针头斜面向上,针尖平行于瞳孔缘迅速推进,切勿穿破角膜,固定。

轻轻打开输液器开关,当输液瓶内的液体向眼内滴注时,可见球结膜苍白,虹膜迅速变白,用检眼镜检查可发现视网膜苍白水肿,说明视网膜中央动脉的供血已被完全阻断。

术中间歇以氯霉素眼药水滴眼以保持角膜湿润并预防感染。

加压持续60 min后,关闭输液器开关,小心拔出针头。

涂红霉素软膏,以预防感染。

1.4 眼压测量方法
用icare眼压计测量眼压,每次测量连续测3次,取其平均值。

分别于造模前连续测
量3天、造模后即刻,造模后10 min、40 min测量,测量完毕后点抗生素药水,造模后的眼压大于30 mmHg即为造模成功。

1.5 光镜标本制备HE染色
取每个组的眼球,用10%中性甲醛固定24 h后去除角膜、晶状体,制成眼杯。

流水
冲洗,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋备用,矢状面眼球连续切片,厚度4 μm。

将切片置于多聚赖氨酸涂好的载玻片上,60℃烘烤过夜以防脱片。

标本脱蜡至水,依次以苏木素-伊红染色,乙醇梯度脱水,封片,光镜下观察大鼠视网膜各层组织结构情况。

1.6 Bcl-2、Bax检测及MOD值测定
将制备好的石蜡标本连续切片各10张,5 μm厚,常规脱蜡后分别以Bcl-2和Bax抗体为一抗进行免疫组化染色,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木精复染,封片镜检。

Motic BA400显微摄像系统观察Bcl-2和Bax表达情况,细胞核中有棕黄色或黄色
颗粒者为阳性,蓝色颗粒者为阴性。

采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统(Media Cybernetics,Inc.)对Bcl-2和Bax抗原的表达进行分析,每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度值(MOD)。

1.7 统计学分析
采用SPSS11.0统计软件处理,数据用元表示,采用独立样本t检验。

2 结果
2.1 形态学观察
当眼压达到30 mmHg时,眼球出现瞳孔散大、角膜水肿、房水浑浊、眼球变硬等高眼压体征,实验过程中始终保持眼压大于30～42 mmHg。

2.2 组织学观察
空白对照组RGCs排列紧密、整齐,细胞呈圆形或椭圆形,包膜完整,胞核较大,视网膜全层结构清晰。

模型组视网膜各层结构紊乱,不完整甚至消失,RGCs水肿,出现空泡现象,细胞数量明显减少。

LBP治疗组和银杏叶治疗组视网膜各层结构可见,RGCs 水肿情况较模型组明显轻,有空泡现象,但较模型组少,RGCs数量也较模型组和空白对照组多。

2.3 Bcl-2、Bax表达情况
表1 各组大鼠视网膜组织bcl-2、bax的表达比较组别nBcl-2MOD值baxMOD 值bcl＿2/bax比值A组
1019491．80±295．64▲△12921．60±896．16▲△1．5148±0．11▲△B组1018710．80±518．81▲14404．20±615．12▲1．3011±0．66▲C组107154．50±1176．3026101．80±2548．690．2762±0．05D组1021092．40±1165．966768．90±865．323．1669±0．47
注:LBP组(A组);银杏叶片组(B组);模型组(C组);空白对照组(D组)
▲与模型组比较P<0.01;△与银杏叶片组比较P<0.05
由表1可见:与模型组比较,LBP组及银杏叶片组Bcl-2高表达,bax低表达,有统计学差异(P<0.01);与银杏叶片组比较,LBP组Bcl-2高表达,bax低表达,有统计学差异(P<0.05)。

LBP组与空白对照组比较无显著差异(P>0.05)。

LBP组与银杏叶片组Bcl-2/Bax比值大于1,视网膜组织中RGCs层无明显凋亡,模型组Bcl-2/Bax比值小于1,RGCs层凋亡明显,与模型组比较,LBP组及银杏叶片组Bcl-2/Bax比值有显著性差异(P<0.01),与银杏叶片组比较,LBP组Bcl-2/Bax比值有显著性差异(P<0.05)。

3 讨论
青光眼最主要的病理生理学特性是视神经进行性损伤,目前对青光眼视神经损害的确切发病机制不是十分清楚,参与因素较多,但最终的共同通路是视网膜RGCs的凋亡。

因此防止或延迟对RGCs的损害,有效保护视神经将成为未来治疗青光眼的方向。

枸杞子是茄科植物宁夏枸杞的成熟干燥果实,是我国传统的名贵中药材,最早于秦汉时代的《神农本草经》上就有记载,富含植物多糖、蛋白质、维生素等营养成分。

主要功效为滋补肝肾,益精明目;眩晕耳鸣、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明[3]。

LBP是从枸杞中提取的一种水溶性多糖,是枸杞的主要成分,已明确该多糖系蛋白多糖,分子量为22～25KD,由6种单糖成分组成。

LBP是枸杞子调节免疫、延缓衰老的主要活性成分,具有增强和调节免疫的功能及抗氧化作用。

LBP能延缓多种细胞凋亡,有报道显示,LBP能改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态[4],也能够降低高脂血症大鼠平滑肌细胞凋亡率,延缓动脉粥样硬化的发生[5],参与氧化损伤大鼠晶状体上皮细胞凋亡的调控[6],对糖尿病大鼠视网膜组织的氧化损伤有保护作用[7]。

苏国辉等发现宁夏枸杞提取物对受损视网膜RGCs有保护作用,可预防和保护慢性创伤性神经损伤或RGCs的变性[8]。

细胞凋亡是机体生长、分化、发育和病理过程中由基因编码调控的细胞主动自杀过
程,也称细胞程序性死亡。

Bcl-2和Bax是调节细胞凋亡增殖平衡的重要蛋白因子。

研究发现,凋亡抑制因子Bcl-2和凋亡诱导因子Bax同属于Bcl-2基因家族,当Bcl-
2过表达时,形成异源二聚体Bcl-2/Bax,抑制细胞凋亡;当Bax过表达时,形成同源二聚体Bax/Bax,促进细胞凋亡,Bcl-2/Bax比值的变化与细胞增殖和凋亡平衡密切相
关[9]。

本研究采用大鼠前房灌注生理盐水法建立青光眼急性高眼压损伤模型,这种急性高
眼压诱导视网膜缺血再灌注模型已被确定为闭角型急性青光眼的模型,是研究RGCs凋亡比较常用的模型[10]。

研究中给予高眼压大鼠LBP治疗7天,发现大鼠
视网膜组织中Bcl-2表达增加,bax表达下降,Bcl-2/Bax比值大于1,与模型组比较
有统计学差异(P<0.01),这说明LBP有效缓解了高眼压大鼠RGCs的凋亡。

许多研究都已证明银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba leaves,EGb)具有清除自由基、抑制血小板活化因子、抑制一氧化氮合酶、保护线粒体、抑制谷氨酸毒性等多种生理作用。

大量的研究也表明EGb能有效保护高眼压模型的RGCs[11],目前,银杏叶片已经作为临床用药。

我们选择银杏叶片作为阳性对照组,与之相比,LBP组Bcl-2
表达增加,bax表达下降,Bcl-2/Bax比值增加,两者之间有统计学差异(P<0.05),说明LBP抗RGCs凋亡的作用优于银杏叶片。

由此可见,LBP能有效缓解高眼压大鼠RGCs凋亡,对RGCs有保护作用,它很有可能成为将来治疗青光眼视神经保护的又
一新药。

4 参考文献
【相关文献】
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