生物化学检验常用分析技术

最大吸收波长
吸 光 度
波长范围
0.80
Ax 0.60
0.40
0.20
0.00
cx
0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
（二）原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸 气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。 即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。 常用的定量方法有： 标准曲线法、标准加入法、内标法。
吸收光谱
透射光 检测器
入射光 不同波长光
紫外-可见分光光度法的原理
紫外-可见分光光度法是利用物质对光的吸收光谱，对 物质进行定性分析或定量分析的方法。按所吸收光的波长 区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称 为紫外-可见分光光度法。
波长
0.01nm 0.1nm 200nm
800nm 10µm 500µm 400nm 2.5µm 25µm
物质呈现各种各样颜色，就是它们对可见光 中某些特定波长的光线选择吸收的结果。
待测管 2 待测管 1 标准管 试剂空白管
物质颜色和吸收光颜色的关系
物质颜色
黄绿 黄 橙 红
紫红 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
吸
颜
色
紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 绿 红
收 波
光 长(nm)
400 ~ 450 450 ~ 480 480 ~ 490 490 ~ 500 500 ~ 560 560 ~ 580 580 ~ 600 600 ~ 650 650 ~ 750
紫外-可见分光光度法的原理
物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波 长的光。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了 解物质的结构特性。
用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，通过测 量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横 坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长 范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的 吸收能力，称为吸收光谱。
Lambert-Beer定律要求条件 • 1、入射光必须是单色光 • 2、被测样品必须是均匀介质 • 3、吸收过程中，吸收物质之间不发生相互作用
4、Lambert-Beer定律的偏离现象
• 1. 吸收定律本身的局限性 • L-B 定律是一个有限的定律，只有在稀溶液中才能成立。 • 2、仪器因素(非单色光的影响) • 3、化学因素 • 溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而发
A
lg T
lg
I I0
lg
ILeabharlann Baidu I
lg 1
T
kbc
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lg
1
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kbc
该公式表明，当用一束单色光照射吸收溶液时，其吸光度与液层厚度 及溶液浓度的乘积成正比。此即朗伯-比尔定律。在朗伯-比尔定律中，比 例常数k称为吸光系数。
如果溶液浓度以物质的量的浓度表示时，此常数称为摩尔吸光系数 （ε），它表示在一定波长下测得的液层厚度为1cm、溶液浓度c为1mol/L 时的溶液吸光度值。
生物化学检验常用技术
黔东南民族职业技术学院
医药技术系医学检验技术
第一节光谱分析技术
光谱分析（分光光度技术）：利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱 谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。 特点：灵敏、快速、简便。是生物化学分析中最常用的分析技术。
光谱分析技术分类
一、吸收光谱分析法
紫外-可见分光光度法的原理
物质对光的选择吸收
当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被吸收或被反射， 不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈， 对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。
一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收。
吸光度与透光度
光照射到物质可发生折射、反射和透射,一部分光会被物质吸收，一部分光被溶液透 过，另一部分光被散射。
设入射光强度为I0，透射光强度为叫I透，射透率射，光以强T度表与示入。射光强度的比值称为透光度，也
T I 10kbc I0
在光谱分析中，常常用吸光度表示溶液对入射光的吸收程度。吸光度与透光度的关系 是：吸光度等于透光度的负对数，用A表示吸光度，有下列公式关系。
如果溶液浓度以质量体积比表示时，此常数称为比吸光系数（ ），它 表示当溶液浓度为1g/L、液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度 值。摩尔吸光系数ε和比吸光系数 可相互换算。
• 、Lambert-Beer定律的应用条件：Lambert-Beer定律适用 可见光、 紫外光和红外光；适用均匀非散射的液态样品，固体气态等
1cm 1m
光谱 区域
γ 射线
χ 射线
紫外光
可 见 光
红外光
微波
无线电波
分析 方法
γ 射线光谱法
χ 射线 光谱法
紫外分 光光度法
分光 光度
法
红外光谱法
核磁共振 微波光谱法 光谱法
紫外-可见分光光度法的原理-定量分析
利用标准曲线法定量分析
在一定波长（λmax）下测定某物质的标准系列溶液 的吸光度作标准曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由 标准曲线求得样品溶液的浓度或含量。
1.标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以 吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其 吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。由于影响因素较多，每次实验都要重新 制作标准曲线。
2.标准加入法：把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然 后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线， 用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。本法的优点是能够更好 地消除样品基质效应的影响，较为常用。
生偏离 L-B 定律的现象。 • 例:在水溶液中，Cr(Ⅵ)的两种离子存在如下平衡 • Cr2O42- + H2O ⇌ 2CrO42- + 2H+ • Cr2O42- 、CrO42- 有不同的 A 值，溶液的 A 值是二种离子的 A 之和。但由于随着浓
度的改变(稀释)或改变溶液的 pH 值， [Cr2O42- ] /[CrO42-] 会发生变化，使C总与 A 总 的关系偏离直线。 • 4. 其它光学因素 • (1)散射和反射:浑浊溶液由于散射光和反射光而偏离 L-B • (2)非平行光