[课件]免疫吸附新技术的介绍PPT

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酶联免疫吸附分析PPT课件

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测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶 联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后, 根据颜色反应的程度进行
(一)双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保 留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶 联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性, 当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后, 再加上酶的 相应底物, 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈 颜色。
ELISA原理
其所生成的颜色深浅与欲测 的抗原(抗体)含量成正比。

硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色反 测定波 应
橘红色 492 黄色 460 棕色 449 兰色 425 蓝绿色 642
黄色 红色 黄色 深蓝色
荧光
黄色
400 500 405 420 360,450
420
ELISA的种类和变化 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。
该抗原的定性或定量测定 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性。 因此,加入底物后显色反应较弱。 4、加样
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
(二)间接法
间接法是检测 抗体最常用的方法, 其原理为利用酶标 记的抗抗体以检测 已与固相抗原结合 的受检抗体,故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤,除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定

酶联免疫吸附试验的基本原理 ppt课件

酶联免疫吸附试验的基本原理  ppt课件

(2)加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原 与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结 合的物质。
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(3)加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗 涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质 的量正相关。 (4)加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反 应的程度进行该抗原的定性或定量。
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(二)双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定 簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本 的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了 操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测定的敏感 性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA提高 到新水平。
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(2) HBeAb的竞争法:先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体, 同时加入待测标本和中和抗原HBeAg,此时待测标本中的HBeAb和固 相抗体竞争结合中和抗原HBeAg,待测标本中HBeAb浓度越高,则与 固相抗体结合的HBeAg就越少,反之亦然;温育后洗涤,加入酶标记 的特异性抗体,酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合, 温育后洗涤,加入底物显色,显色的强弱与待测标本中的HBeAb含量 呈反比。
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(3)加入特异性抗原试剂:它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 (4)加入针对特异性的酶标抗体:使之与结合在固相上的抗原反应结合。 洗涤。 (5)加底物显色:如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性 IgM抗体 存在,是为阳性反应
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免疫吸附新技术的介绍

免疫吸附新技术的介绍

I.A在免疫治疗相关的疾病治疗中优势


应用范围广,临床收效快 避免了免疫抑制剂的不良反应与严重副作用 无血浆的丢失,无需补充血浆,避免输注血 制品的副作用,对血液固有成分损伤小 除了循环血液中免疫复合物的清除外,也有 部分组织相结合的免疫复合物和补体的清除。 还有调节免疫,产生免疫耐受和恢复免疫功 能的作用。
免疫吸附临床应用状况(4)
心血管科: 重症高脂血症 (家族性) 脂代谢紊乱导 致心脑血管病 闭塞性动脉硬 化 扩张性心肌病
风湿科: 重症风湿病, 类风湿性关 节炎 皮肌炎 结节性多动 脉炎 其他: 天苞 牛皮藓 药物中毒 耐胰岛素性 糖尿病 肿瘤等等
抗人体IgG吸附柱。 治疗:器官移植前后,家族性高脂血症,肾脏与神 经系统疾病
I.A在免疫治疗相关的疾病治疗中优势与不足



免疫性疾病疾病累及全身多个系统 免疫抑制剂是治疗免疫性疾病基本和重要的手段,但 是免疫抑制剂疗效有较大局限性,较大的副作用,并 发症,甚至严重的后果是治疗的最大障碍 血浆臵换部分清除循环中的致病物质,提供了一个新 的治疗方法,但是标记的自身抗体,单克隆抗体进行 放免研究发现:它仅能将少量与组织结合的自身抗体 清除,而且较多血浆与蛋白的丢失,需要输血浆或蛋 白,也对机体不利。
免疫吸附临床应用状况(2)

血液科



血友病A 特发性血小板减少性紫癫(ITP) 血栓性血小板减少性紫癫(TTP) 免疫性溶血性贫血 多发性骨髓瘤 原发性巨球蛋白血症 RH血型不合 净球蛋白血症 单克隆高丙球蛋白血症等
免疫吸附临床应用状况(3)
消化科: 暴发性肝炎 术后肝功能衰竭 重症黄胆 出血坏死性胰腺炎 肝移植前高敏或排 异 神经科: 重症肌无力 格林-巴利综合症 慢性多发性脱髓鞘 神经根炎 进行性系统性硬化

酶联免疫吸附实验ppt课件

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作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后 重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度:最小可测人TNF-a达4pg/ml。
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时,甩尽孔内液体,每孔加洗涤 液350μl,静止30秒后甩尽液体,在厚迭吸 水纸上拍干,洗4次。
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工作液 100ul/孔,封住板孔, 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外,加入1:100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条,其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外,分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中,标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔,37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外,加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液(4)用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀,按说明稀释至 所需浓度,再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况,将标本做适当倍数稀释(可 做预实验,以确定稀释倍数)。

酶联免疫吸附测定法ppt课件

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什么是 酶联免疫分析技术
ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特 点 ELISA的应用实例
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷 兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免 疫测定方法,即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领 域中的前沿课题 ,它是一种特殊的试剂分 析方法,是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础 上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。
(一)双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本(抗原)形成 固相抗体-抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质
抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系,所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
例如乙肝病毒中的 表面抗原(HBsAg)、e 抗原(HBeAg)和核心抗 体(HBcAg),虽来源于 同一病毒,但仅与其相 应的抗体结合,而不与 另外两种抗体反应。抗 原抗体反应的这种特异 性使免疫测定能在一非 常复杂的蛋白质化合物 (例如血清)中测定某 一特定的物质,而不需 先分离待检物。
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应

免疫吸附治疗PPT医学课件

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适应症与A蛋白相似
疗效略有差异
IgG
IgM
IgA
白蛋白↓
Ig-Therasorb 60%~80% 50%
50%
20%
A蛋白
60%~80% 20%~40% 20%~40% 15%
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苯丙氨酸吸附(PH-350和PH250吸附)的适应症及疗效
自身免疫性疾病
• 多发性硬化症 • 格林- 巴利综合征 • Miller- Fisher 综合征 • 类风湿性关节炎 • 系统性红斑狼疮 • 慢性脱髓鞘性神经根炎
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A蛋白吸附的适应症及疗效
3 血液病:
• 免疫性溶血性贫血、伴有白细胞抗体的白细胞减少 症、伴有免疫复合物的过敏性紫癜: 可清除相应抗 体起治疗作用。
• 冷球蛋白血症: 可使常规治疗无效的混合型冷球蛋 白血症患者的皮肤溃疡及关节疼痛减轻或消失。
• 多发性骨髓瘤: 通过清除患者体内明显升高的免疫 球蛋白及轻链蛋白等, 改善血液粘滞度、防治重要 器官( 如肾脏) 受损。
治疗的敏感性,使药物疗效增加,副反 应减少,从而缩短疗程,降低复发率。
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免疫吸附将成为治疗学中 除药物、手术以外 适用于疾病谱的 第三条治疗途径
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脉粥样硬化性闭塞性疾病 • 心脏移植后预防冠心病复发 • 视网膜血管动脉硬化性闭塞
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丙乙烯聚合物吸附的适应症
• 黄疸 • 术后肝功能损害 • 重症肝炎
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其他吸附
• 内毒素吸附治疗革兰阴性杆菌性败血症 • 用抗人β2MG抗体的单链片段制成吸附
剂, 用于清除透析患者体内的β2MG, 防 治与β2MG相关的淀粉样变和腕管综合 征 • 对细胞因子有选择性的吸附剂与装置(CFX) 用于吸附T NF- a、IL- 6 和IL- 10 , 治疗 全身炎症反应综合征和败血症 • 胆红素吸附、过剩放射性核素吸附、肝 炎病毒标志物吸附等

免疫吸附ppt课件

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结 语(2)
IA有效地清除抗体,已应用于自身免疫 性疾病或同种异体抗原(HLA,VIII因子 等)致敏的病人获得了满意的结果
提高吸附剂的选择 性和特异性是今后研 究的课题,研究专病吸附柱或一个柱同 时吸附多种致病因子是今后发展的方向
IA毕竟不是病因性根治性疗法,存在自 身不足与局限性,价格昂贵
成本不高
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吸附剂的分类
生物亲和型 物理化学亲和型
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6
免疫吸附示意图
血泵
枸缘酸盐
血泵
缓冲液 pH7.0
洗脱液 pH2.2
免疫吸附柱
分级纯化
废物
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生物亲和作用
抗原 抗原抗体结合
DNA
抗DNA抗体*
血型物质 抗血型物质抗体*
胰岛素
抗胰岛素抗体
凝血因子VIII 抗因子VIII抗体*
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体外清除自身抗体(3)
神经系统 疾病
重症肌无力
Guillain-Barre 系统性疾病
SLE 类风湿性关节炎
皮肌炎
结节性多动脉炎
内分泌、代谢疾病
耐胰岛素性糖尿病
其它
伴有抗精子抗体的不孕症
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体外清除自身抗体(4)
肾(或其它器官)移植
移植前
清除抗 HLA抗体,降低PRA 减少急性排斥反应,提高肾存活率
免疫吸附(Immunoadsorption)
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1
提要 前言 IA剂的条件及分类 IA技术 临床应用 结语
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2
前言
1979年,Teman第一次将IA技术应用于 临床,IA已逐渐成为BP领域的一个重要 分支,日益受到人们广泛关注。
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欧洲:开展最早也教广泛,主要使用可重复使用的
I.A在免疫治疗相关的疾病治疗中优势与不足



免疫性疾病疾病累及全身多个系统 免疫抑制剂是治疗免疫性疾病基本和重要的手段,但 是免疫抑制剂疗效有较大局限性,较大的副作用,并 发症,甚至严重的后果是治疗的最大障碍 血浆置换部分清除循环中的致病物质,提供了一个新 的治疗方法,但是标记的自身抗体,单克隆抗体进行 放免研究发现:它仅能将少量与组织结合的自身抗体 清除,而且较多血浆与蛋白的丢失,需要输血浆或蛋 白,也对机体不利。

化,消毒,储存等均困难。
制备方便,易于推广。
生物亲和性:吸附特异性强,但原料供应,制备,纯
理化亲和性:吸附特异性相对教差,但活性稳定,生产
对吸附柱的要求
吸附应具选择性或特异性。 在体液(如血浆)中无毒,无害。
不激活补体和凝血系统,不致敏。
极少配基离解,脱落,也不溶解。
稳定性好,便于保存和消毒。
免疫吸附临床应用状况(2)

血液科



血友病A 特发性血小板减少性紫癫(ITP) 血栓性血小板减少性紫癫(TTP) 免疫性溶血性贫血 多发性骨髓瘤 原发性巨球蛋白血症 RH血型不合 净球蛋白血症 单克隆高丙球蛋白血症等
免疫吸附临床应用状况(3)
消化科: 暴发性肝炎 术后肝功能衰竭 重症黄胆 出血坏死性胰腺炎 肝移植前高敏或排 异 神经科: 重症肌无力 格林-巴利综合症 慢性多发性脱髓鞘 神经根炎 进行性系统性硬化
I.A中关键性装置是“吸附柱”(吸附 器,吸附器),它有举足轻重的作用

吸附柱包括载体:
1.载体(Carrier material):有吸附功能的材料(如:琼脂 糖凝胶、聚乙烯醇珠等) 2.配基(Ligand ):是指高选择性,特异性抗体, 抗原 (生物亲和性)或特定亲和力的物质,(物理化学亲和型)
免疫吸附临床应用状况(4)
心血管科: 重症高脂血症 (家族性) 脂代谢紊乱导 致心脑血管病 闭塞性动脉硬 化 扩张性心肌病
风湿科: 重症风湿病, 类风湿性关 节炎 皮肌炎 结节性多动 脉炎 其他: 天苞 牛皮藓 药物中毒 耐胰岛素性 糖尿病 肿瘤等等
能再生,成本不应太高
常用吸附柱的功能与应用(1)
常用配体
蛋白A (ProteinA)
可吸附的物质
IgG1,2,4(100%),IgG3(30~80%) IgM(56%),IgA(69%),抗乙 酰胆碱受体,抗-HLA,抗-GBM,抗 ANCA抗体等
可治疗的疾病
RPGN,抗GBM 抗体肾 炎,SLE,Wegener 肉芽肿,血友病高 敏的肾移植患者, 特发性NS,重症 肌无力,格林-巴 利综合症
免疫吸附临床应用

ProteinA等生物亲和型, 治疗:神经系统疾病,血液科,肾脏科病及器官移植 前后 日本:发展迅速,主要使用色氨酸,苯丙氨酸,硫 酸多聚糖等理化结合型。 治疗:多发性硬化,格林-巴利综合症,SLE,高脂 血症,血液及肾脏科疾病 北美:主要使用proteinA吸附柱和可重复使用的羊抗 人体IgG吸附柱。 治疗:器官移植前后,家族性高脂血症,肾脏与神 经系统疾病
免疫吸附新 技术的介绍
介绍

免疫吸附疗法是血液净化治疗中的一项新技术 免疫吸附临床应用的近况


免疫吸附治疗中的优势和不足
一.免疫吸附是血液净化治疗的新技术

血液净化(Blood purification): 是指机、电子的装置,理化、生物原 理,来清除体内或血液内过多积聚的有 毒,有害物质,从而达到净化血液,纠 正机体内环境异常的一种治疗方法。
常用的血液净化技术





透析:Dialysis:血透(HD):序贯透析,单纯超滤 高效透析,高流量透析 腹透(PD): CAPD,IPD,CCPD,NPD,APD 血液滤过:Hemofiltration(HF),CAVH,CVVH 血液透析滤过:Hemodiafiltration(H.D.F) CAVHDF,CVVHDF 血浆灌流:Hemoperfusion(HP) 血浆置换:Plasma exchange(P.E) Plasmapheresis(P.P) 免疫吸附:Immunoadsorption(I.A)
多克隆绵羊 抗人抗体 色氨酸
所有免疫球蛋白及亚型有相近的结合 同上 力 抗乙酰胆碱抗体,抗DNA抗体,类 重症肌无力,SLE, 风湿因子,免疫复合物,ANCA抗体 类风关,ANCA相 关血管炎
常用吸附柱的功能与应用(2)
常用配体
苯丙氨酸
可吸附的物质
可治疗的疾病
抗脱髓鞘因子,抗 慢性脱髓鞘性N根炎, DNA抗体,免疫复 多发性硬化,SLE, 合物 重症类风关
I.A在免疫治疗相关的疾病治疗中优势
免疫吸附(Immunoadsorption I.A)
血浆吸附(Plasma adsorption PA)
原理:是将患者的血液,通过血泵引出,先经过膜式血
浆分离器使血浆和血液有形成分(血球,血小板)分 离,再经过第二个血泵,使血浆通过含有特殊配体的 免疫吸附柱,经过异性吸附作用,清除血浆内的致病 物质(补体和致病的免疫复合物),达到净化体内环 境,恢复正常的免疫状态。 I.A的实质:膜式血浆分离+血浆灌流 原理:血浆分离+特异性的吸附
硫酸葡聚糖
主要LDL抗体,其 次:C3a及其他补 体抗磷脂抗体,抗 RNP,抗AT-Ⅲ抗 体
胆红素,胆汁酸
家族性高脂血症, 闭塞性A硬化,SLE, 多发性肌炎,系统 性硬化症
黄胆,术后肝损, 重症肝炎
苯乙烯聚合物
免疫吸附临床应用状况(1)
免疫吸附治疗适应范围广,多种科室均有应用的前途
肾脏科: 重症SLE,LN 抗GBM抗体肾炎(Good pasture syndrome) 新月体肾炎 原发性血管炎(ANCA阳性 如:Wegener氏肉芽肿,显微镜多 动脉炎) 溶血性尿毒症(HUS) 骨髓瘤性肾病 特发型肾病综合症 局灶节段性肾小球硬化 透析相关性淀粉样变 肾移植高敏状态,移植后排异等
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