十线粒体的分级分离及电子传.pdf
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17
mtDNA的复制、转录
复制——半保留 需要核基因编码的酶类、调控因子的参与 两个单向复制叉 两条链合成的方向相反，不同步 不受细胞周期的影响
转录——需要核基因编码的酶和转录因子的参与 重链和轻链各有一个启动子 成熟的mRNA无帽，有靴
18
线粒体蛋白质的来源
内源性：10%
线粒体完成电子传递和氧化磷酸化必需的
脂类 ： 占25%-30% 主要是磷脂 含丰富的心磷脂、少量的胆固醇
DNA/RNA/核糖体 辅酶、维生素和无机离子
13
线粒体的遗传体系
除植物中的叶绿体外，真核细胞中唯一含
有核外遗传物质的细胞器
线粒体DNA(mtDNA)
裸露的，不与组蛋白结合 多拷贝 编码线粒体的tRNA,rRNA,部分线粒体蛋白
包括ATP合酶、转运蛋白、 电子传递链
inner membrane7
孔蛋白（porin）
8
线粒体内膜
是细胞质与线粒体基质之间主要的通透屏障 内表面有负责多种功能的蛋白
9
线粒体的内部空间
膜间腔（外腔）
充满无定形液体
含有多种可溶性酶、底物和辅助因子
基质腔（内腔）
酶:DNA聚合酶、氨基酸活化酶等
25
线粒体的起源与发生
增殖方式：分裂 出芽分裂 收缩分裂 间壁分裂
不是绝对均等的
分裂过程中mtDNA随机、不均等地分配到新的线粒体中
线粒体起源于共生的早期细菌
26
第二节 细胞呼吸与能量转换
细胞呼吸（生物氧化；细胞氧化） 细胞内特定的细胞器（线粒体）内，在氧的参与下，分解大分 子物质,产生CO2、释放能量并储存于ATP中的过程。
3
4
mtDNA的复制、转录
复制——半保留 需要核基因编码的酶类、调控因子的参与 两个单向复制叉 两条链合成的方向相反，不同步 不受细胞周期的影响
转录——需要核基因编码的酶和转录因子的参与 重链和轻链各有一个启动子 成熟的mRNA无帽，有靴
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线粒体蛋白质的来源
内源性：10%
线粒体完成电子传递和氧化磷酸化必需的
脂类 ： 占25%-30% 主要是磷脂 含丰富的心磷脂、少量的胆固醇
DNA/RNA/核糖体 辅酶、维生素和无机离子
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线粒体的遗传体系
除植物中的叶绿体外，真核细胞中唯一含
有核外遗传物质的细胞器
线粒体DNA(mtDNA)
裸露的，不与组蛋白结合 多拷贝 编码线粒体的tRNA,rRNA,部分线粒体蛋白
包括ATP合酶、转运蛋白、 电子传递链
inner membrane7
孔蛋白（porin）
8
线粒体内膜
是细胞质与线粒体基质之间主要的通透屏障 内表面有负责多种功能的蛋白
9
线粒体的内部空间
膜间腔（外腔）
充满无定形液体
含有多种可溶性酶、底物和辅助因子
基质腔（内腔）
酶:DNA聚合酶、氨基酸活化酶等
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线粒体的起源与发生
增殖方式：分裂 出芽分裂 收缩分裂 间壁分裂
不是绝对均等的
分裂过程中mtDNA随机、不均等地分配到新的线粒体中
线粒体起源于共生的早期细菌
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第二节 细胞呼吸与能量转换
细胞呼吸（生物氧化；细胞氧化） 细胞内特定的细胞器（线粒体）内，在氧的参与下，分解大分 子物质,产生CO2、释放能量并储存于ATP中的过程。
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细胞核与线粒体的分离
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。 • 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
Supernatant
(上清液)
Pellet
(颗粒团)
沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。
差速离心法 (Differential centrifugation)
优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀 分开，并可使用容量较大的角式转子。
缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复 悬浮和离心加以纯化； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/21000rpm （五楼实验室）
试剂：生理盐水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
细胞核与线粒体的分级分离
总流程
D1
匀 浆
2ml
加2ml 0.25M 蔗糖 悬浮
离 心 3000rpm 10分钟
D2
加1ml 0.34M 蔗糖
1ml D2
U5
离 心
悬浮
4000rpm 15分钟 0.8ml 0.88M蔗糖
D5 涂片
离 心 2000rpm
U2 U1 合并
10分钟
2
5000rpm 10分钟 离 心
1.5ml
置干净小 烧杯中
2、密度梯度离心法：用具有梯度的介质来替换离心 管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度 低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随 后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会 以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分 别收集。 该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒； ②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又 能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形， 能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引 起混合。 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作 严格，不宜掌握。
改良苯酚 品红染色
镜检 U3 D3
1.2ml 离 心 10000rpm 10分钟
2
镜 检
健 那 绿 染 色
涂 片
各加 0.5ml 0.25M 蔗糖 悬浮
D4Leabharlann U4注意事项•吸取上清液时应将离心管略微倾斜，按下移液抢按 钮（不要按到底），后将枪头轻靠在管壁上，缓慢 吸出液体，注意不要使液体浑浊，否则得重新离心。 •密度梯度离心加入上层低密度液体时，也应将枪头 轻靠上侧液面管壁上，缓慢加入液体，加完后上下 层液体应有明显界限。 •1.5ml离心管使用eppendof的离心机；5ml离心管使 用的转子国产小离心机，注意平衡对称！ •线粒体样本制备好后应尽快染色，不要放置过久， 以避免线粒体活性丧失。
细胞核与线粒体分离纯化
细胞核与线粒体分级分离，原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
线粒体分离及功能测定
线粒体分离及功能测定组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）：Components Final concentrationTris-HCl 50mM pH7.4NaCl 150mMEDTA 2mMEGTA 2mMTriton X-100 0.2%NP-40 0.3%PMSF 100uMNaVO3 1mMNaF 250mMLeupeptin 10ug/mlAprotinin 2ug/mlDTT 1mM组织线粒体的分离1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓冲液中，2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分，3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎，4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次，5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中，6) 重复上面步骤一次，7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体，8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次，9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours），10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。
分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法)低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentrationHepes(KOH) 20mM pH7.2Sucrose 210mMMannitol 70mMEDTA 1mMEGTA 1mMMgCl2 1.5mMKCl 10mMDTT 1mM（注：用前加入蛋白抑制剂混合物，包括100uM PMSF 等）收获细胞，PBS 洗一次，转入1.5ml 管中，加入适量低渗缓冲液，冰上浸泡约1hour, 并不时混匀。
然后用Dounce 匀浆器手工匀浆，其间用台盼蓝检查细胞活性状况，至细胞破碎50%左右停止匀浆。
细胞核和线粒体的分离和观察
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简 意赅地阐述观点。
结果： 描述5张涂片镜下情况
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简 意赅地阐述观点。
讨论：
一． 实际情况和理论预期是否符合？为什么？ 二． 本实验步骤有哪些可以改进的地方？
二、实验原理
杆状玻璃匀 浆器法
融法
超声波处理 法
细胞破碎的方法
#2022
细胞破碎的注意事项：
二、实验原理
（二）分离纯化的方法
根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞 组分分离过程中最广泛应用的技术
离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差 异进行分离、浓缩和提纯的一种方法
布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒 体 显 色 ， 而 胞 质 中 的 染 料 被 还 原 成 无 色 。 （ 也 可 使 用 罗 丹 明 1 2 3 或 M i t o Tr a c k e r 等 荧 光 探针标记法等） 细胞核：DNA——亚甲基蓝、甲苯胺蓝、Hoechst染料等
滤液以 2500rpm，离 心15分钟；
一．缓缓取上清液，移入高速离 心管中，保存于有冰块的烧杯 中，待分离线粒体用；
二．同时涂一张上清液片②做好 标记，自然干燥；
三．余下的沉淀物进行下一步骤。
用6ml 蔗糖一Tris-HCI溶液悬浮沉淀 物，以2500rpm离心15分钟弃上清， 将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴 于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
03
缺点是：①分离效果差，不 能一次得到纯颗粒；须经反 复悬浮和离心加以纯化。② 壁效应严重，特别是当颗粒 很大或浓度很高时，在离心 管一侧会出现沉淀；③颗粒 被挤压，离心力过大、离心 时间过长会使颗粒变形、聚 集而失活。
结果： 描述5张涂片镜下情况
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简 意赅地阐述观点。
讨论：
一． 实际情况和理论预期是否符合？为什么？ 二． 本实验步骤有哪些可以改进的地方？
二、实验原理
杆状玻璃匀 浆器法
融法
超声波处理 法
细胞破碎的方法
#2022
细胞破碎的注意事项：
二、实验原理
（二）分离纯化的方法
根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞 组分分离过程中最广泛应用的技术
离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差 异进行分离、浓缩和提纯的一种方法
布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒 体 显 色 ， 而 胞 质 中 的 染 料 被 还 原 成 无 色 。 （ 也 可 使 用 罗 丹 明 1 2 3 或 M i t o Tr a c k e r 等 荧 光 探针标记法等） 细胞核：DNA——亚甲基蓝、甲苯胺蓝、Hoechst染料等
滤液以 2500rpm，离 心15分钟；
一．缓缓取上清液，移入高速离 心管中，保存于有冰块的烧杯 中，待分离线粒体用；
二．同时涂一张上清液片②做好 标记，自然干燥；
三．余下的沉淀物进行下一步骤。
用6ml 蔗糖一Tris-HCI溶液悬浮沉淀 物，以2500rpm离心15分钟弃上清， 将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴 于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
03
缺点是：①分离效果差，不 能一次得到纯颗粒；须经反 复悬浮和离心加以纯化。② 壁效应严重，特别是当颗粒 很大或浓度很高时，在离心 管一侧会出现沉淀；③颗粒 被挤压，离心力过大、离心 时间过长会使颗粒变形、聚 集而失活。
实验一、线粒体的分离与观察
• 线 粒 体 的 鉴 定 用 詹 纳 斯 绿 活 染 法 。 詹 纳 斯 绿 B （ Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属 于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜 上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈 现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无 色。
三、实验用品
1、材料
大鼠肝脏
2、试剂
①生理盐水。
②1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
③0.25 mol／L蔗糖十0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液 （pH7.4）：
④0.34 mol／L蔗糖十0.01 mol/L Tris一盐酸缓冲液 （pH7.4）
⑤固定液：甲醇一冰醋酸（9：1） ⑥姬姆萨染液
ห้องสมุดไป่ตู้
Differential centrifugation
High speed
Low speed
• 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分 散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在 pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分 离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活
2．差速离心
先将 9ml 0.34 mol／L缓冲蔗糖溶液放人离心
管．然后沿管壁小心地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。 用冷冻控温高速离心机按图10－l顺序进行差速离心。
3．分离物鉴定。 (1) 细胞核：
取细胞核沉淀一滴涂片，入甲醇—冰醋酸 液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液（原液10～20 倍稀释）染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果： 细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
二 实验原理
• 采用组织匀浆在悬浮介质中进行分离细胞器； • 在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的
线粒体遗传病培训课件
个体是否体现突变基因的表型，取决于突 变基因的比例、突变基因所在细胞的类型。
线粒体遗传病
16
（六）阈值效应
突变mtDNA达到一定数量才引起某种组织或 器官的功能异常。能影响能量代谢、引起特定 组织或器官功能障碍的最小量的mtDNA突变称为 阈值。
mtDNA突变所致的特定组织或器官功能障碍 表型的出现, 与某种组织野生型与突变型mtDNA 的相对比例有关。
线粒体遗传病
18
(七)母系遗传（maternal inheritance） 母亲将她的mtDNA传给她的所有子女,
她的女儿又将其mtDNA传给下一代的传递方式。 精卵结合时, 精子提供的主要是核DNA,
精子细胞变态为精子时, 大部分细胞质丢失, 精子中段虽然含线粒体, 但几乎不可能进入 卵细胞中, 因此, 受精卵的胞质绝大部分来 自卵子, 即受精卵中的mtDNA几乎都是母亲提 供的。
10000
遗传瓶颈: 在卵母细胞成熟过程中，线粒体数目 从100000个锐减到少于100个的过程。
若某个带有mtDNA突变的线粒体通过了遗传瓶颈， 在胚胎发育过程中，随着细胞的有丝分裂，成 体组织细胞中带有mtDNA突变的线粒体可达到 很高的比例，并影响细胞的供氧功能。
线粒体遗传病
15
（五）同质性与异质性
临床特点:
复发性休克、肌病、共济失调、肌阵挛、痴呆和 耳聋
乳酸性酸中毒 :
线粒体功能障碍，影响丙酮酸的代谢，大量 丙酮酸生成乳酸并积聚在血液和体液中
MELAS患者的特征性病理变化是在脑和肌肉的 小动脉和毛细血管管壁中有大量形态异常的线粒 体集聚
约80% MELAS病例mtDNA编码的tRNA基因3243
位点A→G，即: MTTL1 线粒*体遗M传E病LAS3243G
线粒体遗传病
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（六）阈值效应
突变mtDNA达到一定数量才引起某种组织或 器官的功能异常。能影响能量代谢、引起特定 组织或器官功能障碍的最小量的mtDNA突变称为 阈值。
mtDNA突变所致的特定组织或器官功能障碍 表型的出现, 与某种组织野生型与突变型mtDNA 的相对比例有关。
线粒体遗传病
18
(七)母系遗传（maternal inheritance） 母亲将她的mtDNA传给她的所有子女,
她的女儿又将其mtDNA传给下一代的传递方式。 精卵结合时, 精子提供的主要是核DNA,
精子细胞变态为精子时, 大部分细胞质丢失, 精子中段虽然含线粒体, 但几乎不可能进入 卵细胞中, 因此, 受精卵的胞质绝大部分来 自卵子, 即受精卵中的mtDNA几乎都是母亲提 供的。
10000
遗传瓶颈: 在卵母细胞成熟过程中，线粒体数目 从100000个锐减到少于100个的过程。
若某个带有mtDNA突变的线粒体通过了遗传瓶颈， 在胚胎发育过程中，随着细胞的有丝分裂，成 体组织细胞中带有mtDNA突变的线粒体可达到 很高的比例，并影响细胞的供氧功能。
线粒体遗传病
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（五）同质性与异质性
临床特点:
复发性休克、肌病、共济失调、肌阵挛、痴呆和 耳聋
乳酸性酸中毒 :
线粒体功能障碍，影响丙酮酸的代谢，大量 丙酮酸生成乳酸并积聚在血液和体液中
MELAS患者的特征性病理变化是在脑和肌肉的 小动脉和毛细血管管壁中有大量形态异常的线粒 体集聚
约80% MELAS病例mtDNA编码的tRNA基因3243
位点A→G，即: MTTL1 线粒*体遗M传E病LAS3243G
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2. 细胞核与线粒体的观察、鉴定： ⑴ 细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，空气干燥，加入甲醇-冰乙 酸固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液(原液10~20倍稀释)染色 10min。自来水冲洗，吹干，镜检。 结果：细胞核紫红色，上面附着少量胞质及浅蓝色碎片。
(2) 线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即 滴加1/5000稀释的詹纳斯绿B染液染色20min，盖上盖玻片，镜检。
结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
3.作业 1）分别绘图描绘你所观察到的典型细胞核和线粒体的形态。 2）分析电子传递过程中悬浮液pH值的变化
向0.25mol/L蔗糖缓冲溶液中充氧
充氧且加NADH的悬浮液
未充氧且未加NADH的悬
增加一个充氧且未加NADH的悬浮液作为对照
(1)悬浮液注氧： 在等待离心的同时，在0.25mol/L蔗糖缓冲溶液 中注氧1min。
(2)离心结束后，用上述注氧悬浮液225ul悬浮线粒体，同时加入
25ul 100mM NADH (终浓度为10mM)，混匀后迅速用枪头吸取少量 悬浮液用pH试纸检测pH的变化并记录拍照。以未充氧的悬浮液以 及者充氧但未加入NADH的悬浮液为对照。
⑵ 加入40mL预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液 ⑶将悬浮的肝组织液倒入组织捣碎机中进行捣碎，直至没有 可见的组织块为止。
(4)在烧杯上铺上三层纱布，过滤去除织，缩短匀浆时间， 整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2. 细胞核与线粒体的分离（两人一组）：
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管 ，制氧机，pH试纸
2700/12800rpm 离心机
制氧机
组织捣碎机
试剂：生理盐水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4) 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液 (pH7.4)+10mM NAD+ 4.水中溶解氧检测试剂
5.固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 6. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。 材料：动物肝脏(蛙肝)。
四、实验方法与步骤：
1. 动物肝细胞匀浆制备： ⑴ 取出肝脏（2只牛蛙），先用清水冲洗干净后，放在置于
冰块上的培养皿中用剪刀剪成小块，去除结缔组织，用生理盐 水反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
⑴ 先将20mL 0.34mol/L蔗糖缓冲液分别注入到两支50ml离心管， 然后沿管壁小心地各加入20mL前面制备的肝组织匀浆液，使其 覆盖于上层。 2700 rpm 4 °下离心10min，沉淀为粗提的细 胞核。（该步骤使用五楼实验室的离心机）
⑵ 离心结束后，将上述两支离心管中的上清缓缓取出转入另一 个50ml离心管中，沉淀用1mL预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲溶液洗1 次 (2700rpm离心10min)，离心管中的沉淀为细胞核与部分细胞 碎片。
差速离心分离线粒体
⑶ 将上一步得到的上清液12800rpm离心10min （该步骤 使用五楼实验室的离心机） ，沉淀即为粗提的线粒体。
（如果沉淀足够多，也可以用1mL预冷的0.25mol/L蔗糖缓 冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，获得线粒体）
五. 实验结果和作业： 1. 线粒体电子传递的检测：
实验十二、线粒体的分级分离及电子传 递的检测
（三）线粒体电子传递的检测
在线粒体结构完好的条件下，如果将NAD+加入到线粒体 的悬浮液中，在没有氧气存在的条件下，电子传递不会发生， NAD+也不被氧化，而当加入NAD+的同时注入氧气，伴随着电 子传递，NAD+接受电子被氧化，同时会将H+外排至线粒体悬 浮液中，通过检测悬浮液的酸化，即pH降低，即可证实电子 传递的发生。