病毒载体研究进展

适用范围 基因治疗； Ex vivo 基因治疗； 肿瘤基因治疗。 肿瘤基因治疗。
In vivo 基因治疗； 基因治疗； 肿瘤基因治疗； 肿瘤基因治疗； 疫苗。 疫苗。
AAV 病毒载体 单链 DNA 病毒 ~5kb
In vivo 基 因 治 疗； Ex vivo 基因治疗； 基因治疗； 遗传病基因治疗； 遗传病基因治疗； 获得性慢性疾病的 基因治疗。 基因治疗。
政府支持对基因治疗产业化的重要作用
1、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发 、政策上促进基因治疗的科研、 2、资助基因治疗核心技术研究和开发 、 3、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地 、 4、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品 、支持从事基因治疗的公司发展新技术、 5、促进新的基因治疗公司建立。 、促进新的基因治疗公司建立。 6、制定规范、高效且符合国情的审批程序。 、制定规范、高效且符合国情的审批程序。
双 特 异 性 启 动 子
病 毒 增 殖 的 特 异 性 转 录 调 控
可调控表达的病毒载体
细胞的调控元件 病毒的调控元件 人工合成的调控元件
细胞特异性转录
四环素调控
细胞启动子 病毒启动子
albumin Tyrosinase or TRP-1 PSA MBP MCK GFAP NSE KDR/flt-1 AFP CEA erbB2 MVM P4 B19 promoter HBV JCV EBV
容量：自身基因组大小的105%~110 105%~110% 容量：自身基因组大小的105%~110 类型： 类型：1、重组型病毒载体
可复制型 复制缺陷型
2、无病毒基因的病毒载体
复制缺陷型
组成： 组成：1、病毒复制和包装元件
2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 病毒外壳/ 4、病毒外壳/外膜
用途： 用途：基因转移和表达
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
host cell
Vector plasmid
图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图
多因素系统
双因素系统
Helper virus +helper plasmid
Host cell +vector DNA
rep cap
Recombinant helper virus (rHSV-repcap)
proviral cell
1、基因载体系统 2、基因表达系统 3、治疗基因
基因治疗产品的知识产权构成
1、治疗基因 2、调控元件 3、改造的外壳/外膜 4、靶向分子 5、包装系统 6、生产和纯化技术 7、制剂和保存技术
产业化的组织和实施： 产业化的组织和实施：
1、合作开发 2、专业分工 3、政府支持和企业投资 4、利益分配
知识产权和基础研究
存在的问题：1、安全性 存在的问题：
2、靶向性 3、有效性
细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性 转导靶向性 转录靶向性 转导效率 靶向性 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性
常用的病毒载体的特点： 常用的病毒载体的特点：
病毒载体 反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb 腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
1、基因治疗 、 2、疫苗 、 3、器官移植 、 4、组织工程 、 5、转基因动物 、 6、基因功能研究 、
病毒载体概述（2） 病毒载体概述（ ）
优点： 利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；
复杂的装配过程由细胞完成； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 不同的病毒载体具有不同的表达特点。 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。
病毒载体包装系统 组成： 、 组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒） 、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒） 3、被包装的 、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件 单因素生产系统（ 单因素生产系统（one-component system)
gag pol env
ψ LTR
LTR
图1 反转录病毒包装系统示意图
双因素生产系统 (two-component system)
Ad Shuttle
E1a,b
E1a,b
293 cell
293 cell
JM17
图2 腺病毒包装系统示意图
多因素生产系统 (multi-component system)
Helper virus
rep cap Helper plasmid
嵌合型病毒载体（ 嵌合型病毒载体（hybrid viral vector） ） ：
指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病毒与 AAV 病毒的杂合体病毒，既具有腺病毒的感染性和基因组特性 （双链线状 DNA） ，又具有 AAV 病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999） 。各种病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报道层出不穷，如 单纯疱疹病毒扩增子与 AAV 病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997） 、 腺病毒与 EB 病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转 录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等，不一而足。这些杂合载体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
靶向性病毒载体
转导靶向性
改造病毒外壳/外膜 改造病毒外壳 外膜
连接靶向性结合分子
cell
Modified adenovirus
转录靶向性（特异性） 转录靶向性（特异性）
组 织 特 异 性 启 动 子
肿 瘤 选 择 性 启 动 子
细 胞 周 期 调 控 启 动 子
肿 瘤 血 管 内 皮 导 向 启 动 子
双因素系统生产重组AAV病毒示意图 图4 双因素系统生产重组 病毒示意图
无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 中不含任何病毒编码基因， 被包装的 中不含任何病毒编码基因 包装所必需的顺式作用元件。 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性 但不表达病毒蛋白。 外膜和感染性， 毒的外壳 外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。
rapamycin
GAL4
ER
自我扩增型载体（ 自我扩增型载体（self-amplifying vector） ） ：
这类载体是以正链 RNA 病毒 Sindbis 病毒和 Semliki Forest 病毒为 基础的。用目的基因代替病毒的外壳蛋白编码序列，导入靶细胞中， 病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组，mRNA 水平的大量增加导 致高水 平的转导基因表达。 自我扩增型载体的表 现形式可以是 RNA，DNA 和重组病毒。
基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护
对于基因治疗公司最重要的专利是： 对于基因治疗公司最重要的专利是
1、载体系统； 2、生产过程；3、整体治疗方案 、载体系统； 、生产过程； 、 治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。 治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。
专利对学术研究的影响
1、无影响（对非常早期研究） 、无影响（对非常早期研究） 2、有影响（对临床试验和可能的商业开发） 、有影响（对临床试验和可能的商业开发）
P1
tTA
tetOp
gene
P1
tTA
tetOp
gene
HRE MDR1
tetOp
tTA
tetOp
gene
合成的转录因子
ESTRADIOL
GAL4
ER
RU486
VP16
RXR
EcR
VP16
muristerone VP16
GAL4
PR
ZFHD-1 FKB12
p65
FRAP P65
Diphenol indene
adenovirus
E1a,b
aav vector plasmid
ITR ITR
293细胞 细胞
gene
重组AAV无辅毒包装系统 图5 重组 无辅毒包装系统
ITR
gene
ITR
cre 293-cre
Adenovirus with packaging signal flanked by loxP 图6 mini-adnovirus无辅毒包装系统 无辅毒包装系统
病毒载体研究进展
中国预防医学科学院病毒学研究所 病毒基因工程国家重点实验室 （北京宣武区迎新街100号）
基因载体系统
病毒载体系统
非病毒载体系统
反 转 录 病 毒 载 体
腺 病 毒 载 体
腺 伴 随 病 毒 载 体
单 纯 疱 疹 病
慢 病 毒 载 体
DNA
裸 DNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNA/RNA DNA/RNA DNA/RNA DNA/RNA
HSV 病毒载体 双链 DNA 病毒 152kb
具有嗜神经性； 具有嗜神经性 ； 可逆轴突传 神经系统疾病的基 因治疗； 递； 因治疗； 可潜伏感染； 肿瘤的基因治疗。 可潜伏感染； 肿瘤的基因治疗。 容量大； 容量大； 可感染分裂和非分裂细胞； 可感染分裂和非分裂细胞；
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 、 2、无病毒基因的病毒载体 、 3、靶向性病毒载体 、 4、可调控表达的病毒载体 、 5、嵌合型病毒载体 、 6、自我扩增型病毒载体 、 7、条件增殖型病毒载体 、 8、新病毒载体 、
毒 载 体
细胞内包装
细胞外包装
Gene
Gene expression system
Gene vector system Gene delivery system
病毒载体概述（ ） 病毒载体概述（1） 要求： 要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒
2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病
腺伴随病毒载体： 腺伴随病毒载体：
ITR ITR
gene pA
反转录病毒载体： 反转录病毒载体：
ψ LTR
gene
LTR
腺病毒载体： 腺病毒载体：
ITR ITR
gene pA
单纯疱疹病毒载体： 单纯疱疹病毒载体：
gene gene gene gene
pac
gene
ori
无辅助病毒包装系统
Helper plasmid: E2a E4orf6 VA
重组病毒的生产和纯化
小量制备和纯化
场所
大量制备和纯化
中试车间
实验室
细胞培养
培养瓶
转瓶、细胞工厂、 转瓶、细胞工厂、发酵罐
细胞裂解
反复冻融
机械法或化学法裂解
病毒分离
离心
离心、超滤、 离心、超滤、萃取
病毒纯化
密度梯度超速离心
浓缩、 浓缩、柱层析
制剂
缓冲液
配方
保存
低温
病毒载体与基因治疗产业化
基因治疗的三个核心部分
条件增殖型病毒载体（conditionally replicating vector） 条件增殖型病毒载体（ ） ：
指可在某种特性的组织中产毒性复制，而在其它组织中不增殖的 病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如天然的腺 病毒突变株 Onyx-015 是 55Kdal E1B 基因功能缺失的腺病毒突变株， 可以选择性地在 p53 基因突变的肿瘤细胞中增殖，而在正常组织细胞 中不增殖。用这种突变株联合化疗治疗恶性肿瘤 II 期临床结果令人鼓 舞（Kirn D et al. 1998） ，已进入 III 期临床试验，从此，许多人工改 造的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。
生物学特性 可感染分裂细胞； 可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 整合到染色体中； 表达时间较长； 表达时间较长； 有致癌的危险； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 表达时间较短； 免疫原性强； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、 心肌、 肝脏、 在骨骼肌 、 心肌 、 肝脏 、 视 网膜等组织中表达较高； 网膜等组织中表达较高；