MTT实验
MTT原理及实验方法
MTT原理及实验方法MTT（细胞代谢试剂）是一种用于测量和研究细胞分裂和代谢活性的化学试剂。
该试剂的工作原理基于细胞的代谢能力，其将细胞内的黄色水溶性四甲基偶氮唑盐（MTT盐）氧化为紫色的可溶性形式，从而通过测量溶解形式的MTT的光密度来反映细胞代谢活性水平。
以下将详细介绍MTT原理及实验方法。
MTT试剂的原理：1.MTT溶解：MTT试剂在组织培养试验中被混合到细胞培养物中。
MTT盐会被细胞内的还原酶还原成紫色的可溶性形式（MTT甲醇溶液）。
2.MTT测定：MTT溶液可以通过酶法分解成无色的N-甲基四唑（NMTT）形式，在MTT试剂中的抗氧化剂溶液（如二甲基亚砷酸钠）将MTT还原成紫色可溶性形式。
MTT还原后的紫色可溶性形式可以通过测量其吸光度来间接反映细胞的代谢活性水平。
MTT实验方法：1.细胞培养：选择需要研究的细胞系，将细胞培养在含有适当培养基和温度、湿度、氧气浓度适宜的培养箱中，培养至细胞数量和生长状态适宜的阶段。
2.细胞处理：将细胞均匀分布到培养皿中，并根据具体实验目的进行适当的处理，如添加药物、感染病毒等。
3.MTT处理：将MTT试剂溶解于无菌磷缓冲盐溶液（PBS）中，并将其加入到培养皿中，使其与细胞充分接触。
4.培养皿反应：将培养皿置于37摄氏度的培养箱中，使MTT试剂与细胞反应，在一定的时间内进行颜色的转换。
5.溶解MTT产物：培养皿中的介质和化合物被抽去，用洗涤缓冲溶液洗涤细胞两次，然后加入甲醇或异丙醇等溶剂来溶解产物。
6.吸光度测量：将培养皿中的溶液转移到96孔板（一般用96孔板可实现高通量），并使用微孔板读数器在570纳米波长下读取吸光度。
此时，高吸光度表示细胞代谢活性较高，低吸光度则表示较低。
MTT实验的注意事项：2.实验时间的选择：根据细胞系的不同，具体实验时间的选择可能不同。
一般来说，选择较长的实验时间可以更好地反映细胞的代谢活性水平。
3.细胞处理剂量：根据具体实验目的，选择适当的处理剂量和培养时间。
mtt
（2）悬浮细胞：
1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）
注意事项：
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，
IC50是半抑制率，一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度. IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
(5) 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大。同时加入pbs液填充后，可以一定程度上保持中间孔的水分。
MTT实验
MTT实验MTT实验原理MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
实验步骤普通MTT法实验步骤：1、接种细胞用含10％胎牛血清的培养液将细胞配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μl。
2、培养细胞同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3、显色培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10 μl.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加100 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。
4、比色：选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤（1）贴壁细胞：1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μl,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔；2、5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度,每孔100 μl,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3、5% CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
MTT实验法
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT试验方法
MTT试验方法MTT法原理、步骤以及注意事项(2009-05-28 11:18:56)标签：杂谈分类：实验操作技能MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT
·吸光度测定 死细胞中珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原 为蓝紫色结晶。因此，结晶生成量与活细胞 数成正比。用DMSO溶解结晶，利用酶标仪 测定出在490nm处的光吸收值以反映出活细 胞相对数目。
原理
• 一般来讲，活细胞数越多，生成的蓝紫色结晶越多，检测 的OD就越大；活细胞数越少，生成的紫色结晶越少，OD 值越小。来自结果分析结果分析
100
细胞存活率（%）
80 60 40 20 0 0 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 浓度
生存率曲线（量效曲线）
结果分析
100
细胞死亡率(%)
80 60 40 20 0 0 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 浓度
生存率曲线（量效曲线）
结果分析
MTT实验技术介绍
内容
• MTT实验原理
• MTT法应用 • 所需材料和试剂 • 实验步骤 • 结果分析
• 注意事项
原理
MTT法是一种检测细胞存活及增殖的试 验方法。
原理
·活细胞还原 MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的荧 光染料，可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢 酶还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒 （Formazan）结晶
二甲基亚砜（DMSO）、酶标仪、培养液、胰酶、 二氧化碳培养箱
实验步骤
胰酶消化制成细胞悬液 酶标仪震荡5min，测490nm处OD值
每孔5000个细胞接种于96孔板内
加100μl DMSO溶解颜色结晶
贴壁后加100μl药物溶液孵育24h
每孔加10μl MTT溶液,孵育3h
点板的设计排版
0 1 1 1 1 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6
• 结论：活细胞数与OD值成正相关。
MTT实验方法
一、原理黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。
3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。
4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）然后吸掉上清，每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
8）计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.有依据吗MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm 处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
mtt评价法
mtt评价法摘要：一、引言二、MTT概述1.MTT的定义2.MTT的发展历程三、MTT的实验流程1.实验准备2.实验操作3.结果分析四、MTT的应用领域1.细胞毒性检测2.药物筛选3.细胞增殖抑制研究五、MTT的优缺点分析1.优点2.缺点六、总结正文：一、引言MTT评价法，全称为Methyl Thiazolyl Tetrazolium，是一种广泛应用于细胞毒性检测和药物筛选的实验方法。
本文将对MTT评价法的原理、实验流程及其应用领域进行详细介绍。
二、MTT概述1.MTT的定义：MTT是一种噻唑蓝衍生物，可以在活细胞中通过酶促还原生成可溶性的有色产物，通过检测有色产物的生成量来反映细胞的活力。
2.MTT的发展历程：MTT评价法由McCoy夫妇于1983年首次报道，经过多年的发展，已经成为细胞毒性检测的常用方法之一。
三、MTT的实验流程1.实验准备：MTT试剂、细胞、培养基、实验器材等。
2.实验操作：将细胞种植于96孔板，用不同浓度的药物处理细胞，加入MTT试剂，孵育一段时间，最后用酶标仪检测各孔的吸光度。
3.结果分析：通过吸光度与细胞活力的关系，计算药物对细胞的毒性作用。
四、MTT的应用领域1.细胞毒性检测：MTT评价法可以快速、简便地检测药物对细胞的毒性作用，为药物安全性评价提供依据。
2.药物筛选：利用MTT评价法，可以在短时间内筛选出具有细胞毒性的化合物，为药物研发提供初步筛选结果。
3.细胞增殖抑制研究：通过MTT评价法，可以研究不同因素对细胞增殖的影响，为临床治疗提供理论依据。
五、MTT的优缺点分析1.优点：操作简便，结果快速，可重复性好，细胞毒性检测范围广。
2.缺点：MTT评价法对某些特殊类型的细胞可能存在局限性，且无法区分细胞毒性和细胞抑制。
综上所述，MTT评价法是一种实用的细胞毒性检测方法，在药物筛选、细胞增殖抑制研究等领域具有广泛应用。
MTT原理及实验心得
MTT原理及实验心得MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性检测试剂，其原理是通过测量细胞对MTT的还原能力来评估细胞的存活率和代谢活性。
MTT溶液进入细胞内后，被细胞内还原酶（如线粒体呼吸链中的NADH和NADPH）还原为可溶的紫色产物，然后用溶剂将细胞中的紫色产物溶解出来，最后通过测量溶液的吸光度来评估细胞代谢活性。
MTT实验在细胞生物学和药物筛选中广泛应用，在实验中需要注意以下几点：1.细胞密度和培养时间：MTT实验中，细胞的初始密度和培养时间是影响实验结果的重要因素。
一般来说，细胞密度不能过低，否则会导致实验结果的可靠性降低；同时，培养时间也要控制好，细胞培养时间过长可能导致细胞的过度增殖，从而影响细胞的代谢活性。
2.MTT处理的时间和浓度：MTT的处理时间和浓度需要根据实验的需求和细胞的特性来确定。
一般来说，处理时间通常介于1-4小时之间，而处理浓度则需要根据具体细胞的特性来确定。
在实验中，不同的细胞对MTT的还原能力可能会有差异，因此需要进行实验优化和控制。
3.MTT颜色的溶解：MTT的还原产物是紫色的，所以在溶解过程中需要使用适当的溶剂。
常用的溶剂有二甲基亚砜（DMSO），其溶解能力较强，适用于大多数细胞。
在溶解过程中，需要充分摇匀，使细胞内的还原产物完全溶解，以确保实验结果的准确性。
4. 数据的分析：MTT实验得到的结果可以通过测量吸光度来评估细胞的代谢活性，常用的测量波长是570 nm。
一般来说，MTT实验得到的吸光度值越高，代表细胞的代谢活性越强。
然而，由于MTT实验只能评估细胞的整体代谢活性，而不能区分不同细胞群体中的代谢活性差异，因此在实验中需要结合其他方法来进一步分析数据。
在进行MTT实验的过程中，需要注意以下几点心得：1.优化实验条件：MTT实验的结果受到实验条件的影响很大，包括细胞密度、培养时间、MTT处理时间和浓度等。
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
mtt实验方法
mtt实验方法MTT实验方法引言MTT实验方法是一种常用的细胞代谢活性测定方法，通过测定细胞的还原型三甲基四氮唑盐（MTT）的代谢能力来评估细胞的活力和增殖能力。
本文将介绍MTT实验方法的原理、步骤和注意事项。
一、原理MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种黄色化合物，能够被细胞内的还原酶还原为紫色的可溶性晶体。
MTT实验利用细胞的代谢活性将MTT还原为紫色产物，通过测量产物的光密度来评估细胞的活力和增殖能力。
二、步骤1. 培养细胞将待测细胞种植在适当的培养基中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度达到要求。
2. 处理样本根据实验需要，给予细胞不同的处理，如药物处理、基因沉默、过表达等。
3. 添加MTT试剂将培养基中的MTT试剂按照一定比例（一般为0.5mg/mL）加入到培养皿中，使细胞与MTT试剂充分接触。
4. 孵育细胞将培养皿放回培养箱中，孵育一定时间（一般为2-4小时），使细胞内的还原酶将MTT还原为可溶性晶体。
5. 溶解晶体将培养皿中的培养基倒掉，加入适量的溶解剂（如DMSO）将晶体溶解，形成紫色液体。
6. 测量光密度将溶解后的液体转移到96孔板中，使用酶标仪或分光光度计测量其光密度（一般在570nm波长下），光密度值越高，代表细胞活力越高。
三、注意事项1. MTT试剂需避光保存，使用前需保持干燥。
2. 实验过程中需严格遵守无菌操作，避免细胞污染。
3. 孵育时间需根据实验需要进行调整，过短的时间可能导致MTT 还原不完全，过长的时间可能导致背景干扰增加。
4. 为减少实验误差，建议设置空白对照组和阴性对照组。
5. 在测量光密度前，需确保晶体完全溶解，否则会出现误差。
结论MTT实验方法是一种简便、可靠的细胞代谢活性测定方法。
通过测量细胞对MTT试剂的还原能力，可以评估细胞的活力和增殖能力。
MTT原理步骤结果分析方法及注意事项
MTT原理步骤结果分析方法及注意事项MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化物）是一种常用的细胞增殖和存活试剂，用于评价细胞对药物、毒物和其他因素的影响。
MTT法通过检测细胞色素C还原酶的活性来间接测定细胞数量或细胞增殖情况。
下面将详细介绍MTT法的原理、步骤、结果分析方法及注意事项。
1.MTT法的原理：MTT法的基本原理是细胞内的色素C还原酶（mitochondrial dehydrogenase）能够将易溶性的MTT（黄色体层）还原成形成紫色的难溶性甲基紫晶体（formazan）。
甲基紫晶体会沉积在细胞内部，形成紫色的染色体层。
细胞数量或细胞增殖情况与形成的紫色染色体层的光密度成正比。
2.MTT法的步骤：步骤一：细胞培养：将待测的细胞分装到孔板中，根据实验需要，每口孔中大约加入1-2×104个细胞。
步骤二：细胞处理：给予相应的药物处理，并培养合适的时间。
步骤三：MTT染色：在每口孔中加入MTT溶液，使其浓度为0.5mg/ml，离心培养盘，孔中细胞会吸收MTT溶液。
步骤四：MTT溶解：将上一步中吸收MTT溶液的细胞加入DMSO中，溶解甲基紫晶体，使之溶于溶剂中。
步骤五：测量吸光度：将溶解后的MTT溶液转移到96孔板中，使用酶标仪测量在570nm波长下所吸光度来反映细胞存活情况，光密度越高，细胞数量越多或细胞增殖情况越好。
3.MTT法的结果分析方法：三个相邻的实验孔之间的平均值将被视为一个的A值，用于比较不同处理的细胞存活情况。
根据实验设计，可以计算药物对细胞的抑制率、活化率、半抑制浓度（IC50）等参数。
常见的结果分析方法包括：(1)药物对细胞的抑制率计算公式：抑制率（%）=（A值（对照）-A值（药物处理））/A值（对照）×100%(2)药物对细胞的活化率计算公式：活化率（%）=（A值（药物处理）-A值（对照））/A值（对照）×100%(3)IC50计算公式：以药物浓度为自变量，细胞存活率为因变量，绘制药物浓度-细胞存活率曲线，通过拟合直线或曲线来计算药物半抑制浓度，即细胞存活率为50%时的药物浓度。
MTT比色实验步骤及注意事项
MTT比色实验步骤及注意事项步骤：1.细胞培养：将目标细胞株移植到含有适当培养基的细胞培养皿中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养至细胞密度适当（一般为80-90%）。
2.细胞处理：对细胞进行处理，如加入试验药物、病毒感染等，根据不同实验需求进行处理方式的选择。
3. MTT溶液制备：使用0.5 mg/ml的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）溶液，使用无菌的去离子水配制，并过滤灭菌。
4.细胞孵育：将MTT溶液与培养基混合后，加入至细胞培养皿中，接上适当的培养条件进行孵育，一般时间为3-4小时。
5.威士忌酸加入：去除培养基和MTT溶液，加入150-200μl的威士忌酸，溶解细胞内的紫色结晶。
6.全部均匀混合：将细胞培养皿轻轻摇晃，使威士忌酸均匀混合，直至所有的紫色结晶完全溶解。
7. 分析测定：使用酶标仪或分光光度计在570 nm波长下测定样品的吸光度，用作衡量细胞增殖的指标。
注意事项：1.细胞培养：应严格按照细胞培养条件进行培养，如温度、湿度、CO2浓度等，以保证细胞的正常生长。
2.细胞处理：处理方式需要根据实验需求进行选择，并且需要进行对照组的设定，以对比实验组的结果。
3.MTT溶液制备：MTT溶液需要使用无菌的去离子水配制，并在制备后立即使用或密封保存，避免阳光直射。
4.细胞孵育：MTT孵育的时间一般为3-4小时，过短时间可能导致未完全形成紫色结晶，过长时间可能会使颜色过于深重影响测定结果。
5.威士忌酸加入：要均匀地加入适量的威士忌酸，避免引起细胞层的机械损伤。
6.全部均匀混合：在溶解细胞内的紫色结晶时要轻轻摇晃培养皿，以充分混合溶解。
7.分析测定：使用酶标仪或分光光度计测定吸光度时，要注意校准设备，并在同一波长下比较样品的吸光度。
总结：MTT比色实验通过检测细胞的代谢活性来分析细胞增殖情况，是一种常用且简单的细胞生物学实验方法。
在进行实验过程中，需要严格控制实验条件，按照步骤进行操作，并注意各个步骤的注意事项，以保证实验结果的准确性。
MTT配制、操作步骤、结果分析、注意事项等全面指南(配图片)
一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
（可参考Sigma，货号M5655，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT配成的终浓度为5mg/ml，须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg，250mg或1g。
1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项D一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。
此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。
比如：生长较快的细胞密度可略小。
2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
●注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。
3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。
下图可做为96孔板的的参考步局。
●对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。
但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。
另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。
4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
6.终止培养，准备溶解结晶。
溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解1)MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
MTT检测法.62
MTT法检测细胞存活和生长MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT复原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒〔Formazan〕并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜〔DMSO〕能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经复原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT ，溶于100 ml的磷酸缓冲液〔PBS〕或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
mtt实验报告
mtt实验报告MTT实验报告MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性实验中的化合物。
它可以通过颜色反应的方式来检测细胞代谢活性，从而评估细胞的增殖情况和毒性作用。
本实验旨在利用MTT实验方法，研究不同药物对细胞增殖和毒性的影响。
实验方法：1. 细胞培养：选取人类肝癌细胞株HepG2，进行细胞培养，细胞密度控制在5×10^4/ml。
2. 药物处理：将不同浓度的药物溶液加入培养基中，与细胞一起培养。
3. MTT实验：培养一定时间后，加入MTT试剂，使其与细胞代谢产物形成可溶性紫色产物。
4. 溶解产物：去除培养基，加入DMSO将产物溶解。
5. 测定吸光度：用酶标仪测定产物的吸光度，以评估细胞的代谢活性和药物的毒性作用。
实验结果：通过MTT实验，我们发现不同药物对HepG2细胞的影响存在一定差异。
在低浓度下，某些药物能够促进细胞的增殖，而高浓度下则表现出明显的毒性作用。
其中，药物A在低浓度下对细胞的增殖有一定促进作用，但在高浓度下表现出明显的细胞毒性；而药物B则在低浓度下对细胞增殖无明显影响，但在高浓度下能够抑制细胞的增殖。
这些结果为我们进一步研究药物的毒性和治疗效果提供了重要参考。
结论：MTT实验是一种简便、可靠的细胞代谢活性检测方法，能够快速评估药物对细胞增殖和毒性的影响。
通过本次实验，我们发现不同药物在不同浓度下对细胞的影响存在一定差异，这为药物的临床应用提供了重要参考。
希望通过进一步研究，能够发现更多具有治疗潜力的药物，并为临床治疗提供更多选择。
mtt实验报告
mtt实验报告MTT实验报告引言：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种广泛应用于生物学实验中的化合物。
它具有一种特殊的性质，即可以通过还原型脱氢酶酶促反应，将Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT）还原为可溶性的紫色产物。
这一反应可以用来评估细胞的代谢活性和细胞存活率。
本实验旨在分析MTT实验的原理、操作步骤以及结果解读，并探讨其在生物学研究中的应用。
一、实验原理：MTT实验的原理基于细胞的代谢活性。
MTT溶液在细胞内被还原为可溶性的紫色产物，其浓度与细胞代谢活性成正比。
通过测量产物的吸光度，可以评估细胞的存活率和细胞毒性。
二、实验步骤：1. 细胞预处理：将需要研究的细胞培养在含有适当培养基的培养皿中，并在恒温恒湿的培养箱中孵育至细胞黏附于培养皿底部。
2. 添加MTT溶液：将MTT溶液加入培养皿中，使其与细胞接触。
MTT溶液的浓度和作用时间可以根据实验需要进行调整。
3. 细胞溶解：将MTT溶液去除，加入溶解剂（如DMSO）溶解细胞内的紫色产物。
4. 吸光度测量：将溶解后的细胞溶液转移到96孔板中，使用酶标仪测量吸光度。
吸光度越高，代表细胞的存活率越高。
三、结果解读：MTT实验的结果通常以吸光度值表示。
通过比较实验组与对照组的吸光度值，可以得出以下结论：1. 细胞存活率：实验组与对照组吸光度值的比较可以反映细胞的存活率。
如果实验组的吸光度值较高，说明细胞存活率较高；反之，说明细胞存活率较低。
2. 细胞毒性：若实验组的吸光度值明显低于对照组，说明实验物质对细胞产生了毒性作用。
3. 药物筛选：MTT实验可以用于药物的筛选。
通过比较不同药物处理组的吸光度值，可以评估药物的效果和毒性。
四、MTT实验的应用：1. 细胞增殖和生长研究：MTT实验可以用于评估细胞的增殖和生长情况，对于研究细胞周期和细胞增殖相关的疾病具有重要意义。
MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法,其检测原理
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，它的特点是灵敏度高、经济。
学术术语来源---Bio-gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化文章亮点：1 实验先采用全骨髓血培养法培养犬骨髓间充质干细胞，继而采用贴壁筛选纯化，方法简便，所获细胞数量及纯度满意，并在体外成功诱导分化出软骨细胞。
2 实验所采用的细胞支架材料为瑞士Geistlich公司生产Bio-gide胶原膜，这是一种由Ⅰ型和Ⅲ型胶原组成复合材料，分为致密层和疏松层，种子细胞接种在胶原膜的较为粗糙的疏松层，而光滑的致密层在体内实验中朝向关节腔，有利于骨髓间充质干细胞的黏附、生长及向软骨细胞的分化，三维立体培养有助于诱导生成的软骨细胞维持表型。
3 实验显示Bio-gide胶原膜与骨髓间充质干细胞复合培养有良好的生物相容性，但能否体内构建组织工程软骨组织，促进软骨细胞的生长，缺损的软骨组织得到完整的修复，尚待进一步研究。
关键词：生物材料；组织工程软骨材料；膜生物材料；骨髓间充质干细胞；Bio-gide胶原膜；组织工程；股骨头坏死；软骨缺损；种子细胞；国家科学自然基金摘要背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。
目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。
方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞，观察细胞形态学变化，以细胞表面抗原进行鉴定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
【整理总结】关于MTT实验总结－－心血啊！MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan 结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
MTT步骤如下：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。
把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。
要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。
代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025有一个公式可供参考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率例：用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。
我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。
一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显.MTT试验的一些细节问题(一)细胞1.选择适当的细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4.培养时间。
200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。
用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。
由于试验本底增加，会试验敏感性。
因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。
在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
(二)实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm 处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100?(储存液100 1640）。
2.置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3.每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4.离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
(三)MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方:Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 调ph 7.4 定容1L(四)关于细胞的接种(铺板)细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。
如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。
且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。
故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。
悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.其它的声音：1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。
尤其是对于肿瘤细胞。
10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。
2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。
特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。