_半乳糖苷酶水解底物的特异性及其在保育猪日粮中的应用_张波
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钙/% 磷/%
含量 87.50 20.20 14.61 0.78 1.42 0.80 0.67
注：（1）预混料为每千克日粮提供维生素 A 500 KIU，维生素 D3 150 KIU，维生素 E 1500 IU，维生 素 K3 300 mg，维生素 B1 100 mg，维生素 B2 300 mg，维生素 B6 150 mg，维生素 B12 1 mg，烟酸 2000 mg， 泛酸 1200 mg，叶酸 65 mg，生物素 4 mg，氯化胆碱 40 g，锰 1.9 g，锌 7.7 g，铜 20 ～ 25 mg，Fe 7.5 g， 硒 40 mg，碘 48 mg；（2）除消化能外，其他值均为实测值。
基金项目： 北京市科学技术研究院萌芽计划资助项目 （2011-5） * 通讯作者
的酶， 这些寡糖在大肠被寄居在大肠内的微生物 发酵， 引起胃肠胀气 （Karr-Lilienthal 等，2005）。 α-半乳糖苷酶主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖 和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解 （Brouns 等 ， 2006）。 不同来源的 α-半乳糖苷酶其酶学性质不 同，降解 α-半乳糖苷的能力也不同。 因此，研究其 水解底物的特异性具有重要的意义。 α-半乳糖苷 酶在猪上的研究报道较少，并且日粮中添加 α-半 乳糖苷酶对动物生长性能影响研究结果不尽相 同。 因此，本试验研究了青霉来源 α-半乳糖苷酶 水解棉子糖类寡糖的特异性， 并在此基础上验证 在保育猪上的应用效果。
表 1 保育猪日粮组成及营养水平
日粮组成 玉 米 /% 带 皮 豆 粕 /% 豆 油 /% 磷 酸 氢 钙 /% 石 粉 /% 预 混 料 /% 赖 氨 酸 /% 氯 化 钠 /%
含量 53.00 36.40 6.00 1.70 1.05 1.00 0.55 0.30
营养水平 干 物 质 /% 粗 蛋 白 质 /% 消 化 能 / （MJ/kg ） 蛋 氨 酸 + 胱 氨 酸 /% 赖 氨 酸 /%
D- 半 乳 糖 释 放 量 /μg 503.6 259.3 177.8
糖 水 解 率 /% 95.7 72.5 32.9
蜜二糖
500
Leabharlann Baidu
半 乳 糖 含 量 /（μg/mL）
400
300
棉子糖
200
水苏糖
100
0
0
4
8
12
16
水 解 时 间 /h
图 1 寡糖水解曲线
2.2 α- 半 乳 糖 苷 酶 对 保 育 猪 生 长 性 能 的 影 响
表明，加酶组平均日增重 641 g，比不加酶组提高了 9.8 %（P = 0.015）；与对照组相比，加酶组饲料转化率提高了 10.1 %
（P = 0.020）；两组之间平均日采食量差异不显著（P = 0.944）。总之，α-Gal 可以有效地降解棉子糖类寡糖，保育猪玉米-
豆粕基础日粮中添加 300 U/kg α-Gal 显著提高了平均日增重和饲料转化率。
mined by the ion chromatography.The results showed that：the α-galactosidase hydrolyzed 95.7 % melibiose，72.5 % raffi-
nose and 32.9 % stachyose.Experiment 2： 72 pigs were placed in 12 pens of 6 pigs each and allocated to 2 diets.Treat-
棉子糖和水苏糖是豆粕中含 α-半乳糖苷的
主要抗营养因子，底物特异性试验结果表明，青霉
来源的 α-半乳糖苷酶对于天然的寡糖底物有特
20
中国饲料
2013 年第 1 期
表 3 α-半乳糖苷酶 对保育猪生长性能的影响
组别
初 重 /kg
末 重/kg
ADG/g
ADFI/g
F/G
对照组 12.45 ± 0.24 24.72 ± 0.67a 584 ± 36a 886.3 ± 36.6 1.52 ± 0.1a
2013 年第 1 期
中国饲料
19
1 材料与方法 1.1 水解底物特异性试验 1.1.1 底物及试验用酶 蜜二糖、 棉子糖和水苏 糖均购于 Sigma 公司。 α-半乳糖苷酶由重组青霉 α-半 乳 糖 苷 酶 菌 株 液 态 发 酵 所 得 ，每 毫 升 发 酵 上 清液活性 600 U。
酶活定义：在 40 ℃、pH 5.2 的条件下，每分钟 从浓度为 10 mmol/L 的对硝基苯基-α-D-吡喃半 乳糖苷（pNPG）溶液中降解释放 1 μmol 的对硝基 酚所需要的酶量为 1 个酶活单位（U）。 1.1.2 水 解 反 应 及 产 物 的 测 定 1 mL 浓 度 为 1.0 mg/mL 的 蜜 二 糖 、棉 子 糖 和 水 苏 糖 （柠 檬 酸磷酸缓冲液，pH 5.2） 分别与 3 U 的 α-半乳糖苷 酶液于 37 ℃孵育 16 h，同时 3 U 的酶液煮沸 5 min 灭活作为负对照。 水解低聚糖释放的半乳糖通过 离 子 色 谱 （DIONEX，ICS-3000）CARBOPAC PA10 高效阴离子交换柱（4 mm × 250 mm）和安培计进 行 检 测 。 流 动 相 是 23 mmol/L NaOH， 流 速 是 1.0 mL/min。 1.2 动物试验 1.2.1 试验设计 72 头平均体重（12.5 ± 0.2） kg 的杜×长×大公猪随机分到 12 个 猪圈中， 每圈 6 头。日粮参照《中华人民共和国农业行业标准— —— 猪 饲 养 标 准 》（2004）推 荐 的 营 养 需 要 进 行 配 制 ，日 粮组成及营养水平见表 1。 试验期为 3 周。 日粮不 添加任何抗生素，以粉料饲喂。 所有猪自由采食、 饮水。试验共设两个处理，空白对照组饲喂基础日 粮 ， 加 酶 组 在 基 础 日 粮 基 础 上 添 加 300 U/kg 的 α-Gal。所用的酶是液态发酵，发酵液于 4 ℃离心， 分离得到的上清液用稻糠壳吸附，自然风干，酶活 为 1200 U/g。 1.2.2 测定指标 在试验第 21 天，所有猪以圈为 单位称重，记录采食量，计算日增重（ADG），料 重 比及日采食量（ADFI）。 1.2.3 统 计 分 析 试 验 数 据 以 圈 为 单 位 进 行 统 计 ，采 用 SAS（8.0）单 因 子 方 差 分 析 ，以 P ＜ 0.05 为差异显著水平。 2 结果与分析 2.1 α-半乳糖苷酶 水解底 物 的 特 异 性 由 表 2 和图 1 可知，α-Gal 对蜜二糖的降解效率最高，棉 子糖以及水苏糖也可不同程度被降解。 水解反应 2 h 时，蜜二糖水解释放出的 D-半乳糖占总量的
18 科学实验研究
中国饲料
2013 年第 1 期
α-半乳糖苷酶水解底物的特异性 及其在保育猪日粮中的应用
北京市营养源研究所 张 波 王继强 张宝彤 *
[摘要] 为研究 α-半乳糖苷酶水解底物的特异性及日粮中添加与 α-半乳糖苷酶(α-Gal)对保育猪生长的影响，进
行了两个试验。 试验一：1 mL 浓度为 1.0 mg/mL 的蜜二糖、棉子糖和水苏糖分别与 3 U 的 α-Gal 于 37 ℃孵育 16 h，用
[关键词] α-半乳糖苷酶；底物特异性；保育猪；生长性能
[中图分类号] S816.7
[文献标识码] A
[文章编号] 1004-3314（2013）01-0018-03
[Abstract] Two experiments were conducted to study the substrate specificity of α-galactosidase and its application
60 %；水解反应 4 h，蜜 二糖、棉子糖 和水 苏 糖 水 解释放的 D-半乳糖量占总 释放量的 80 %以上。 由表 2 可见，在实验室条件下，蜜二糖、棉子糖和 水苏糖水解率分别为 95.7 %、72.5 %和 32.9 %。
表 2 α-半乳糖苷酶的底物特异性
底物 蜜二糖 棉子糖 水苏糖
酶 用 量 /U 3.0 3.0 3.0
离子色谱检测释放的 α-D-半乳糖。 结果表明，α-Gal 可以水解 95.7 %的蜜二糖，72.5 %的棉子糖以及 32.9 %的水苏糖。
试验二：选用 72 头平均体重为（12.5 ± 0.2）kg 的仔猪为研究对象，分为 2 个处理，每个处理 6 个重复，每个重复 6 头猪，
研究 α-Gal 对保育猪生长的影响。 处理 1 为对照组，处理 2 在对照组的基础上添加 300 U/kg 的 α-Gal。 21 d 试验结果
9.8 % compared with the control （P = 0.015）， and the feed conversion ratio （FCR） was improved by 10.1 % （P =
0.020）.There was no difference on average feed intake between treatment 1 and treatment 2.In all，α-galactosidase could
α-半乳糖苷是由一个蔗糖单位和 1 ～ 4 个 α-半乳糖残基通过 α-1，6-糖苷键连接构成的小 分子低聚糖，分别生成棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖 和筋骨草糖，通称为棉子糖。通常，大豆籽实、脱脂 大豆（Kuo 等，1988）及豆 粕（Grieshop 等，2003）中 含有 52.4 ～ 74.4 mg/kg 的 α-半乳糖苷。 Kuriyama 和 Mendel（1917）首次研究报道了 α-半乳糖苷的 抗营养作用。 单胃动物肠道黏膜缺乏降解棉子糖
加酶组 12.55 ± 0.18 26.02 ± 0.51b 641 ± 31b 885 ± 26 1.38 ± 0.07b
P值
0.443
0.004
0.015
0.944
0.020
注：同列数据标有不同字母者表示组间差异显著（P ＜ 0.05），无字母者表示差异不显著（P ＞ 0.05）。
异性的水解作用， 可以水解绝大多数蜜二糖及大 部分的棉子糖，而水解水苏糖的能力最差，其趋势 是随着寡糖链长度的增加水解能力逐渐减弱，这 与Somiari 和 Balogh （1995） 的 报 道 相 一 致 。 而 Manzanares 等（1998）研究报道，Aniger 产生的 α半乳糖苷酶可以降解人工合成的底物 （pNPG）和 天然的底物，如棉子糖、水苏糖和蜜二糖，且随着 寡糖链长度的增加，水解释放半乳糖的能力增强。 重组 α-半乳糖苷酶水解底物的差异，其原因可能 是产生酶的菌株不同，酶的最适 pH、温度也不同， 因而降解底物的能力也有差异。不难看出，不同来 源的 α-半乳糖苷酶水解底物的能力不同，水解底 物有选择性。
ment 1 was the control，and treatment 2 was on the basis of the control supplemented with 300 U/kg α-galactosidase.Pigs
were fed for 3 weeks.The results over 21 days showed that：the average daily gain （ADG） was 641 g，which increased by
由表 3 可知，整个试验期猪生长良好。日粮中添加
300 U/kg 的 α-半乳糖苷 酶显著提高 了保育猪平
均日增重（ADG），与对照组相比 ，加酶组 ADG 提
高 9.76 %（P = 0.015）；加酶组料重比较对照组降
低 9.21 %（P = 0.020）；平均日采食量两组间无显
著性差异。
3 讨论
in nursery pigs feed.Experiment 1： 1 mL melibiose，raffinose，and stachyose （1 mg/mL） mixed with 3 U the recombinant
α-galactosidase were incubated at 37 ℃ for 16 h, respectively.The galactose released from oligosaccharides was deter-
hydrolyze sufficiently the oligogalactoside，and improve ADG and FCR by adding 300 U/kg α-galactosidase in the corn-
soybean meal basal diets.
[Key words] α-galactosidase；substrate specificity；nursery pigs；growth performance
含量 87.50 20.20 14.61 0.78 1.42 0.80 0.67
注：（1）预混料为每千克日粮提供维生素 A 500 KIU，维生素 D3 150 KIU，维生素 E 1500 IU，维生 素 K3 300 mg，维生素 B1 100 mg，维生素 B2 300 mg，维生素 B6 150 mg，维生素 B12 1 mg，烟酸 2000 mg， 泛酸 1200 mg，叶酸 65 mg，生物素 4 mg，氯化胆碱 40 g，锰 1.9 g，锌 7.7 g，铜 20 ～ 25 mg，Fe 7.5 g， 硒 40 mg，碘 48 mg；（2）除消化能外，其他值均为实测值。
基金项目： 北京市科学技术研究院萌芽计划资助项目 （2011-5） * 通讯作者
的酶， 这些寡糖在大肠被寄居在大肠内的微生物 发酵， 引起胃肠胀气 （Karr-Lilienthal 等，2005）。 α-半乳糖苷酶主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖 和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解 （Brouns 等 ， 2006）。 不同来源的 α-半乳糖苷酶其酶学性质不 同，降解 α-半乳糖苷的能力也不同。 因此，研究其 水解底物的特异性具有重要的意义。 α-半乳糖苷 酶在猪上的研究报道较少，并且日粮中添加 α-半 乳糖苷酶对动物生长性能影响研究结果不尽相 同。 因此，本试验研究了青霉来源 α-半乳糖苷酶 水解棉子糖类寡糖的特异性， 并在此基础上验证 在保育猪上的应用效果。
表 1 保育猪日粮组成及营养水平
日粮组成 玉 米 /% 带 皮 豆 粕 /% 豆 油 /% 磷 酸 氢 钙 /% 石 粉 /% 预 混 料 /% 赖 氨 酸 /% 氯 化 钠 /%
含量 53.00 36.40 6.00 1.70 1.05 1.00 0.55 0.30
营养水平 干 物 质 /% 粗 蛋 白 质 /% 消 化 能 / （MJ/kg ） 蛋 氨 酸 + 胱 氨 酸 /% 赖 氨 酸 /%
D- 半 乳 糖 释 放 量 /μg 503.6 259.3 177.8
糖 水 解 率 /% 95.7 72.5 32.9
蜜二糖
500
Leabharlann Baidu
半 乳 糖 含 量 /（μg/mL）
400
300
棉子糖
200
水苏糖
100
0
0
4
8
12
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水 解 时 间 /h
图 1 寡糖水解曲线
2.2 α- 半 乳 糖 苷 酶 对 保 育 猪 生 长 性 能 的 影 响
表明，加酶组平均日增重 641 g，比不加酶组提高了 9.8 %（P = 0.015）；与对照组相比，加酶组饲料转化率提高了 10.1 %
（P = 0.020）；两组之间平均日采食量差异不显著（P = 0.944）。总之，α-Gal 可以有效地降解棉子糖类寡糖，保育猪玉米-
豆粕基础日粮中添加 300 U/kg α-Gal 显著提高了平均日增重和饲料转化率。
mined by the ion chromatography.The results showed that：the α-galactosidase hydrolyzed 95.7 % melibiose，72.5 % raffi-
nose and 32.9 % stachyose.Experiment 2： 72 pigs were placed in 12 pens of 6 pigs each and allocated to 2 diets.Treat-
棉子糖和水苏糖是豆粕中含 α-半乳糖苷的
主要抗营养因子，底物特异性试验结果表明，青霉
来源的 α-半乳糖苷酶对于天然的寡糖底物有特
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中国饲料
2013 年第 1 期
表 3 α-半乳糖苷酶 对保育猪生长性能的影响
组别
初 重 /kg
末 重/kg
ADG/g
ADFI/g
F/G
对照组 12.45 ± 0.24 24.72 ± 0.67a 584 ± 36a 886.3 ± 36.6 1.52 ± 0.1a
2013 年第 1 期
中国饲料
19
1 材料与方法 1.1 水解底物特异性试验 1.1.1 底物及试验用酶 蜜二糖、 棉子糖和水苏 糖均购于 Sigma 公司。 α-半乳糖苷酶由重组青霉 α-半 乳 糖 苷 酶 菌 株 液 态 发 酵 所 得 ，每 毫 升 发 酵 上 清液活性 600 U。
酶活定义：在 40 ℃、pH 5.2 的条件下，每分钟 从浓度为 10 mmol/L 的对硝基苯基-α-D-吡喃半 乳糖苷（pNPG）溶液中降解释放 1 μmol 的对硝基 酚所需要的酶量为 1 个酶活单位（U）。 1.1.2 水 解 反 应 及 产 物 的 测 定 1 mL 浓 度 为 1.0 mg/mL 的 蜜 二 糖 、棉 子 糖 和 水 苏 糖 （柠 檬 酸磷酸缓冲液，pH 5.2） 分别与 3 U 的 α-半乳糖苷 酶液于 37 ℃孵育 16 h，同时 3 U 的酶液煮沸 5 min 灭活作为负对照。 水解低聚糖释放的半乳糖通过 离 子 色 谱 （DIONEX，ICS-3000）CARBOPAC PA10 高效阴离子交换柱（4 mm × 250 mm）和安培计进 行 检 测 。 流 动 相 是 23 mmol/L NaOH， 流 速 是 1.0 mL/min。 1.2 动物试验 1.2.1 试验设计 72 头平均体重（12.5 ± 0.2） kg 的杜×长×大公猪随机分到 12 个 猪圈中， 每圈 6 头。日粮参照《中华人民共和国农业行业标准— —— 猪 饲 养 标 准 》（2004）推 荐 的 营 养 需 要 进 行 配 制 ，日 粮组成及营养水平见表 1。 试验期为 3 周。 日粮不 添加任何抗生素，以粉料饲喂。 所有猪自由采食、 饮水。试验共设两个处理，空白对照组饲喂基础日 粮 ， 加 酶 组 在 基 础 日 粮 基 础 上 添 加 300 U/kg 的 α-Gal。所用的酶是液态发酵，发酵液于 4 ℃离心， 分离得到的上清液用稻糠壳吸附，自然风干，酶活 为 1200 U/g。 1.2.2 测定指标 在试验第 21 天，所有猪以圈为 单位称重，记录采食量，计算日增重（ADG），料 重 比及日采食量（ADFI）。 1.2.3 统 计 分 析 试 验 数 据 以 圈 为 单 位 进 行 统 计 ，采 用 SAS（8.0）单 因 子 方 差 分 析 ，以 P ＜ 0.05 为差异显著水平。 2 结果与分析 2.1 α-半乳糖苷酶 水解底 物 的 特 异 性 由 表 2 和图 1 可知，α-Gal 对蜜二糖的降解效率最高，棉 子糖以及水苏糖也可不同程度被降解。 水解反应 2 h 时，蜜二糖水解释放出的 D-半乳糖占总量的
18 科学实验研究
中国饲料
2013 年第 1 期
α-半乳糖苷酶水解底物的特异性 及其在保育猪日粮中的应用
北京市营养源研究所 张 波 王继强 张宝彤 *
[摘要] 为研究 α-半乳糖苷酶水解底物的特异性及日粮中添加与 α-半乳糖苷酶(α-Gal)对保育猪生长的影响，进
行了两个试验。 试验一：1 mL 浓度为 1.0 mg/mL 的蜜二糖、棉子糖和水苏糖分别与 3 U 的 α-Gal 于 37 ℃孵育 16 h，用
[关键词] α-半乳糖苷酶；底物特异性；保育猪；生长性能
[中图分类号] S816.7
[文献标识码] A
[文章编号] 1004-3314（2013）01-0018-03
[Abstract] Two experiments were conducted to study the substrate specificity of α-galactosidase and its application
60 %；水解反应 4 h，蜜 二糖、棉子糖 和水 苏 糖 水 解释放的 D-半乳糖量占总 释放量的 80 %以上。 由表 2 可见，在实验室条件下，蜜二糖、棉子糖和 水苏糖水解率分别为 95.7 %、72.5 %和 32.9 %。
表 2 α-半乳糖苷酶的底物特异性
底物 蜜二糖 棉子糖 水苏糖
酶 用 量 /U 3.0 3.0 3.0
离子色谱检测释放的 α-D-半乳糖。 结果表明，α-Gal 可以水解 95.7 %的蜜二糖，72.5 %的棉子糖以及 32.9 %的水苏糖。
试验二：选用 72 头平均体重为（12.5 ± 0.2）kg 的仔猪为研究对象，分为 2 个处理，每个处理 6 个重复，每个重复 6 头猪，
研究 α-Gal 对保育猪生长的影响。 处理 1 为对照组，处理 2 在对照组的基础上添加 300 U/kg 的 α-Gal。 21 d 试验结果
9.8 % compared with the control （P = 0.015）， and the feed conversion ratio （FCR） was improved by 10.1 % （P =
0.020）.There was no difference on average feed intake between treatment 1 and treatment 2.In all，α-galactosidase could
α-半乳糖苷是由一个蔗糖单位和 1 ～ 4 个 α-半乳糖残基通过 α-1，6-糖苷键连接构成的小 分子低聚糖，分别生成棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖 和筋骨草糖，通称为棉子糖。通常，大豆籽实、脱脂 大豆（Kuo 等，1988）及豆 粕（Grieshop 等，2003）中 含有 52.4 ～ 74.4 mg/kg 的 α-半乳糖苷。 Kuriyama 和 Mendel（1917）首次研究报道了 α-半乳糖苷的 抗营养作用。 单胃动物肠道黏膜缺乏降解棉子糖
加酶组 12.55 ± 0.18 26.02 ± 0.51b 641 ± 31b 885 ± 26 1.38 ± 0.07b
P值
0.443
0.004
0.015
0.944
0.020
注：同列数据标有不同字母者表示组间差异显著（P ＜ 0.05），无字母者表示差异不显著（P ＞ 0.05）。
异性的水解作用， 可以水解绝大多数蜜二糖及大 部分的棉子糖，而水解水苏糖的能力最差，其趋势 是随着寡糖链长度的增加水解能力逐渐减弱，这 与Somiari 和 Balogh （1995） 的 报 道 相 一 致 。 而 Manzanares 等（1998）研究报道，Aniger 产生的 α半乳糖苷酶可以降解人工合成的底物 （pNPG）和 天然的底物，如棉子糖、水苏糖和蜜二糖，且随着 寡糖链长度的增加，水解释放半乳糖的能力增强。 重组 α-半乳糖苷酶水解底物的差异，其原因可能 是产生酶的菌株不同，酶的最适 pH、温度也不同， 因而降解底物的能力也有差异。不难看出，不同来 源的 α-半乳糖苷酶水解底物的能力不同，水解底 物有选择性。
ment 1 was the control，and treatment 2 was on the basis of the control supplemented with 300 U/kg α-galactosidase.Pigs
were fed for 3 weeks.The results over 21 days showed that：the average daily gain （ADG） was 641 g，which increased by
由表 3 可知，整个试验期猪生长良好。日粮中添加
300 U/kg 的 α-半乳糖苷 酶显著提高 了保育猪平
均日增重（ADG），与对照组相比 ，加酶组 ADG 提
高 9.76 %（P = 0.015）；加酶组料重比较对照组降
低 9.21 %（P = 0.020）；平均日采食量两组间无显
著性差异。
3 讨论
in nursery pigs feed.Experiment 1： 1 mL melibiose，raffinose，and stachyose （1 mg/mL） mixed with 3 U the recombinant
α-galactosidase were incubated at 37 ℃ for 16 h, respectively.The galactose released from oligosaccharides was deter-
hydrolyze sufficiently the oligogalactoside，and improve ADG and FCR by adding 300 U/kg α-galactosidase in the corn-
soybean meal basal diets.
[Key words] α-galactosidase；substrate specificity；nursery pigs；growth performance