犬免疫球蛋白EIgE酶联免疫分析ELISA

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ELISA及相关免疫分析技术

ELISA及相关免疫分析技术ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme-linked immunosorbent assay）是一种常用的免疫分析技术，用于检测和定量测定生物样本中的抗体或抗原。

ELISA是体外实验室诊断的重要工具，广泛应用于临床诊断、药物研发、环境监测和农业科学等领域。

ELISA的基本原理是利用抗原-抗体反应的特异性来检测和测定样品中的目标物。

ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接荧光ELISA等不同的变种方法。

下面将分别介绍这些方法的原理和应用。

1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法。

它使用固定在微孔板上的抗原与待测样品中的抗体结合，然后通过一个与抗体特异结合的酶标记二抗进行检测。

该方法适用于检测样品中的抗体。

2.间接ELISA：间接ELISA是一种常见的ELISA方法，用于检测样品中的抗原。

它首先在微孔板上固定抗原，接着加入待测样品，样品中的抗原与固定的抗原结合。

然后通过加入与抗体特异结合的二抗来检测抗原，该二抗被酶标记，在添加相应底物后可以通过测量底物的反应来定量抗原。

3.竞争ELISA：竞争ELISA用于测量样品中抗原或抗体的浓度。

它通过在固定在微孔板上的抗原与待测样品中的抗原或抗体竞争结合，来测定样品中的目标物浓度。

4.间接荧光ELISA：间接荧光ELISA是利用荧光信号来检测和测定样品中的抗体或抗原。

它与间接ELISA的原理类似，不同的是二抗被标记上荧光物质，通过测量荧光信号来定量目标物。

ELISA具有许多优点，例如灵敏度高、特异性强、操作简单、快速和成本低廉等。

它广泛应用于临床诊断中，如检测患者体液中的病原体抗体或抗原、监测药物浓度和筛选疫苗候选物。

此外，ELISA还可以应用于食品安全检测、环境监测和生物学研究等领域。

总而言之，ELISA是一种重要的免疫分析技术，广泛应用于不同领域的科学研究和临床实践中。

它的原理简单易懂，操作方便，同时具有高灵敏度和特异性，因此被认为是一种高度可靠和有效的生物分析工具。

酶联免疫试剂盒elisa原理

酶联免疫试剂盒elisa原理
酶联免疫试剂盒（ELISA）是一种常用的生物化学检测方法，通常用于检测血清中某种特定的蛋白质或分子。

其原理如下：
1. 血清处理：血清样品需要进行预处理，例如稀释、蛋白质纯化等步骤。

2. 固定抗体：在试验板的孔中涂上特异性的抗原抗体，它们能够特异性地结合要检测的蛋白质。

3. 样品加入：将处理后的血清样品加入到试验孔中，样品中的目标蛋白质会与固定在孔中的抗体结合。

4. 清洗：将孔中的样品去除，并进行多次洗涤，以去除非特异性结合的成分。

5. 探针抗体加入：加入与目标蛋白质结合并标记有酶的探针抗体，这些抗体会特异性地结合在目标蛋白质上。

6. 再次清洗：将无法结合的探针抗体去除，并进行多次洗涤。

7. 反应溶液加入：加入适当的底物（如染色剂），使酶与底物发生反应，产生可视的信号（如颜色变化）。

8. 信号检测：通过光密度仪或其他相关仪器测量底物的反应产物的吸光度，将其转换为相对的蛋白质含量，从而得出目标蛋白质的相对浓度。

ELISA试剂盒原理的关键步骤是固相法，即将抗原或抗体固定在试验孔表面，从而使其能够与待检测物质特异性地结合。

通过结合酶标记的探针抗体和底物的反应，可以将待检测物质转换为可视的信号，并通过测量该信号的强度来确定目标物质的浓度。

酶联免疫吸附试验(ELISA)测定错误结果的原因分析

ELISA测定错误结果的原因分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。

Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。

ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。

ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。

血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种：1．内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。

常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。

（1）类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。

酶联免疫吸附(ELISA)试验的标准操作规程

酶联免疫吸附（ELISA）试验的标准操作规程（编号：002）1.目的该SOP是利用抗原抗体特异性结合的原理，将待检抗体/抗原和酶标抗原/抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原/抗体起反应。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，利用颜色反应放大反应效果从而定性或定量分析，从而使测定方法达到很高的敏感度。

2.适用范围该SOP适用于测定抗原抗体的匹配程度，血清中的抗体滴度，利用已知抗体判定未知蛋白的生物学特性等。

3.主要仪器酶标仪、洗板机、酶联条、微量移液器4.试剂0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液、0.15 M pH 7.4 PBST、稀释液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、底物反应液A、底物反应液B、终止液（2 M H2SO4）具体的制备步骤见附件。

5.操作步骤5.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）常规操作5.1.1将重组蛋白用包被缓冲液按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释后，每孔加100μL，设两排平行孔和阴性对照孔，4℃过夜包被（12-18h）或37℃包被5h。

5.1.2 次日用封闭液 37℃封闭1h，PBST洗涤3次，每次2min。

5.1.3 加入100μL用稀释液1:1000稀释的一抗，37℃温育30min，再用PBST洗涤后，每次2min。

5.1.4 加入100μL 1:1000稀释的HRP标记的二抗兔抗马IgG，37℃温育15min，洗涤后分别加入ELISA显色A液和B液，各50μL，5min后再加入50μL终止液，最后测定其A450nm，以测定孔与阴性对照孔A450nm＞2.1判为阳性。

5.2 其他模式酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤5。

ELISA(酶联免疫吸附测定)实验报告

ELISALin Chengyu Bio 04 2010030007Experiment Date: 2012-03-12 Submitting Date: 2012-03-211Introduction1.1Background informationELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is a solid-phase assay for antibodiesemploying ligands labeled with enzymes which is widely used for immunological assays.This technique can be applied to detect antigens or antibodies for qualitative orquantitative purpose. Since enzyme reactions are very well known amplificationprocesses, the signal is generated by enzymes which are linked to the detection reagentsin fixed proportions to allow accurate quantification.11.2Major principlesFigure 1 Schematic diagram of ELISA2Figure 2 Procedure of indirect ELISA3As shown in Figure 1 & 2, the general procedure of indirect ELSIA is to: incubate theplate well with antigen, wash off unbounded antigen, incubate with 1st antibody, washoff unbounded 1st antibody, incubate with labeled 2nd antibody, wash off unbounded 2ndantibody, incubate with enzyme substrate solution, and detect optical density or otherindex showing enzyme activity.2Experiment Operation2.1Antigen coating(1)Prepare an antigen solution in coating buffer (human IgG at 0.025mg/ml);(2)Pipette 200 μl antigen solution to each well (Row: B~G; Column: 2~10; Column 11is negative control without antigen) of the microtiter plate;(3)Incubate the plate at 37 ℃for 30 min;(4)Remove the antigen solution;(5)Wash each well with 200 μl with PBS-T for 3 times;(6)Block each well (Row: B~G; Column: 2~11) with 200 μl 0.5% BSA-PBS, andincubate the plate at 37 ℃for 30 min;(7)Remove the blocking solution;(8)Wash each well with 200 μl with PBS-T for 3 times.2.2Primary antibody reaction(1)Dilute the primary antibody (rabbit-anti-human IgG antiserum) in PBS-T fordifferent dilution (from 1:400 to 1:51,200 in 2-folds dilution);(2)Add 200 μl diluted antibody solution to each well following Table 1;Table 1 Scheme to add primary antibody(3)Incubate the plate at 37 ℃for 1 hour;(4)Remove the primary antibody solution;(5)Wash each well with 200 μl PBS-T for 3 times.2.3Application of secondary antibody(1)Dilute the peroxidase conjugated secondary antibody (Goat-anti-rabbit IgG-HRP) inPBS-T at the dilution of 1:20,000 and 1:40,000;(2)Add 200 μl secondary antibody solution to each well following Table 2;(3)Incubate the plate at 37 ℃for 1 hour;(4)Remove the secondary antibody solution;(5)Wash each well with 200 μl PBS-T for 3 times.2.4Substrate development(1)Add 200 μl substrate solution to each well (Row: B~G ,Column: 2~11);(2)Incubate for approximately 3 min;(3)Add 50 μl 2 M H2SO4 to each well to terminate the reaction;(4)Measure optical density at 490 nm.3Raw data and its processing3.1Raw data3.2Data processingSet Row B, C, and D as Group I, and Row E, F, and G as Group II. The processed datais shown in Table 4Table 4 Processed data: optical density of each groupSet different dilutions of primary antibody as x axis, optical density as y axis, drawFigure 3 to illustrate their relation.Figure 3 Relationship between optical density and dilutions of primary antibodyFor the reason that the curve cannot illustrate the relationship enough, change the x axis to nature logarithm of different dilutions of primary antibody. See Figure 4:Figure 4 Relationship between optical density and natural logarithm of dilutions of primary antibodyUsing linear fit for each group, we can figure out that two lines are approximately parallel.In the black curve in Figure 3, there is an oblivious point of inflection which corresponds with the dilution of 1:800. The curve after this point becomes flat, which indicates that the binding between antigens and primary antibodies is saturated in the dilution of 1:800 and higher. This data can suggest that in other immunoenzymatic experiment, the proper dilution of primary antibody will be around, and no higher than 1:800.What’s more, from the red line in Figure 4 we can figure out that the optical density hasa linear relation with natural logarithm of dilutions of the primary antibody.As for comparison between Group I and Group II, from Figure 3 we can figure out thatthe point of infection of blue curve, which corresponds with the dilution of 1:40,000, ison the left, about 1:1600.In Figure 4, the green line (1:40,000) is positioned lower than the red line (1:20,000),which is easy to understand. Lower concentration of secondary antibody means lessbinding with primary antibody during application of secondary antibody.4Results and discussion4.1Results(1)The optical density has an approximately linear relation with the natural logarithmof the dilutions of the primary antibody;(2)For secondary antibody in the dilution of 1:20,000, the proper dilution of primaryantibody is 1:800; for secondary antibody in the dilution of 1:40,000, primaryantibody is recommended to be 1:1600;(3)With the same dilution of antigen and primary antibody, higher concentration ofsecondary antibody will get a higher optical density;4.2Discussion(1)What is the significance of the negative control groups?I.The no primary antibody groups proved that there is no specific bindingbetween antigen and secondary antibody, and provided a background ofnon-specific binding between secondary antibody and antigen;II.The no antigen groups can provide a background of non-specific binding between primary antibody and BSA.(2)Why washing step is essential?Washing each well with PBS-T, which contains tween-20 as detergent, can wash offunbounded antigens and antibodies, including those non-specifically binding. Ifwashing step is omitted, the background index will be higher, and might causeinterference to the result.(3)Why blocking step is essential?After the antigen coating step, the surface of the well is not covered by antigenentirely, i.e. there is still some site leaving blank, which allows other proteins bindto them. Blocking step is to block those blank sites with non-specific bindingmaterial that will not cause interference to the experiment. Thus, the primaryantibody will only bind to the antigen coated in the first step, rather than coat on thesurface as well.(4)What’s the advantage of indirect ELISA comparing with direct ELISA?I.Indirect ELISA can amplify the optical density which we measure.Compared to direct ELISA, the number of secondary antibody binding tothe primary antibody is way larger than the number of primary antibodybinding to the antigen. Thus, optical density will be higher and easier tomeasure, which means a lower error;II.The secondary antibody contains HRP, which is essential for substrate development. Compared to direct ELISA, indirect ELISA need only onekind of antibody contains HRP to perform many kinds of experiment, ratherthan one antibody linked to enzyme for one experiment, which isinconvenient.5Reference【1】/wiki/ELISA【2】/post/9314400054【3】/indirect_elisa。

狗狗抗体检测的标准值

狗狗抗体检测是对狗狗免疫状态的评估，也是狗狗疾病预防与控制中非常重要的环节。

在进行狗狗抗体检测时，需要了解狗狗抗体检测的标准值及其含义，以便更好地理解检测结果和制定相应的预防措施。

一、什么是狗狗抗体？狗狗抗体是指狗狗体内产生的特异性免疫球蛋白，可以识别并结合相应的病原体，从而发挥免疫作用。

当狗狗接触到某种病原体后，免疫系统会产生相应的抗体，以保护狗狗免受疾病侵害。

因此，通过检测狗狗血清中的抗体水平，可以了解狗狗是否患有某种疾病或已经获得相应的免疫力。

二、狗狗抗体检测的方法狗狗抗体检测可以采用多种方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、凝集试验、中和试验等。

其中，ELISA是最常用的一种方法，具有操作简便、准确性高、灵敏度强等优点。

三、狗狗抗体检测的标准值狗狗抗体检测的标准值可以根据不同的疾病和检测方法而有所差异，下面以犬瘟热和犬传染性肝炎为例，详细介绍其标准值及其含义。

1. 犬瘟热抗体检测标准值犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度传染性疾病，严重危害狗狗的生命健康。

在进行犬瘟热抗体检测时，通常采用ELISA方法，其标准值如下：（1）阳性：抗体滴度≥1:32（2）弱阳性：抗体滴度为1:16（3）阴性：抗体滴度＜1:16其中，阳性表示狗狗已经获得了有效的免疫力，可以预防犬瘟热的侵害；弱阳性表示狗狗免疫力较低，需要进行补充免疫；阴性表示狗狗没有获得有效的免疫力，容易感染犬瘟热病毒。

2. 犬传染性肝炎抗体检测标准值犬传染性肝炎是由犬传染性肝炎病毒引起的一种犬类传染病，具有高度传染性和致死率。

在进行犬传染性肝炎抗体检测时，也采用ELISA方法，其标准值如下：（1）阳性：抗体滴度≥1:16（2）弱阳性：抗体滴度为1:8（3）阴性：抗体滴度＜1:8其中，阳性表示狗狗已经获得了有效的免疫力，可以预防犬传染性肝炎的侵害；弱阳性表示狗狗免疫力较低，需要进行补充免疫；阴性表示狗狗没有获得有效的免疫力，容易感染犬传染性肝炎病毒。

常见免疫学检测方法

常见免疫学检测方法免疫学检测方法是一种通过检测人体免疫系统中特定分子或细胞的存在、数量或功能来评估免疫系统状态的方法。

这些方法在临床诊断、药物研发和疾病监测等领域起着重要作用。

本文将介绍几种常见的免疫学检测方法。

一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常见的免疫学检测方法，广泛应用于疾病的诊断和研究中。

ELISA基于抗原与抗体的特异性结合原理，通过固相支持物上的抗原或抗体与待测样品中的相应抗体或抗原结合，然后用酶标记的二抗或二抗-抗体复合物来检测结合物质的存在。

ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便的特点，可用于检测多种物质，如病原体、抗体、激素等。

二、流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种利用激光技术对细胞进行快速、高通量的分析和分选的方法。

该方法通过将待测细胞标记上与特定抗原结合的荧光染料，然后通过激光束照射，测量细胞上荧光信号的强度和特征，以获得细胞的相关信息。

流式细胞术可用于细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。

此外，流式细胞术还可以进行单细胞分选，用于获得特定细胞亚群进行进一步的研究。

三、免疫组化免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过将抗体与待测组织中的特定抗原结合来检测抗原在组织中的分布和表达水平的方法。

免疫组化方法首先将待测组织样本进行处理，使其能够与抗体发生特异性反应，然后使用荧光染料、酶标记物或金标记物等标记抗体，通过显色或荧光信号来显示抗原的分布情况。

免疫组化方法可用于病理诊断、研究组织中特定蛋白的表达和定位等。

四、免疫电泳免疫电泳（Immunoelectrophoresis）是一种结合电泳和免疫学的方法，用于检测和鉴定蛋白质分子。

免疫电泳通过电泳将蛋白质在凝胶中分离，然后在凝胶上进行抗体与蛋白质的反应，形成免疫沉淀线，通过观察免疫沉淀线的形状和位置来判断蛋白质的类型和数量。

酶联免疫吸附剂测定ELISA实验报告及实验讨论

ELISA实验报告一、实验名称酶联免疫吸附测定二、实验原理在抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物中加入相应酶的底物，反应生成有色产物，然后借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。

待测抗体的定量与有色产生成正比。

三、实验材料与试剂1.抗原Human IgG (0.025mg/ul),一抗Rabbit-α-human IgG,二抗辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。

2.包被液，PBS溶液，封闭液，Tween-20 0.5mL蒸馏水稀释至100mL，邻苯二胺溶液，中止液。

3.聚苯乙烯微量细胞培养板，酶联免疫检测仪，取液器，烧杯，稀释用带凹槽的平板。

四、实验步骤1.将用包被液稀释好的Human IgG加入到培养板以B2至D10为对角线的矩形区域中，200ul/well，B11 C11 D11处不加抗原作为对照，然后在37℃下温育30分钟。

2.取出平板，倒尽液体，然后向B2至D11的矩形区域每个孔中加入200ul的PBS 洗涤液，然后倒掉，如此洗涤3次。

再将平板倒置在吸水纸上，使孔中液体流尽。

3.在B2到D10的矩形区域每个孔中加入0.5﹪的BSA溶液200ul，然后在37℃条件下温育30分钟。

4.Washing with PBS 200ul/well for three times。

具体步骤同步骤2。

5.将first antibody Rabbit-α-human IgG稀释成不同的浓度梯度，200ul/well 按下表加入到平板中。

其中B10 C10 D10不加一抗作为对照，然后incubate at7.在B2到D11的矩形区域中加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200ul，在37℃下温育30分钟。

8. Washing with PBS 200ul/well for three times。

具体步骤同步骤2。

9.向平板B2到D11的矩形区域中加入底物邻苯二胺溶液200ul/well。

10. 向平板B2到D11的矩形区域中加入终止液，每孔50ul。

免疫球蛋白的检测方法

免疫球蛋白的检测方法免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称Ig）是一类在机体免疫应答中起关键作用的蛋白质，它能够识别和结合抗原，参与免疫反应的调节和执行。

因此，对免疫球蛋白的检测具有重要的临床意义。

本文将介绍免疫球蛋白的检测方法，以及各种方法的优缺点和适用范围。

一、免疫球蛋白的定量检测方法。

1. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）。

ELISA法是一种常用的免疫球蛋白定量检测方法，其原理是利用酶标记抗体与待测血清中的免疫球蛋白结合，再通过底物的反应产生显色反应来定量测定免疫球蛋白的含量。

ELISA法操作简便，灵敏度高，且能够同时检测多个样本，因此被广泛应用于临床诊断和科研领域。

2. 免疫荧光法。

免疫荧光法是利用荧光标记的抗体与待测血清中的免疫球蛋白结合，再通过荧光显微镜观察荧光信号来定量测定免疫球蛋白的含量。

该方法操作简单，对样本的要求较低，且具有较高的特异性和灵敏度，适用于多种免疫球蛋白的检测。

二、免疫球蛋白的定性检测方法。

1. 免疫固定电泳法。

免疫固定电泳法是一种通过电泳分离待测血清中的免疫球蛋白亚型的方法。

该方法操作简便，能够快速、准确地对免疫球蛋白的亚型进行鉴定，对于某些免疫球蛋白病的诊断具有重要意义。

2. 免疫印迹法（Western Blot）。

免疫印迹法是一种通过将待测血清中的免疫球蛋白分离并转移至膜上，再通过特异性抗体的结合来检测免疫球蛋白的方法。

该方法具有高度的特异性和灵敏度，能够对免疫球蛋白进行准确的定性鉴定。

三、各种方法的优缺点和适用范围。

1. ELISA法的优点是操作简便，灵敏度高，适用于大规模样本的检测，但其缺点是对待测物质的亲和性要求较高。

2. 免疫荧光法的优点是具有较高的特异性和灵敏度，适用于多种免疫球蛋白的检测，但其缺点是需要荧光显微镜等专门设备。

3. 免疫固定电泳法的优点是操作简便，能够快速、准确地对免疫球蛋白的亚型进行鉴定，但其缺点是不能进行定量测定。

4. 免疫印迹法的优点是具有高度的特异性和灵敏度，能够对免疫球蛋白进行准确的定性鉴定，但其缺点是操作较为繁琐，且耗时较长。

酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理

酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELIS A）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。

洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。

根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理

更新时间：2004-12-210:30:001971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linkedassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定加入酶反应的底物后，ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。

根据颜色反应的程度进行根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗15-5）。

这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。

单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA 提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。

当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。

钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。

操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。

其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

宠物如何测抗体的原理

宠物如何测抗体的原理
测定宠物的抗体水平通常使用血清学方法，通过检测宠物血液中的特定抗体来评估它们是否对某种疾病或病原体具有免疫保护。

测定抗体水平的常用方法之一是酶联免疫吸附试验（ELISA），其基本原理如下：
1. 提取血清：从宠物静脉采集一定量的血液，并将其置于离心管中进行离心，从而分离出血浆。

2. 准备抗原：根据需要测定的抗体类型或特定病原体，提取相应的抗原。

3. 固定抗原：将抗原固定在一种固定支持物上，如微孔板。

固定支持物表面的抗原可以与抗体结合。

4. 加入血清：将宠物血浆加入到固定好抗原的微孔板中。

5. 结合抗体：如果样本中存在与抗原相匹配的抗体，它们将与固定在微孔板上的抗原结合。

6. 洗涤：将未结合的成分通过反复洗涤，以去除非特异性吸附物质。

7. 添加检测抗体：加入特异性检测抗体，该抗体可以结合已经与抗原结合的宠
物抗体。

8. 添加辣根过氧化物酶标记的二抗：该二抗可结合检测抗体，将其与酶连接。

9. 加入底物：加入一种底物，当酶与其反应时，会产生可测量的颜色变化。

10. 测量光密度：使用光密度计读取样品中的吸光度，根据吸光度的变化来确定宠物抗体水平的高低。

通过测定抗体水平，可以评估宠物对某种疾病或病原体的免疫保护程度，并根据需要采取相应的预防或治疗措施。

狗的抗体检测方法

狗的抗体检测方法
狗的抗体检测方法主要有以下几种：
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：该方法通过检测狗体内特定抗体与目标抗原结合的反应，从而确定狗是否感染了特定病原体。

ELISA是一种常用的快速、灵敏和特异性高的检测方法。

2. 补体结合试验（CFT）：该方法通过检测狗体液中的抗体与特定病原体结合后能否激活补体系统的反应，以判断狗是否感染了特定病原体。

该方法对于一些病原体的检测具有较高的特异性。

3. 中和试验（VN）：该方法通过将狗体内的抗体与特定病原体悬浮液混合，在体外判断其是否能中和病原体，从而确定狗体内是否具有防御该病原体的免疫力。

4. 免疫荧光法（IFA）：该方法通过利用特定抗原与特定抗体结合后产生荧光信号的原理，检测狗体液中的特定抗体水平。

该方法具有较高的特异性和敏感性。

上述方法在狗的抗体检测中常用，具体选择哪种方法取决于具体需要检测的抗体和病原体。

酶联免疫吸附实验ELISA

酶联免疫吸附实验ELISA
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再加入酶标识抗原或抗体, 也经过反应而结合在固相载体上。此时固相上酶量与标本中受检
物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后, 底物被酶催化成为有色产物, 产物量与标本中受检物质量直接相关, 故可依据呈色深浅进行定性或定量分析。因为酶催化效率很高, 间接地放大了免疫反应结果, 使测定方法到达很高敏感度。
酶联免疫吸附实验ELISA
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2.1.2 包被方式将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
换言之, 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合, 靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载体表面疏水基团间作用于。这种物理吸附是非特异性, 受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。
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惯用检验方法为: 以一定浓度人IgG（普通为 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数平均值。全部单个读数与全部读数均数之差，应小于10%。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附实验ELISA
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1. ELISA原理 ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗
体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保
持其免疫学活性, 酶标识抗原或抗体既保留其免疫学活性, 又保留酶活性。
酶联免疫吸附实验ELISA
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在测定时, 受检标本（测定其中抗体或抗原）与固相载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分开。

犬IgE酶联免疫分析（IgE）ELISA

犬IgE酶联免疫分析（IgE）ELISA试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号：E0545c预期应用ELISA法定量测定犬血清、血浆或其它相关液体中IgE含量。

概述免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质，存在与血液、体液、外分泌液及某些细胞的膜上。

本篇内除特别指出外，均为血清的免疫球蛋白测定。

目前，将免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等五类。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中IgE水平。

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IgE、生物素化的抗犬IgE抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的IgE呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为600 IU/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成600 IU/mL，300 pg/mL ，150 IU/mL，75 IU/mL，37.5 IU/mL，18.7 IU/mL，9.3 IU/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0IU/mL，临用前15分钟内配制。

3.样品稀释液：1×20ml/瓶。

4.抗体稀释液A：1×10ml/瓶。

5.抗体稀释液B：1×10ml/瓶。

6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液A1：100稀释。

7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液B1：100稀释。

8.底物溶液：1×10ml/瓶。

9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

犬免疫球蛋白EIgE酶联免疫分析ELISA

犬免疫球蛋白E(IgE)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定犬血清，血浆及相关液体样本中免疫球蛋白E(IgE)的含量。

试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。

2.批内与批见应分别小于9%和11%检测范围：请来电咨询保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6个月注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中犬免疫球蛋白E(IgE)水平。

用纯化的犬免疫球蛋白E(IgE)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入免疫球蛋白E(IgE)，再与HRP标记的免疫球蛋白E(IgE)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的免疫球蛋白E(IgE)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中犬免疫球蛋白E(IgE)浓度。

酶联免疫(ELISA)技术

ELISA技术ELISA是一种免疫测定。

免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。

在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。

一、抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。

抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。

在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。

能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。

小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原（hapten）。

例如某些激素、药物等。

抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epitope）。

一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如中可带有等决定簇。

二、抗体1．抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。

Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。

与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。

Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。

Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。

五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。

IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。

图1 IgG的结构见图①木瓜酶裂解部位；②胃蛋白酶裂解部位图2 重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序: 因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。

两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合，是抗体专一性结合抗原的结构基础。

IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。

每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。

另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。

IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。

酶联免疫法ELISA的原理

酶联免疫法ELISA的原理引言酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用于探测和定量分析生物样本中特定分子的方法。

该方法利用抗原-抗体的特异性识别作用和酶的催化反应，可以检测到低浓度的抗原或抗体。

ELISA技术广泛应用于医学、生物学、农业等领域，被用于疾病诊断、药物筛选、免疫学研究等。

ELISA的原理ELISA的原理基于抗原-抗体的特异性识别和酶催化的反应。

ELISA方法通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间隔ELISA等。

下面将对其中的直接ELISA 进行详细介绍。

直接ELISA直接ELISA是一种简单、直接的抗原-抗体反应检测方法。

其基本原理是将要检测的抗原固定在固相（如微孔板）上，然后加入与抗原特异性结合的抗体。

接下来，通过添加与抗体结合的酶标记抗体，使样本中的抗原成为可测定的目标。

最后，加入适当的底物，测定底物的酶活性，从而确定抗原的存在量。

步骤1.准备固相：将要检测的抗原固定在固相（如微孔板）上。

2.来样及对照：加入待测样品和对照样品到固相中，使其与固相上的抗原发生特异性结合。

3.清洗：将固相反复洗涤，去除非特异性结合的物质。

4.添加酶标记抗体：加入与抗体特异性结合的酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。

5.清洗：将固相反复洗涤，去除未结合的酶标记抗体。

6.酶反应：加入适当的底物，使酶标记抗体催化底物反应产生可测定的信号。

7.停止反应：加入适当的停止液，停止酶活性，防止底物继续反应。

8.信号检测：通过测定底物反应后的产物或底物代谢产生的染色物质的吸光度或荧光强度来测定抗原的存在量。

特点和应用直接ELISA主要适用于检测抗原或抗体含量较高的样品，如分泌型免疫球蛋白或细胞上的抗原。

其特点包括简单、快速、灵敏度高，能够定量检测目标物质的含量。

直接ELISA广泛应用于疾病的诊断、感染的检测、生物标志物的鉴定等。

抗体筛查常用的方法

抗体筛查常用的方法抗体筛查是一种常见的实验方法，用于检测生物样本中特定抗体的存在。

通过筛查抗体，我们能够了解人体免疫系统的状态，并发现某些疾病的迹象。

本文将介绍几种常用的抗体筛查方法。

一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验是一种常用的抗体筛查方法。

该方法利用抗体与待检测抗原结合后形成复合物，再使用辣根过氧化物酶等酶标记物来标记复合物。

随后，通过加入染色底物，酶标记物能够催化染色底物的反应，形成可见的色素产物。

根据产生的色素强度，我们可以判断待检测抗原的存在与否。

二、免疫印迹法（Western Blotting）免疫印迹法也是一种常用的抗体筛查方法。

该方法主要用于检测某种特定蛋白质的抗体。

首先，从待测样本中分离出蛋白质并进行电泳分离。

然后，将分离后的蛋白质转移到膜上进行固定。

接下来，使用特异性抗体与待测蛋白质结合，再使用荧光素等物质进行信号增强。

最后，通过暗室暗片法观察或使用射线暴露来探测标记物，从而确定待测蛋白质的存在与否。

三、流式细胞术（Flow Cytometry）流式细胞术是一种广泛应用的抗体筛查方法，主要用于检测细胞表面的抗原或细胞内的特异性细胞蛋白。

该方法利用荧光素等标记物标记抗体，将待测细胞的悬浮液通过流式细胞仪进行检测。

仪器能够依次通过细胞，使用多色激光同时激发标记物，并通过检测信号来确定待测细胞中特定抗原的存在与否。

通过流式细胞术，我们可以同时检测多个抗体和抗原，获得更全面的信息。

四、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry）免疫组织化学染色是一种应用广泛的抗体筛查方法，主要用于检测组织样本中特定抗原的分布和定位。

该方法通过使用特异性抗体与待测抗原结合，再标记荧光素或酶标记物，从而在光学显微镜下观察组织样本中的抗原分布情况。

这种方法可以帮助病理学家识别异常细胞或组织，对临床诊断提供有力的支持。

以上所述的四种抗体筛查方法是目前研究和临床应用较为常见的方法，它们在疾病诊断和基础科研中发挥着重要作用。