质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)质粒DNA提取及电泳检测实验报告实验目的•提取质粒DNA并检测其纯度和浓度•进行电泳检测，分析质粒DNA的大小和完整性实验材料•培养基含有质粒DNA的细菌培养物•高纯度DNA提取试剂盒•离心管、移液器、显微镜等常规实验仪器设备实验步骤1.收取 mL培养基含有细菌的培养物样品，放入离心管中。
2.将离心管置于高速离心机中，以12000 rpm离心5分钟，使细菌沉淀于离心管底部。
3.弃掉上清液，轻轻地加入合适的缓冲溶液悬浮沉淀的细菌细胞。
4.加入适量的裂解液使细菌细胞裂解，使质粒DNA释放到溶液中。
5.加入蛋白酶K进行蛋白质降解，使DNA更易提取。
6.加入冷乙醇混合液，沉淀DNA。
7.使用离心机离心，将沉淀的DNA分离出来。
8.用缓冲液洗涤提取的DNA，去除杂质。
9.使用专门的仪器或试剂盒检测提取的质粒DNA的浓度和纯度。
10.备取质粒DNA样品，进行电泳检测。
结果与分析•通过电泳检测，可以观察到质粒DNA的带状图案。
•根据带状图案的迁移距离，可以初步判断质粒DNA的大小。
•如果带状图案清晰且没有模糊的杂带，说明质粒DNA的完整性良好。
•通过测量提取的质粒DNA的浓度和纯度，可以进一步评估实验结果的可靠性。
结论•本实验成功提取并检测了质粒DNA，并通过电泳检测初步分析了其大小和完整性。
•经测量，质粒DNA的浓度和纯度符合实验要求。
•本实验结果可应用于后续实验或研究中，为进一步分析质粒DNA 的功能提供了基础。
实验注意事项•操作过程需严格遵守实验室安全规范，避免接触有毒或有害物质。
•仪器设备使用前需检查并确保正常工作。
•实验室内要保持清洁，避免污染样品。
•测量和记录数据时，要仔细操作，确保准确性和可重复性。
参考文献（如果有的话，请列出相关参考资料）。
质粒dna的提取及电泳检测实验报告
质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。
二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。
电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。
三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。
2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。
3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。
4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。
5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。
四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。
五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。
质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析
质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析摘要限制性内切酶发现于某些大肠杆菌体内，能够“限制”噬菌体对其感染并帮助将已殖入的噬菌体序列移除，可以识别双链DNA上特异序列（限制性位点）并酶切。
限制酶极大地促进了分子生物学、基因工程与遗传工程领域的进展。
[1]本实验通过对大肠杆菌质粒DNA的酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，与未酶切的质粒DNA比较，分析酶切结果。
同时，本次电泳还鉴定了提取纯化的大肠杆菌基因组DNA的纯度，以及大肠杆菌HSP70基因的PCR产物。
关键词限制性内切酶；琼脂糖凝胶电泳引言自从从嗜血杆菌(Haemophilus influenza)中分离到第一种限制性内切酶---HindⅢ,[2]人们开始意识到限制性内切酶的巨大应用前景。
Daniel Nathans,Werner Arber和Hamilton O. Smith在1978年即因限制性内切酶的发现和在分子遗传学的应用被授予诺贝尔生理与医学奖。
人们将限制性内切酶应用到DNA重组技术中，在用基因重组型大肠杆菌大规模生产人胰岛素获得巨大的成功。
现在限制性酶切与PCR一样成为分子生物学中最常用的实验手段之一。
限制性内切酶被分成四种：Types I,II,III和IV。
Types I酶切位点距离识别位点较远，是具有限制性内切和甲基化修饰的多功能酶，作用时需要ATP和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine），如EcoB,EcoK。
Types II酶切位点位于识别位点之中会较近距离，只具有限制性内切的单功能酶，作用时需要Mg2+，如EcoRI,HindIII。
Types III酶切位点距离识别位点较近，具有限制性内切活性，也被发现是修饰性甲基化酶复合物的一部分。
作用时需要ATP（但不水解ATP）和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine）刺激反应，如EcoPI, HinfIII。
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告引言DNA的提取是生物学实验中非常重要的一步，它可以用于后续的分子生物学研究，比如克隆、PCR、基因测序等。
而本次实验的目的是从细菌中提取质粒DNA，并对提取的结果进行分析，评估提取效果。
材料与方法1. 实验材料- 大肠杆菌菌液- 细胞裂解液- RNase A- 莱文斯坦缓冲液- 高盐裂解液- 乙酰盐- 氯仿- 异丙醇- TE液- 离心管等实验仪器和耗材。
2. 实验步骤- 调制莱文斯坦缓冲液，用于细胞裂解和质粒DNA的稳定。
- 预处理大肠杆菌菌液，用高盐裂解液处理使其细胞壁破裂，释放出质粒DNA。
- 添加异丙醇与氯仿，用于分离DNA和其他细胞组分。
- 加入乙酸盐处理DNA上的蛋白质，使其沉淀。
- 用异丙醇洗涤DNA沉淀，去除杂质。
- 用TE液溶解提取得到的DNA。
结果与讨论经实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA。
通过紫外光照射，我们观察到了明亮的DNA带，证明提取得到的DNA具有较高的纯度。
另外，我们还使用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行了分析。
从琼脂糖凝胶电泳的结果中，我们观察到细长而连续的DNA 条带，说明提取得到的质粒DNA具有较好的完整性。
此外，我们还注意到，在琼脂糖凝胶中，质粒DNA的迁移速率要快于细菌染色体DNA，这是因为质粒DNA的分子量较小。
在实验的过程中，我们注意到了一些实验技巧和注意事项。
首先，在进行细胞裂解和DNA提取过程中，必须保持材料的无菌状态，以免外源性DNA的污染。
其次，避免在提取过程中显著提高DNA样本的温度，以防止DNA的降解。
最后，注意避免DNA溶液与金属物质接触，因为金属离子可能对DNA具有毒性。
结论通过本次实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了高质量的质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上观察到清晰的DNA带。
实验过程中，我们掌握了DNA提取的基本操作技巧和注意事项，这对我们今后的分子生物学研究将产生积极的影响。
然而，本次实验还有一些改进的空间。
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定一目的学习质粒的酶切及电泳分析。
二原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。
因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。
电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三试剂与主要仪器（一）试剂1．Eco RⅠ酶2．λ DNA3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5．溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6．琼脂糖（二）仪器1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱四操作步骤（一）质粒DNA酶切1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。
管号①②③质粒DNA 10 10 10Eco RⅠ/ μl 1 1酶切Buffer（10×）/ μl 2 2 2ddH2O/ μl8 7 6RNA酶 1 2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。
然后每个管中加入4 μl Loading buffer。
（二）琼脂糖凝胶电泳1 琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。
冷却至65℃时加入2μl EB，混匀。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题
1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（appara tus）：恒温培养箱（C onsta nt temperature incuba tor）、恒温摇床（Consta nt temperature shakin g table ）、高速离心机（H igh speedcentri fuge）、漩涡振荡器（V ortex mixer）、超净工作台（B echt o p）、高压灭菌锅（A utocl ave）、微量加样器（Pi pett es）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylind er）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresi s tank）、电泳器（Electro-phoresi s System）、紫外灯（Ultravi olet transi llumi nator）3）、材料与试剂（Reagen ts）：①溶液I（Soluti on Ⅰ）：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
②溶液Ⅱ（Soluti on Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。
③溶液III（Soluti on Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3m ol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）⑤70% 乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告引言：DNA是生命的基本遗传物质，研究DNA的结构和功能对于理解生命的本质具有重要意义。
在分子生物学实验中，质粒DNA的提取是一项关键步骤，它能够帮助我们获得足够纯度和数量的DNA样本，以便进行后续的实验分析。
本实验旨在提取质粒DNA，并验证提取效果和纯度。
材料和方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的菌落进行预培养，接种至100ml含有适当抗生素的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。
2. 提取质粒DNA：使用质粒DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。
主要步骤包括细菌离心、细菌裂解、质粒DNA与蛋白质分离、质粒DNA沉淀和洗涤等。
3. DNA质量和浓度检测：使用紫外分光光度计检测提取得到的DNA样品的260nm吸光度值，计算DNA浓度。
结果和讨论：量和浓度的检测。
质检测结果显示，提取得到的质粒DNA纯度较高，吸光度比值（A260/A280）在1.8-2.0之间，说明DNA中没有明显的蛋白污染。
这对于后续实验如聚合酶链式反应（PCR）等有着重要的影响。
同时，我们还测定了DNA的浓度，得到了大致的目标值，为1μg/μl左右。
在实验过程中，我们需要注意一些关键点，例如细菌的培养条件、细菌离心和裂解的时间和速度、蛋白质分离的温度等。
这些因素都会对质粒DNA的提取效果产生影响，需要精确控制，保证实验结果的准确性。
质粒DNA的提取是分子生物学实验的常见步骤之一，其应用广泛。
例如，可以将提取得到的DNA用于质粒转染、DNA测序、基因克隆等研究中。
同时，提取得到的质粒DNA也可以用于分子诊断、疾病基因检测等临床应用。
结论：提取效果和纯度。
提取得到的DNA可以广泛应用于分子生物学及医学研究领域，为后续的实验工作提供了坚实的基础。
总结：质粒DNA的提取是分子生物学实验中不可或缺的一环。
本实验通过严谨的操作步骤和质量检测，成功地提取了高纯度、适量的质粒DNA。
在今后的实验工作中，我们将继续基于这些DNA 样本，进一步开展相关研究，推动科学的发展和创新。
综合性实验报告 质粒的提取及酶切
当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断
Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。
To visualize DNA or RNA, the gel is placed on a ultraviolet transilluminator.
质粒是存在于几乎所有细菌中染色体之外的外状DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的基因，并表现出一些有用的性状，如抗生素抗性，耐受重金属等。质粒拥有自己的复制原点，因此可以不依赖于染色体而进行独立复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有编码与复制有关的酶。
Agarose is typically used at concentrations of 0.5% to 2%.
The distance DNA has migrated in the gel can be judged by visually monitoring migration of the tracking dyes.
质粒分为：严紧型(低拷贝数)和松弛型(高拷贝数)。
质粒通常用作克隆载体，而碱裂解法是制备质粒DNA最为常用的方法之一。
本方法是依据共价闭合环状质粒DNA与染色体DNA在变性和复性之间存在差异进行的。
当细胞悬浮于NaOH和十二烷基酸钠(SDS)溶液中时，在高pH(碱)的作用下细胞发生裂解，此外，蛋白质和染色体DNA发生变性与细胞碎片一起沉淀下来。
The higher the agarose concentration, the "stiffer" the gel. Higher concentrations of agarose help in the separation of small DNAs, while low agarose concentrations allow resolution of larger DNAs.
实验一、质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳
因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其 次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
三、仪器、材料与试剂
(一)仪器 1．微波炉 2．琼脂糖凝胶电泳系统 3．移液器 4．凝胶成像系统
(二)试剂
1．（1）5×TBE (50倍体积的TBE贮存液）配1000 mL 5×TBE Tris 54 g 硼酸 27.5 g 0.5mol／L EDTA 20 mL pH 8.0 或（2） 50×TAE(50倍体积的TAE贮存液） Tris 242 g 乙酸 57 mL 0.5mol／L EDTA 100 mL pH 8.0 2．凝胶加样缓冲液(6x) 3．琼脂糖 4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）DS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变
性（裂解细胞和蛋白质变性作用）
② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性
（DNA变性作用）
Solution II
0.4mol/LNaOH，2％SDS, 用前等体积混合
2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处， 停止电泳。
五、实验结果
在紫外灯(360nm或 254nm)下观察染色后的电泳 凝胶。DNA存在处应显出桔 红色荧光条带(在紫外灯下观 察时应戴上防护眼镜，紫外 线对眼睛有伤害作用)。
M 1
五.问题与讨论：
1.简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及 实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现 象及其成因? 2.简要叙述酚-氯仿抽提DNA体系后出现的现象及其 成因? 3.沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行？ 4.若提取的质粒电泳为单一一条条带，如何判断其 构型？
上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g10min
质粒DNA的提取、纯化、酶切、电泳、 紫外分光光度法定量测定
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则：
(1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
11
最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的一般特性：
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型： 菌毛、抗药性等
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题
1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（apparat us）：恒温培养箱（Constan t tempera ture incubat or）、恒温摇床（Constan t tempera ture shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（V ortexmixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autocla ve）、微量加样器（Pipette s）、烧杯（beaker）、量筒（graduat ed cylind e r）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwa ve）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electro phoresi s tank）、电泳器（Electro-phoresi s System）、紫外灯（Ultravi olet transil lumina tor ）3）、材料与试剂（Reagent s）：①溶液I（Solutio nⅠ）：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
②溶液Ⅱ（Solutio nⅡ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/L NaOH（临用前用10m ol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。
③溶液III （Solutio nⅢ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）⑤70% 乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。
[整理版]实验一质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳
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实验一、质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能，同时熟悉DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理与实验技能，进而了解质粒和核酸的基本性质以及琼脂糖凝胶电泳的特性。
同时，掌握微量移液器、凝胶成像系统、紫外投射仪等实验仪器的使用方法。
二、实验原理利用SDS使细胞膜裂解，同时在碱作用下细菌的线形染色体DNA变性，而质粒DNA（共价闭合环状DNA，cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，通过离心将可以将质粒DNA提取出来。
DNA制备膜可选择性地吸附DNA，从而可快速地纯化质粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。
DNA在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。
DNA的显色原理为溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光。
但需注意EB是一种强诱变剂！三、实验材料、仪器与试剂（一）、实验材料含有质粒pBS的DH5α菌株（二）、实验仪器微量移液器，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统，紫外投射仪等。
（三）、实验试剂与配制1、小量质粒DNA提取试剂盒2、LB液体培养基: 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl10g, 用NaOH调至pH7.2-7.5。
高压下蒸汽灭菌20分钟。
3、LB固体培养基：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
4、氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 ℃下保存备用。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
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（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:
①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：
①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡
（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；
二．实验内容
1．实验现象与结果：
将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：
图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；
x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；
marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：
2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：
（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
标号为1、2和3组的电泳条带存在开环质粒DNA（与marker组的最后一条带相比较，同在一条水平线上且较亮的一条条纹即为开环质粒DNA），而且只出现在未经过酶切的质粒DNA Sample中，这说明在此次实验过程中酶切是彻底的。
从总体上观察，所有电泳条带的亮度并不高，可能是提取的质粒DNA量较少（浓度过低）或电泳前加样量过少所致。
（2）对实验分析及其结论：
①溶液Ⅰ的作用：悬浮大肠杆菌菌体，而且加溶液I后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键。
且其中含有的溶霉菌可以水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。
另外葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液 I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制 DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。
另外也可保证溶菌酶活性。