实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法

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1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫 时间(外推为零的滞留时间)与DNA分子大小有关的
特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂 直方向的不均匀电场，使DNA分子在凝胶中不断改 变方向，从而使DNA按分子大小分开。后来，Carle 等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场 (periodic inversion of the electric field)亦能使大 分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一个水平式 电泳槽和两组独立，彼此垂直的电极组成，一组电 极负极为N，正极为S；另一组负极为W，正极为E 。
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TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能 力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉 淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀 释10倍。0.5×工作液也可提供足够的缓冲能力。
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(3)
以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或 微波炉配制一定浓度的溶胶，冷却至45-50℃时 灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷 却。 (4) DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓 冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料， 含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重 ，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳 结果产生U形条带，可改用2.5% Ficoll(聚蔗糖 )代替蔗糖或甘油。
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目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核 酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。 由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少， 分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方 法之一。 琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质 和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发 展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的 复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白 质就可检出。
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在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱 基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准 物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较， 便可测出未知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂 糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率 不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶 电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。
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D-半乳糖
3，6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型 凝胶。
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冷却
松散，随机地，盘绕地琼脂糖链
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双螺旋结构区域与线性链相链接
淬火
溶胶状态
初级胶
最终的凝胶结构
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琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点 (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品
琼脂糖凝胶电泳的
原理和方法
一、电泳方法的分类
按支持物的物理性状不同，区带电泳可为： 滤纸及其他纤维（如醋酸纤维、玻璃纤维、 聚氯乙烯纤维）薄膜电位； 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电 泳； 凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉 胶、聚丙烯酰胺凝胶等； 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。
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目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售， 使印迹转移速度快、效率高、重复性好，应用更加广泛，仪器 的使用方法可参照厂家说明书。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹 转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性 剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜较 多，因为尼龙膜（Nylon membrane）机械性能好，烘烤不变脆， 使用时比硝酸纤维素膜（Nitrocellulose）
DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，
而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前
进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取
决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子
强度等的影响。
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3. 电泳方法 (1) 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型 及水平型(平板型)。水平型电泳时，凝胶板完全浸 泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前 更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电 泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规
常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察D NA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出 照片，并进行有关的数据分析。
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注意!
溴化乙锭（EB）为强致癌剂，操作时应戴手 套，尽量减少台面污染。 目前实验室一般用相对安全的GoldenView等核 酸荧光染料代替。
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四、印迹转移电泳
生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离 后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作， 1975年，Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维 素膜(NC膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法。 随后，Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为 Northern印迹，1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移 到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的 抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和 凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转 移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区 带从凝胶转移到特定膜上 ，称Eastern印迹
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(2)
缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反， 高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ， 严重时，会造成胶熔化和DNA 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙 酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等 ，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8) 。电泳缓冲液 一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍
进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，pH 要远离pI，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的Tris缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高 电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或 电流不可过高。
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五、交变脉冲电场凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。 这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超 过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过 筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移 率影响不大。如此时改变电场方向，则DNA分子必 须改变其构象，沿新的泳动方向伸直，而转向时间 与DNA分子大小关系极为密切。
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二、琼脂糖凝胶电泳
概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。
天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及 其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。 琼脂糖（agarose） 琼脂胶（agaropectin）
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天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由 琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是 由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带 电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强 酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场 作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根 可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离 效果。
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(5) 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表 明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压 条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正 比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率 的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率 反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率， 电场强度不宜高于5V/cm 电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行 为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当 凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃，进 (6)
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(2)琼脂糖的浓度： 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝 胶进行电泳分离,如下表所示:
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2. 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环 DNA(covalently closed circular ，简称cccDNA)＞直线 DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状
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一块正方形琼脂糖凝胶板(10cm×10cm或 20cm×20cm)呈45°置于中央，电场在N-S和W-E之间交 替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大 小有关。电泳时，DNA分子处在连续间隔交替的电场中。 首先向S极移动，然后改向E极。在每次电场方向改变时， DNA分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。 只有当DNA分子达到一定构型后，才能继续前进。DNA分 子净移动方向与加样线(图中点线)垂直，使样品中各组分 沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数 百万bp的大分子DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲
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三、DNA的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要 依据它们的相对分子质量及分子构型，同 时与凝胶的浓度
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1.核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系 (1)DNA分子的大小： DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应 和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液 中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的 电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛 效应，即DNA分子本身的大小和构型。
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六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
按电泳法分： 乳糜微粒（CM） -脂蛋白 （-位） 前-脂蛋白（2-位） -脂蛋白 （1-位） 按超速离心法分： 乳糜微粒CM ( < 0.96 ) 极低密度脂蛋白VLDL(0.961.006) 低密度脂蛋白LDL (1.0191.063)
高密度脂蛋白HDL(1.0631.21)
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pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负 极 到正 极 ； VLDL 为圆 形，受阻力小， LDL 形 态 不 规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。
CM LDL VLDL HDL
—
+
加样槽
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β
前β
α
临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM β 前β
α
正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)， 近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附 极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测
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琼脂糖凝胶电泳的缺点： (1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 (3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必 须立即固定染色。 (4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
按支持物的装置形式不同，区带电泳可为：
平板式电泳，支持物水平放置，是最常用 的电泳方式；
垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂 直板式电泳； 垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳 即属于此类；
连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤 纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端 向下流，与电泳方向垂直。