微珠芯片免疫法对肉制品中莱克多巴胺残留的检测

中间的六 通 阀为 枢纽控 制 整个 免疫 检测 过程 ，图 １ 中 ２种状 态分 别显 示洗 涤 ， 进样 图 １ ａ 和循 环反 应 （）
图 １ｂ 。 （）
蠕 动泵
硅
蠕动 泵
微
色谱法， 毛细管电泳法 ， 酶联免疫法等等 ， 虽然检测 （ ａ） （ ｂ） 方 法 多种 多样 ， 普遍 存 在检 测 仪 器 昂贵 ， 作 繁 但 操 图 １ 实验 装 置 示 意 图 Ｆｉ １ Ｓｃ ｅ ａｉ ｆｓ ｔ ｐ ｇ． ｈ ｍ ｔｃｏ ｅｕ 琐 等缺 点 ， 为此 采用 了一种 新 的生 物 芯片 法 一微 珠 ． ２ 芯 片法来 进 行检 测 分析 。近年来 ， 物芯 片 作 为一 １ 试剂 和仪 器 生 种 新 型 的生 物 材 料 和 实 验方 法 得 到 醇 二 缩 水 甘 油 醚 ，美 国 ｗｅｍ ０ １４ ［ ３ １ 生 物芯 片有 多种 形 式 ， 括 微 阵列 芯片 和微 流 控 Ｓｇ 公 司 ； 牛血 清 白蛋 白 ， 国 Ｓｇ 公 司 ； 包 ｉ ｍａ 小 美 ｉｍａ 莱 芯片 ， 文研 究 的是 一种 类似 于 微 流控 的微 珠 载体 克 多 巴胺 标 准 品 ，二 氧 化 硅 微 珠 ，氨 基 显 色 剂 本 芯片 ， 这种基于竞争免疫反应原理的微珠载体芯片 Ｔ Ｂ ， Ｎ Ｓ 莱克多 巴胺单克 隆抗体 ， 国 Ｂｏ ｅ ｇ 公 美 ｉ ｓｎ ｄｉ 测定方 法 具有 灵敏 度 高 、 特异 性 强 、 量 高 、 剂用 司 ；ｙ／ｙ 通 试 Ｃ ５ ３标记 羊抗 鼠 ＩＧ，美 国 Ｒ ｃｌ ｄ 司 ； Ｃ ｇ ｏｋａ 公 ｎ 量 少等 诸 多优 点［ ４ １ 。作者 通 过对 蛋 白全 抗 原 的有效 ３ 氨 丙基 三 甲氧 基 硅烷 ＡＰ ＭＳ 美 国 Ｓｇ ａ 司 ； 一 Ｔ ， ｉ 公 ｍ 固定 ， 采 用 内标 一标 准 曲线 法 进 行 测 定 ， 方 法 ｐ 并 该 Ｈ试纸 ， 马斯亮 蓝 ２０ 考 ５。 简单 、 快速 、 高效 ， 灵敏度高且廉价 ， 适合莱克多 巴 ＭｉｉＱ型 超纯水 系统 ， 国 Ｍｉｉｏｅ 司 ； ｌ— ｌ 美 ｌｌｒ 公 ｌＩ ； 真
，
收 稿 日期 ：２ １．６２ ０ ００ ．８
作者简介：胡 磊（ ９７ ） 男， １ ８ 一 ， 湖北荆州人 ， 硕士研究生， 主要从事生物芯片研 究。 Ｅｍａ ： ３ ３０ ６ ６ ． ｍ — ｉ ｈ ６２ ８＠１ ３ ｏ 。 ｌ１ ｔ
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当
代
化
工
第３ ９卷第 ４期
空 干 燥 箱 ， 海 一 恒科 技 有 限公 司 ； 上 管式 流 动 芯 片 分 析仪 ； ｅｔ ｆｇ ４ ５ Ｃ ｎｒ ｎ ｅ５ １Ｒ型 冷冻 离 心机 ， 国 Ｅ ｐ ｉ 德 ｐｅ
胺 对 动物 和人 都会 产 生危 害 ， 动物 的危 害 表 现在 对
１ 实验部分
１１ 实验装 置 ． 微珠 芯 片在 线 检测 系统 如 图 １ 示 ， 系 统包 所 本 括 蠕 动泵 ， 微珠 芯 片 ， 通 阀 ， 六 以及 相 关 管 路 ， 中 其
长 期使 用后 易 引发 肌 肉震 颤 ， 四肢 和 面部 肌 肉最 明 显， 对人 危 害表 现 为人 吃 了残 留有 莱 克多 巴胺 的组 织 后可 能会 出现 中毒症 状 ，通 常表 现 为 面色 潮 红 、 头晕、 心悸 、 四肢 麻 木等 不 良反 应 ， 对有 心 血 管病 的 患 者危 害更 大 ， 重 的危 及 生 命 ， 国 已严 禁 在 饲 严 我 料 中添 加 使 用 【 并 且 世 界 各 国都 在 积 极 开 发 检 测 ２ ＿ ， 莱克 多 巴胺 的办法 。 目前 检 测 莱 克 多 巴胺 的 方 法 主要 有 高 效 液相
胺 的大 规模 检测 。
Ｃ）属 Ｂ一肾上腺 素 兴奋 剂 （ ， ｐ一兴 奋 剂 ） 药物 中 类 的 苯 乙醇 类 衍 生 物 ， 通 常 所 说 的 瘦 肉精 ， 有 显 是 具 著提 高胴 体 瘦 肉率 ， 改善 动 物饲 料利 用 效率 的生 产 性 能 。莱 克 多 巴胺 也 能提 高 饲喂 动 物 的瘦 肉率 ， 但 因其危 害大 ， 国已禁止使 用 ｆ 我 １ ］ 。畜禽饲 喂莱 克多 巴
涤 完成后 ， 导人 适量 浓度 的一 抗 和标 准 品 （ 或样 品 ）
混合溶液 ５ Ｌ 此 时恰好将整个管路充满 ， ０ ， 然后 ｎ ｏｆ 司 ； ｄ ｒ公 台式恒 温 振荡 器 ， 海 精宏 仪 器设 备 有 将橡 胶管 两 头连 接 ， 上 使之 在加 热 板 的恒 温环 境下 循 限公 司； 一６Ｅ型漩涡混匀仪 ， 国 Ｓｉ ｔ ｃｎｕ Ｇ ５０ 美 ｃ ｎ ｆ ｄ 环 流动 反 应 ，０ｍｉ ，再用 １ Ｂ Ｔ和 １ ｅｉ ｉ ｉ ２ ｎ后 ＰＳ ｍＬ ｍＬ ｓ ｅ 公 司； ｔｓ ｌ ｉ 电热恒温培养箱 ， 上海精宏仪器设备有 Ｐ Ｓ导 入管 中进行 洗涤 。 Ｂ 限公 司 ， ｎｐｘ扫描 仪 ， 因公 司 。 Ｇｅｅｉ 基 （） ３ 抗体二 抗反应 １３ 检 测原理 ． 洗 涤完成后 ，导人 ５ ０ｌＬ标 记荧 光 的二抗 ， Ｊ 同 本实 验是 基 于竞争 免 疫 反应 的原 理 实现 的 ， 在 抗 反应 过程 步骤 ， 进行 恒 温封 闭循环 反应 ，０ｍｉ ２ ｎ 免疫 反应 中 ，抗 体 可 以和对应 抗 原 特异 性结 合 ， 而 后 ，再用 １ ｍＬＰ Ｔ和 １ ＢＳ ｍＬＰ Ｓ导入 管 中进 行 洗 Ｂ 抗抗体（ 二抗 ） 又可以抗体结合 ， 本实验将所测物质 涤 。 作为抗原 固定在玻璃微珠载体上 ， 然后将待检物和 （ ） 号获取 及数据 处理 ４信 对应抗体混合液同微珠上 固定 的抗原探针反应 ， 这 洗涤完后使用 Ｏ ｎｐ 扫描仪进行扫描 ， ｅｅｉ ｘ 并分 时 ， 液 中抗 原 （ 溶 待检 物 ） 和微 珠表 面 上抗 原 就会 竞 析 图形及进 行数 据处理 。 争 结 合 溶 液 中 的相 应 抗 体 ， 涤 后 ， 洗 加入 荧 光 标 记 １ － 标准 曲线 的建立 ．３ ４ 二抗会同已在微珠表面共价结合的抗体结合 ， 而通 采 用 间接 竞 争 法 绘 制 小 分 子 竞 争浓 度 标 准 曲 过 扫 描就 可 以捕捉 到 已结 合 的荧 光信 号 ， 可 以表 线 。采 用 ６ 携带 ６组 固定 好该 探针微 珠 的毛细管 就 条 征 一抗 和微 珠 上抗 原探 针 的结合 程 度 ， 用抗 原 标 准 的橡胶 管路 ，分别 导入 １ Ｌ稀释 度为 １：１０的 ５ ０ 品和探针竞争 的方式可以得到此免疫竞争的标准 单 克 隆抗 体 （ ／ 和 １ Ｌ浓 度 （ ｇ 分 别 １ ｍＬ） ５ ｍｇ ／ Ｌ） 曲线 ， 就可 以对 照 得到 同样 条件 竞 争反 应 的实 际样 为 ０００ ，．， ，０ １０标 准 品 的混 合 样 。然 后 按 ，．１Ｏ１ １１ ，０ 本浓 度 。 １． ．２方法 进 行分 析： 后得 到 经过 ６点梯 度浓 度 的 ４ 最 １４ 微 珠表面 修饰 策略 ． 标 准 曲线 ， 过 不 断 优 化 改变 单 抗 浓 度 ， 通 以期 得 到 １ ． 微珠 表面 的化学 修饰 ．１ ４ 竞争性强的标准曲线。优化完成后 ， 确定最低检测 （ ） 氧化硅微 珠 的羟基化 修饰 １二 限， 各取 检测 区间 内两 点做加 标 回收率测 定 。 用 １ Ｌ离 心 管称 量 １０ｍｇ二 氧化 硅 裸珠 ， ．ｍ ５ ０ １ ． 实 际样本 检测 ．４ ４ 用去 离子水 洗净 ， 入 １ ｍｏ／ Ｃ ，７℃振荡 加 ６ ｌ Ｈ Ｉ３ ｍＬ Ｌ 实 际样 本检 测 ： 于每 一 种实 际样 本用 固定有 对 反应 过夜 ， 然后 用去 离子 水洗 涤至 中型 ，１ １０℃真空 莱 克多 巴胺 抗原 的微珠 进行 检视 ， 应 流程 与 上述 反 干燥过 夜 。 检 测方 法 相 同 ， 时做 标 准 曲线 ， 际样 本得 到 的 同 实 （） ２ 二氧化 硅微 珠 的硅 烷化 修饰 信 号 与标 准 曲线进 行 比较 ， 反应 完成 后 ， 即 时得 可 氨基 硅 烷 化 ， 体 操 作 是 ： 具 羟基 化 珠 干 燥 完 成 到样 本里各 种残 留 的含 量 。 后 ， 入含 ２ 加 ％的 ２ ３ ，一氨丙基 三 甲氧基硅 烷 甲苯 溶 液， 反应 ５ｈ然 后 １０℃真空 干 燥 ２ｈ 用 Ｔ ＢＳ显 ２ 结 果 与讨 论 ， １ ， Ｎ 色剂检验其反应效果 ， 保存待用 ， 此珠称为氨基珠。 ２１ 微珠 表面修 饰 策略 ． （） 氧化硅 微珠 的功 能化修饰 ３二 ２２ 一抗 、 ． 羊抗 鼠 Ｉ Ｇ 二抗反 应时 间优化 ｇ 通 过 系列实 验发 现 ， 氨基 硅 烷化 基 础上 进行 在 评 价检测方 法 的重要方 面是检 测时 间 ，所 以有 环 氧化 ， 以有 效 固定 小分 子 的牛血 清 蛋 白全 抗原 可 必要对 ２次免疫 反应 进行一 系列 的优化 ，首先就 是 环 氧 化 ，在 ５ ０ ＩＬ １４ ０ ，一丁 二 醇 二 缩 水 甘 油 醚 Ｘ 对 反应 时间的优 化 ，一 抗反应 时 间和二抗 反应 时间 （ｕａ ｅ１４ｄｏ ｉｌ ｉｄ ｌ ｔｅ ） Ｐ Ｓ ｐ ．） ｂ ｔ 一 ，一ｉｌ ｇ ｃｙ ｙ ｅ ｒ 的 Ｂ （ Ｈ ７ ｎ ｄ ｙ ｈ ４ 的优 化 ，设 置 了一组 时 间梯 度 ５ １ ，５２ ，０ｒｉ ，０ １ ，０３ ｎ ａ 缓 冲液 中加 入 １ ０ ｍｇ氨基珠 ，７℃反应 １ ， ３ ６ｈ 用 来进 行一抗反应 时间优化 ， ２信号 图是反 应结果 。 图 Ｐ Ｓｐ ．） 冲液 洗 涤 ３遍 ， 水 乙醇 洗 涤 １ ， Ｂ （Ｈ７ 缓 ４ 无 遍 从 图 ２可 以 看 出 ， 抗 反 应 在 １ ｎ 二 抗 反 一 ５ｍｉ， 常 温真空 干燥 。 应 在 １ ｎ时反 应信 号分 别进 入 平 台期 ，所 以可 ０ｍｉ １ ． 间接荧 光免 疫实验 法过 程 ．２ ４ 确 定优 化结 果 一抗 反应 １ ｎ ５ｍｉ，二 抗 反应 １ ｉ， ０ｒ ｎ ｎ （） １ 固定探 针 反应 中洗涤 ， 加样等时间需要 ２ ｉ， ０ ｎ 所以本系统 一 ａ ｒ 将功 能 化 修饰 微 珠 与 莱 克 多 巴胺 的蛋 白 ＢＳ Ａ 微珠芯片多元检测总体需要 ４ ｉ ５ ｎ时间。图中对 ａ ｒ 的偶联物混合在 ３ ℃反应过夜 ， ７ 之后用 Ｐ Ｓ ，Ｂ Ｂ ＴＰ Ｓ 全 抗 原 的浓 度进 行 梯 度稀 释 ，发 现 Ｒ — Ｓ 为 ＡＣ Ｂ Ａ 各 洗涤 ２遍 。 ７ ６ ｇ Ｌ时 ， ． ／ ０ｍ ｍ 为其 ２ 倍稀释下限 ， 为有明显信号 （ ） 体抗原 反应 ２抗 的最 低 浓 度 ， 为节 约 原 则 ， 取 这 一 浓 度点 为实 验 选 将 微 珠 在 蠕 动泵 的作 用 下 ， 人 毛 细 管 ， 泵 然后 浓度 。 用 １ ＬＰ Ｓ Ｂ Ｔ和 １ ＬＰ Ｓ导人管 中进行洗涤 ， ｍ Ｂ ｍ 洗