碱性氧化物预处理玉米秸秆维管柱_皮层和表皮研究
我院获批安徽省教育厅自然科学研究项目一览表
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倚窗远眺，目光目光尽处必有一座山，那影影绰绰的黛绿色的影，是春天的颜色。
周遭流岚升腾，没露出那真实的面孔。
面对那流转的薄雾，我会幻想，那里有一个世外桃源。
在天阶夜色凉如水的夏夜，我会静静地，静静地，等待一场流星雨的来临…
许下一个愿望，不乞求去实现，至少，曾经，有那么一刻，我那还未枯萎的，青春的，诗意的心，在我最美的年华里，同星空做了一次灵魂的交流…
秋日里，阳光并不刺眼，天空是一碧如洗的蓝，点缀着飘逸的流云。
偶尔，一片飞舞的落叶，会飘到我的窗前。
斑驳的印迹里，携刻着深秋的颜色。
在一个落雪的晨，这纷纷扬扬的雪，飘落着一如千年前的洁白。
窗外，是未被污染的银白色世界。
我会去迎接，这人间的圣洁。
在这流转的岁月里，有着流转的四季，还有一颗流转的心，亘古不变的心。
黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究
2023年7月四川大学学报(自然科学版)J u l .2023第60卷 第4期J o u r n a l o f S i c h u a nU n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n )V o l .60 N o .4黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究薛海瑞1,李国秀1,孙意冉1,王韬宇1,樊云芳2,唐 琳1(1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;2.宁夏农林科学院枸杞研究所,银川750000)摘 要:为探究黑果枸杞花色苷最佳提取工艺和抗氧化活性,采用超声酶辅助提取法、乙醇/硫酸铵双水相萃取法、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法提取黑果枸杞花色苷,通过响应面优化提取工艺,并使用-B H P 诱导B R L3A 细胞建立抗氧化模型来探索黑果枸杞花色苷的氧化应激保护作用.结果表明,超声酶辅助提取得率为:(17.92±0.04)m g /g ;乙醇/硫酸铵双水相萃取得率为:(15.46±0.31)m g /g ;乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取得率为:(15.02±0.19)m g /g.体外抗氧化实验表明,乙醇/硫酸铵双水相萃取的花色苷(L R N )抗氧化活性最强,纯化后的乙醇/硫酸铵双水相萃取的花色苷(L R N A )可通过减少细胞中R O S 的产生来缓解t -B H P 诱导的氧化损伤.综上所述,该工艺便捷、稳定可用于黑果枸杞花色苷的提取,同时证明了L R N 抗氧化活性最强.关键词:黑果枸杞;花色苷;响应面;抗氧化;活性氧;中图分类号:Q 949.95 文献标识码:A D O I :10.19907/j.0490-6756.2023.046004收稿日期:2022-10-21基金项目:宁夏回族自治区重点研发计划(2022B B F 0100103)作者简介:薛海瑞(1997-),男,山西省太原人,硕士研究生,主要研究领域为药用天然产物.通讯作者:唐琳:R e s e a r c ho no pt i m i z a t i o no f t h e e x t r a c t i o n p r o c e s s a n da n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f a n t h o c ya n i n s f r o m M u r r .1,1,1,1,2,1(1.K e y L a b o r a t o r y o f B i o -R e s o u r c e a n dE c o -E n v i r o n m e n t o fM i n i s t r y ofE d u c a t i o n ,C o l l e g e o f L i f eS c i e n c e s ,S i c h u a nU n i v e r s i t y ,C h e n gd u 610065,C h i n a ;2.L y c i u mB a r b a r u m Re s e a r c h I n s t i t u t e ,N i n g x i aA c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l a n dF o r e s t r y Sc i e n c e s ,Y i n c h u a n 750000,C h i n a )A b s t r a c t :T o i n v e s t i g a t e t h e o p t i m a l e x t r a c t i o n p r o c e s s a nd a n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f a n t h o c ya n i n s o f M u r r .,t h e a n t h o c y a n i n s o f M u r r .w e r e e x t r a c t e db y ul t r a s o n i c e n -z y m e -a s s i s t e de x t r a c t i o n ,e t h a n o l /a m m o n i u ms u l f a t e a q u e o u s t w o -ph a s e e x t r a c t i o n ,e t h a n o l /s o d i u md i -h y d r o g e n p h o s p h a t e a q u e o u s t w o -p h a s e e x t r a c t i o n ,a n d t h e e x t r a c t i o n p r o c e s sw a s o p t i m i z e d b y r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ,t h e a n t i o x i d a n tm o d e l o f B R L3Ac e l l s i n d u c e db y -B H Pw a s u s e d t o e x p l o r e t h e pr o t e c t i v e e f f e c t o f M u r r .a n t h o c ya n i n s o n o x i d a t i v e s t r e s s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e y i e l d o f u l t r a s o n i c e n z y m e a s s i s t e d e x t r a c t i o nw a s (17.92±0.04)m g /g ;t h e y i e l d o f e t h a n o l /a m m o -n i u ms u l f a t e a q u e o u s t w o -p h a s e e x t r a c t i o nw a s (15.46±0.31)m g /g;t h e e x t r a c t i o n y i e l do f e t h a n o l /s o d i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e a q u e o u s t w o -p h a s es y s t e m w a s (15.02±0.19)m g /g.T h e i nv i t r oa n -t i o x i d a n t e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f a n t h o c y a n i n s (L R N )e x t r a c t e db y E t O H /(N H 4)2S O 4a q u e o u s t w o -p h a s ee x t r a c t i o nw a s t h es t r o n g e s t ,p u r i f i e dE t O H /(N H 4)2S O 4a qu e o u s t w o -第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期p h a s e e x t r a c t i o no fa n t h o c y a n i n s(L R N A)c a na l l e v i a t e-B H P-i n d u c e do x i d a t i v ed a m a g eb y r e d u c i n g R O S p r o d u c t i o n i n c e l l s.I n s u m m a r y,t h i s p r o c e s s i s c o n v e n i e n t a n d s t a b l e a n d c a nb eu s e d f o r t h e e x-t r a c t i o no f a n t h o c y a n i n s f r o m M u r r.A t t h e s a m e t i m e,i t a l s o p r o v e s t h a tL R Nh a s t h e s t r o n g e s t a n t i o x i d a n t a c t i v i t y.K e y w o r d s:M u r r.;A n t h o c y a n i n s;R e s p o n s e s u r f a c e;A n t i o x i d a n t;R O S1 引 言黑果枸杞(M u r r.)为茄科枸杞属植物,是我国西北地区特有的耐旱、耐碱、耐盐生灌木植物.其果实中含有丰富的花青素、类胡萝卜素、维生素等多种营养成分[1],关于黑果枸杞化学成分的研究目前主要有多糖类、黄酮类、花色苷类、生物碱类、精油和脂肪酸类,现代药学研究表明,黑果枸杞具有抗氧化、抗疲劳、降血糖、降血脂、保肝护肾、免疫调节[2-4].花色苷是黑果枸杞中重要的抗氧化活性成分,目前已知的黑果枸杞花色苷种类主要有:飞燕草素、矮牵牛素、矢车菊素、天竺葵素、芍药素等以及衍生的糖苷[5].前人对花色苷物质进行了大量的活性研究,包括抗氧化、降血脂、抗衰老、抗肿瘤、抑菌等活性研究,但当前对黑果枸杞花色苷提取工艺的研究不够全面,存在的问题主要是花色苷得率较低、目的物质失活、提取物杂质成分较多难以获取较高纯度花色苷、提取成本较高且污染较大等[6,7],如何高效经济的获取高纯度花色苷是研究重点.提取花色苷的常用方法主要有有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法、微波提取法、超声波辅助提取法、生物酶辅助提取法等,随着生物学提取工艺的发展,现在单一的提取方法并不能满足对活性成分得率高、活性强的需求,双水相萃取法由于得率较高、经济环保、且有一定的纯化作用逐渐应用到花色苷的提取中[8].响应面作为一种优化提取的方法,它将提取实验中目的物质得率作为一个或多个因素(如料液比、乙醇浓度等)的函数,并通过图形将这种函数关系直观的体现出来,并提供最优的提取方案,此方法普遍应用于中药活性成分的提取工艺研究中[9].在本实验室以往的研究中对比了青海、甘肃、宁夏、新疆等地黑果枸杞花色苷的含量,其中青海省最高,所以本实验以青海省黑果枸杞为实验材料,通过超声酶辅助提取、乙醇/硫酸铵双水相萃取、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取提取黑果枸杞花色苷,并通过响应面对提取工艺进一步优化获取最佳提取工艺,为后续的工业提取提供理论参考.目前对双水相萃取得到的花色苷抗氧化能力研究较少,且针对黑果枸杞不同提取方法所得花色苷体外抗氧化能力对比研究的资料缺乏.因此本研究采用体外抗氧化及细胞实验探究不同提取方法得到的花色苷样品体外抗氧化效果以及对-B H P 诱导的正常大鼠肝细胞(B R L3A)氧化应激损伤的保护作用,为后续的机制研究提供参考资料.2 材料与方法2.1 材料与仪器以青海省的黑果枸杞为实验材料,经四川大学生命科学学院白洁副教授鉴定为茄科枸杞属黑果枸杞.纯化后超声酶辅助法花色苷(L R E A)、纯化后E t O N/(N H4)2S O4双水相萃取花色苷(L R N A)、纯化后E t O H/N a H2P O4双水相萃取花色苷(L R-P A)由本实验室提供.大鼠肝细胞系(B R L3A)为本实验室所冻存;乙醇、V C、磷酸二氢钠、硫酸铵、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(B H T)等试剂均为分析纯(成都市科龙试剂化工厂);纤维素酶、果胶酶购买于成都瑞芬思公司;D ME M培养基、磷酸盐缓冲液(P B S)、胰蛋白酶均购于美国H y c l o n e公司,胎牛血清购于塞尔博克斯生物制品有限公司;D CF H-D A荧光探针购于南京建成生物工程研究所;D P P H和A B T S购于S i g m a-A l d r i c h中国公司;水为超纯水.M S半微量电子精密分析天平(瑞士M e t t l e r-T o l e d o公司);离心机H1850型(长沙湘仪离心机仪器有限公司);冷冻干燥机(宁波市鄞州仪器有限公司);p H 计(希玛科技有限公司);K H-300D B型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司).2.2 方 法2.2.1 超声酶辅助提取单因素实验 固定各因素变量为酶添加量1.0m g/g、70%乙醇(v/v)、料液比25m L/g、温度45℃、p H3.0、时间30m i n;选择超声提取时间、液料比、乙醇浓度为个因素;时第4期 薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究 第60卷间(10m i n、20m i n、30m i n、40m i n、50m i n);液料比(15、20、25、30、35m L/g);乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%),采用p H示差法测定花色苷含量[10],每组实验重复3次.2.2.2 双水相萃取单因素实验 固定各因素变量为24%乙醇、液料比25m L/g、温度45℃、p H3.0、时间30m i n、硫酸铵质量分数24%、磷酸二氢钠质量分数24%;选择乙醇质量分数、萃取时间、硫酸铵质量分数、磷酸二氢钠质量分数为4个因素;乙醇质量分数(20%、22%、24%、26%、28%);萃取时间(20m i n、30m i n、40m i n、50m i n、60m i n);硫酸铵质量分数(21%、22%、23%、24%、25%);磷酸二氢钠质量分数(20%、22%、24%、26%、28%),花色苷含量测定同2.2.1,每组实验重复3次.2.2.3 B o x-B e h n k e n法优化实验 根据单因素实验的实验结果选择提取时间-液料比-乙醇浓度、乙醇浓度-萃取时间-硫酸铵质量分数、乙醇浓度-萃取时间-磷酸二氢钠为超声辅助提取法(L R E)、乙醇/硫酸铵双水相萃取法(L R N)、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法(L R P)的自变量,以花色苷含量作为响应值[11],花色苷含量测定同2.2.1,利用D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件,根据B o x-B e h n k e n法设计三因素三水平的响应面,设计实验因素水平见表1~3.每组实验重复3次.表1 实验因素水平及编码T a b.1 E x p e r i m e n t a l f a c t o r l e v e l s a n d c o d i n g编码因素水平A液料比/(m L/g)B提取时间/m i nC乙醇浓度/%-1232565 0253070 1273575表2 实验因素水平及编码T a b.2 E x p e r i m e n t a l f a c t o r l e v e l s a n d c o d i n g编码因素水平A乙醇质量分数/%B萃取时间/m i n C硫酸铵质量分数/%-122302202435231264024 2.2.4 D P P H自由基清除实验 准确移取2m L 样品溶液(~m LD P P H乙醇溶液(0.1m o l/L),摇匀后,避光放置30m i n,以无水乙醇作空白对照,V C做阳性对照测517n m波长处吸光度,平行测定3次.D P-P H自由基清除率=[1-(-)/]×100%其中,代表实验组吸光度值,代表样品本底吸光度值,代表空白组吸光度值[12]棶表3 实验因素水平及编码T a b.3 E x p e r i m e n t a l f a c t o r l e v e l s a n d c o d i n g编码因素水平A乙醇质量分数/%B萃取时间/m i nC磷酸二氢钠质量分数/% -122302402435261264028 2.2.5 A B T S自由基清除实验 准确移取2m L 样品溶液(6.25~200μg/m L)至试管内,与A B T S 自由基溶液等体积混合,以无水乙醇作空白对照, V C做阳性对照,室温反应30m i n.用酶标仪测定734n m处的吸光值[13].A B T S自由基清除能力计算公式同“2.2.1”项.2.2.6 总还原力测定 先加入25μL不同浓度(6.25~200μg/m L)的样品溶液、B H T,25μL的无水乙醇,分别作为实验组、阳性对照组及空白组.每组再加入50μLP B S溶液(0.2m o l/L、p H6.6)和25μL1%的铁氰化钾水溶液,震荡摇匀,45℃孵育1h.最后加入50μL10%的三氯乙酸和60μL0.1%的三氯化铁,震荡摇匀,在700n m处用酶标仪测定各反应液的吸光值,总还原力的强弱与吸光值大小呈正比[14].2.2.7 细胞培养 大鼠肝细胞系B R L3A细胞用D ME M低糖培养基(培养基中含有1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清)置于37℃细胞培养箱中培养,C O2浓度为5%.待细胞汇合度达到约80%~ 90%时,将细胞传代培养,然后取处于对数生长期的细胞进行后续实验.2.2.8 -B H P诱导B R L3A细胞损伤模型的建立 取处于对数生长期的B R L3A细胞,经胰酶消化后,用D M E M低糖培养基重悬为单细胞悬液,以4×104细胞/m L接种于96孔板中,每孔加100μL 细胞悬液,过夜培养,待细胞汇合度达到70%~ 80%后吸出培养基,进行后续实验.实验分组如下: (1)对照组:加入100μL无血清培养基继续培养;含不同浓度第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期300、400、500、600、700、800和900μm o l/L)的无血清培养基.每组设置3个复孔,于细胞培养箱中培养2h后,吸去培养基,每孔加入100μL含10%C C K-8的无血清培养基,于细胞培养箱中避光孵育1h,用酶标仪测定各孔在450n m处的吸光值,细胞存活率用模型组/对照组×100%表示. 2.2.9 细胞毒性实验 细胞前期处理同2.2.8.实验分组如下:(1)对照组:加入100μL无血清培养基继续培养;(2)实验组:加入100μL含不同浓度花色苷样品(25~200μg/m L)的无血清培养基.每组设置3个复孔,于细胞培养箱中培养24h后,后续测定步骤同2.2.8,细胞存活率用实验组/对照组×100%表示.2.2.10 细胞保护实验 细胞前期处理同2.2.8.实验分组如下:(1)对照组:加入100μL无血清培养基继续培养,培养12h后,再加入100μL无血清培养基继续培养2h;(2)药物组:加入100μL 无血清培养基,培养12h后,再加入100μL含200μm o l/L-B H P的无血清培养基处理2h;(3)实验组:加入100μL含不同浓度花色苷样品(10~100μg/m L)的无血清培养基处理细胞12h,再加入100μL含200μm o l/L-B H P的无血清培养基处理2h.后续测定步骤同2.2.8,细胞存活率分别用药物组/对照组×100%和实验组/对照组×100%表示.2.2.11 活性氧检测 取处于对数生长期的B R L 3A细胞,以5×104细胞/m L接种于12孔板中,每孔加1m L细胞悬液.过夜培养后吸出培养基,P B S 清洗细胞2次.对照组和模型组加入500μL无血清培养基,实验组加入500μL含L R N、L R N A(60μg/m L)无血清培养基,在培养箱培养12h后,对照组继续加入500μL的无血清培养基,模型组和实验组均加入500μL含200μm o l/L-B H P的无血清培养基,继续培养2h后,吸去培养基,P B S清洗两次,对照组、模型组和实验组均加入500μL10μm o l/L的D C F H~D A探针,在37℃避光中染色30m i n用倒置荧光显微镜观察各组细胞荧光强度的变化.细胞培养操作同上,将细胞收集转移到流式专用管,用流式细胞仪检测细胞R O S含量变化情况,并用F l o w J o软件进行分析.2.2.12 细胞线粒体膜电位变化检测 取对数生长期的B R L3A细胞以5×104细胞/m L的密度接种于孔板,培养μL无血清培养基,实验组加入500μL60μg/m L 的L R N、L R N A预处理4h,再加入200μm o l/L-B H P损伤2h,吸走培养液,用500μLP B S漂洗2次,每孔加入500μLJ C-10染液,于室温避光孵育30m i n,吸走染液,用P B S洗去未结合的J C-10染液,每孔加入500μL无血清培养基,在倒置荧光显微镜下观察并拍照.细胞培养操作同上,将细胞收集转移到流式专用管,用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化情况,并用F l o w J o软件进行分析.3 结果与分析3.1 黑果枸杞花色苷提取单因素实验采用2.2.1所述方法,超声酶辅助提取法图1a~1c表明,乙醇浓度70%,提取时间为30m i n,液料比为25m L/g条件下花色苷的提取效果最好.在50%~90%浓度范围内,提取溶剂的极性由大变小,提取溶剂的渗透力由小变大.超声时间过短,不利于黑果枸杞细胞内花色苷的释放;时间过长,花色苷的分子结构会受到超声所产生的机械能量的破坏,降低花色苷的提取含量.液料比过低在一定的时间内不能完全溶解花色苷,所以在15~ 25m L/g范围内,花色苷的含量逐渐上升.乙醇/硫酸铵双水相萃取法图1d、1e和1f 表明,乙醇质量分数为24%,硫酸铵质量分数为23%,萃取时间30m i n时花色苷的提取含量达到最大.当乙醇质量分数为24%时体系极性刚好与黑果枸杞花色苷相近,极性过高过低都不利于花色苷的释放.硫酸铵质量分数过高,下相无机盐富集相争夺水分子相较上相乙醇溶液增强,导致上相乙醇富集相极性下降,花色苷是高极性物质,因此花色苷提取含量下降.随萃取时间的延长,花色苷含量逐渐上升,30 m i n后花色苷含量随时间的延长而逐渐减少.可能是较长的萃取时间伴随超声作用所产生的机械能量会使花色苷结构受到破坏,从而引起花色苷提取含量下降.乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法图1f、1g和1i 表明,乙醇质量分数为24%,磷酸二氢钠质量分数为26%,萃取时间在30m i n时花色苷含量最高.当硫酸铵质量分数超过26%时,花色苷的提取含量出现下降趋势,原理与E t O H/(N H4)2S O4双水相体系相似,但是花色苷含量最大值对应的无机盐质量分数不同,可能是因为磷酸二氢钠较硫酸铵更第4期薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究第60卷溶于水.萃取时间在30~40m i n 含量几乎没有变化,但随着萃取时间延长,40m i n 后花色苷含量有所下降,可能是因为萃取时间延长伴随超声产生的机械能量破坏花色苷结构,导致花色苷降解,从而使花色苷含量降低.图1 黑果枸杞花色苷提取单因素实验(a )提取溶剂浓度对花色苷含量的影响;(b )提取时间对花色苷含量的影响;(c )液料比对花色苷含量的影响;(d)乙醇质量分数对花色苷含量的影响;(e )硫酸铵质量分数对花色苷含量的影响;(f )萃取时间对花色苷含量的影响;(g)乙醇质量分数对花色苷含量的影响;(h )磷酸二氢钠质量分数对花色苷含量的影响;(i )萃取时间对花色苷含量的影响F i g .1 S i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t o n t h e e x t r a c t i o no f a n t h o c y a n i n s f r o m M u r r .(a )I n f l u e n c e o f e x t r a c t i o n s o l v e n t c o n c e n t r a t i o no n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(b )i n f l u e n c e o f e x t r a c t i o n t i m e o n a n t h o c ya n i n c o n t e n t ;(c )i n f l u e n c e o f l i q u i d t o s o l i d r a t i o o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(d )i n f l u e n c e o f e t h a n o l m a s s f r a c t i o n o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(e )i n f l u e n c e o fm a s s f r a c t i o no f a m m o n i u ms u l f a t e o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(f )e f f e c t o f e x t r a c t i o n t i m e o n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(g)e f f e c t o f e t h a n o lm a s s f r a c -t i o no n a n t h o c y a n i n c o n t e n t ;(h )i n f l u e n c e o fm a s s f r a c t i o n o f s o d i u md i h y d r o g e n p h o s p h a t e o n a n t h o c ya n i n c o n t e n t ;(i )i n f l u e n c e o f e x t r a c -t i o n t i m e o n a n t h o c ya n i n c o n t e n t 3.2 黑果枸杞花色苷提取工艺优化3.2.1 超声酶辅助提取工艺优化 实验方案设计及结果如表4,经D e s i g n -E x pe r t 8.0.6软件回归拟合,得到二次多项回归方程:花色苷含量(m g /g)=13.22+0.29+0.21+0.36-0.11-0.055+0.027-0.672-0.452+0.0002.由方程可知,表示方程所对应的曲线是开口向下的抛物线,抛物线的最高点为花色苷含量最大值点各提取因素对花色苷提取含量的影响程度可以由此方程中各单项系数绝对值的大小反映,值越大,影响程度越重要.各提取因素影响的重要程度为:(乙醇浓度)>(液料比)>(提取时间).由表5可知,0.01<<0.05代表模型差异显著;失拟项(=0.3207>0.05)不显著,表明模型能有效模拟实际情况;矫正2=0.8361能够说明花色苷含量的变化一次项影响显著,第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期A、B影响不显著,交互项影响不显著,二次项2、2影响显著.说明此法对花色苷提取含量影响最大的因素是乙醇浓度.表4 响应面试验结果T a b.4 R e s u l t o f r e s p o n s e s u r f a c e t e s t序号液料比/(m L/g)提取时间/m i n乙醇浓度/%花色苷含量/(m g/g)实际值预测值100013.4613.47 2-10013.1213.19 300013.4613.47 40-1-113.1013.02 500013.5013.47 600013.4813.47 7-1-1-112.8612.87 8-11113.2313.11 9-10013.1213.16 1010013.3113.24 1111113.2013.19 1201113.2913.35 1300013.4713.47 1401113.1913.27 150-1-113.1413.08 1610013.2813.23 171-1-112.7912.91表5 回归模型方差分析T a b.5 V a r i a n c e a n a l y s i s o f r e g r e s s i o nm o d e l 方差来源平方和自由度均方值值显著性M o d e l5.0390.5610.070.0030* -液料比0.6710.6712.010.0105-提取时间0.3510.356.350.0398-乙醇浓度1.0611.0619.050.0033*0.05110.0510.910.37160.01210.0120.220.65493.025E-313.025E-30.0540.822221.8911.8934.020.0006*20.8410.8415.180.0059*20.00010.0000.0001.0000R e s i d u a l0.3970.056L a c ko f F i t0.2130.0711.610.3207P u r eE r r o r0.1840.044C o rT o t a l5.421620.9283校正20.8361*(0.01<<0.05),差异显著应用D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件求解经过优化的回归方程得出,当提取温度为45℃,纤维素酶添加量为1.0m g/g时,超声酶辅助提取黑果枸杞花色苷的最佳工艺条件为:液料比25.07m L/g,提取时间30m i n,乙醇浓度75%.修正条件为:液料比25m L/g,提取时间30m i n,乙醇浓度75%.在此条件下提取得到的花色苷含量为(17.92±0.02) m g/g,与预测值基本相近,说明此响应面得出的最优条件是可行的.3.2.2 乙醇棷硫酸铵双水相萃取工艺优化 实验方案设计及结果如表6,经D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件回归拟合,得到二次多项回归方程:花色苷含量(m g/g)=15.51+0.31+0.091-0.39+ 0.94-0.49+0.34-1.032-0.762-0.832.通过对、、项系数绝对值的大小比较,各提取因素影响的重要程度顺序为:(硫酸铵质量分数)>(乙醇质量分数)>(萃取时间).表6 响应面试验结果T a b.6 R e s u l t o f r e s p o n s e s u r f a c e t e s t序号乙醇质量分数/%萃取时间/m i n硫酸铵质量分数/%花色苷含量/(m g/g)实际值预测值101-114.2313.06 201114.0113.96 300015.6215.35 40-1112.9313.31 5-10-113.3213.24 610-114.6314.63 7-11012.3212.57 811015.113.06 900015.6115.51 10-10113.6413.34 111-1013.2613 1200015.7515.51 1300015.2315.51 140-1-114.5114.56 151011315.51 1600015.3415.51 17-1-1014.2314.26由表7可知,<0.01代表模型差异极显著;0.01<<0.05代表模型差异显著;失拟项(=>第4期 薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究 第60卷况;矫正2=0.9410能够说明94.1%花色苷含量的变化.一次项影响极显著,影响显著,影响显著,交互项影响中、极显著,显著,二次项2、2、2影响极显著.在E t O H/(N H4)2 S O4双水相萃取花色苷中,每个提取因素都对花色苷的提取含量有显著影响.表7 回归模型方差分析T a b.7 V a r i a n c e a n a l y s i s o f r e g r e s s i o nm o d e l方差来源平方和自由度均方值值显著性M o d e l17.8891.9929.33<0.0001** -乙醇质量分数/%0.7710.7711.350.0119* -萃取时间/m i n0.06710.0670.980.3544-硫酸铵质量分数/%1.2111.2117.850.0039**3.5213.5251.910.0002**0.9510.9514.040.0072**0.4610.466.830.0348*24.4514.4565.64<0.0001**22.412.435.440.0006**22.9412.9443.350.0003**R e s i d u a l0.4770.068L a c ko f F i t0.2930.0962.050.25P u r eE r r o r0.1940.047C o rT o t a l18.351620.9742校正20.9410*(0.01<<0.05),差异显著.**(<0.01),差异极显著.应用D e s i g n-E x p e r t8.0.6软件求解经过优化的回归方程得出,响应面预测最佳方案为乙醇质量分数为24.61%,萃取时间35.92m i n,硫酸铵质量分数22.72%,预测黑果枸杞花色苷的提取含量为15.62m g/g.根据实验条件修正方案为乙醇质量分数为25%,萃取时间36m i n,硫酸铵质量分数为23%,在此条件下得到的花色苷含量为(15.46±0.31)m g/g,实际结果与预测值基本相符,说明了模型很好地预测了实际情况,响应面得到的最优条件是可行的.3.2.3 乙醇棷磷酸二氢钠双水相萃取工艺优化 实验方案设计及结果如表8,经D e s i g n-E x p e r t 8.0.6软件回归拟合,得到二次多项回归方程:花色苷含量(m g/g)=15+0.15+0.58+0.42-0.20-0.075+0.25-0.652-0.932-0.722.通过对、、项系数绝对值的大小比较,各因素影响的重要程度顺序为:(萃取时间)> (磷酸二氢钠质量分数)>(乙醇质量分数).表8 响应面试验结果T a b.8 R e s u l t o f r e s p o n s e s u r f a c e t e s t序号A乙醇质量分数/%B萃取时间/m i nC磷酸二氢钠质量分数/%花色苷含量/(m g/g)实际值预测值110-113.3213.43 201-113.2313.26 311014.113.95 400014.96155-10114.113.24 601114.5614.60 700015.14158-11013.9814.05 90-1112.9912.95 1010114.0214.12 111-1013.2613.19 12-10-113.112.99 1300014.8915 140001515 15-1-1012.3612.51 1600015.0215 170-1-112.6512.61表9 回归模型方差分析T a b.9 V a r i a n c e a n a l y s i s o f r e g r e s s i o nm o d e l方差来源平方和自由度均方值值显著性M o d e l13.0991.4571.38<0.0001** -乙醇质量分数/%0.1710.178.260.0239* -萃取时间/m i n2.6612.66130.4<0.0001** -磷酸二氢钠质量分数/%1.4211.4269.68<0.0001**0.1510.157.470.0292*0.02210.0221.10.32820.2510.2512.030.0104*21.7811.7887.26<0.0001**23.6213.62177.7<0.0001**22.1712.17106.33<0.0001**R e s i d u a l0.1470.02L a c ko f F i t0.1130.0364.310.0959P u r eE r r o r0.03448.42E-3C o rT o t a l13.231620.9892校正20.9754*(0.01<<0.05),差异显著;**(<0.01),差异极显著由表9可知,0.01<<0.05代表模型差异显著;<0.01代表模型差异极显著;失拟项(= >第60卷四川大学学报(自然科学版)第4期情况;矫正2=0.9754能够说明97.54%花色苷含量的变化.在E t O H /N a H 2P O 4双水相萃取花色苷中,每个提取因素都对花色苷的提取含量有显著影响.应用D e s i g n -E x p e r t 8.0.6软件求解经过优化的回归方程得出,最佳方案为乙醇质量分数24.08%,萃取时间为36.77m i n ,磷酸二氢钠质量分数为26.71%.为实验方便修正为乙醇质量分数24%,萃取时间为37m i n ,磷酸二氢钠质量分数为27%,在此条件下提取花色苷含量为(15.02±0.19)m g /g,说明响应面很好的预测了实际情况,得出的最优条件是可行的.3.3 黑果枸杞花色苷体外抗氧化活性结果采用2.2.1所述方法,结果如图2a 、2b 和2c所示,在6.25~200μg/m L 范围内,黑果枸杞花色苷L R N 、L R P 、L R E 对D P P H 自由基清除效果呈浓度依赖效应,不同提取方法的清除能力强弱顺序为:L R N >L R P >L R E .在6.25~200μg /m L 范围内,黑果枸杞花色苷L R N 、L R P 、L R E 均浓度依赖性对A B T S 有清除作用,不同提取方法的清除能力强弱顺序为:L R N >L R P >L R E .在6.25~200μg /m L 浓度范围内,黑果枸杞花色苷L R N 、L R P 、L R E 均浓度依赖性地反映了总还原能力的强弱,不同提取方法总还原能力强弱顺序为:L R N >L R P >L R E .采用斜率K 值来反映不同花色苷样品的总还原能力,斜率值越大,表明总还原能力越强,如表10所示.不同花色苷样品的I C 50值见表10.图2 不同提取方法黑果枸杞花色苷体外抗氧化能力(a )不同提取方法花色苷的D P P H 清除能力;(b )不同提取方法花色苷的A B T S 清除能力;(c)不同提取方法花色苷的总还原能力F i g .2 I nv i t r o a n t i o x i d a n t c a p a c i t y o f a n t h o c y a n i n s f r o m L y c i u mr u t h e n i c u m M u r r .u s i n g di f f e r e n t e x t r a c t i o nm e t h o d s (a )D P P Hs c a v e n g i n g a b i l i t y o f a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y d i f f e r e n tm e t h o d s ;(b )A B T S s c a v e n g i n g a b i l i t y o f a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b yd i f fe r e n tm e t h o d s ;(c )T o t a l r e d u c i n g c a p a c i t y of a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e db y di f f e r e n tm e t h o d s 表10 不同花色苷样品的抗氧化能力T a b .10 A n t i o x i d a n tc a p a c i t y o fd i f f e r e n ta n t h o c ya n i n s s a m pl e s 花色苷样品I C 50/(μg /m L )D P P H A B T S总还原力斜率值L R E 186.909±2.469178.843±1.6730.0007L R N 82.886±1.67374.723±0.1730.0017L R P 120.733±2.02388.282±0.7540.0010V C 5.695±0.0616.083±0.046B H T0.0031注:数据表示为平均值±标准差(=3),空白处表示未检测3.4 -B H P 诱导B R L3A 细胞损伤模型的建立本实验采用不同处理浓度-B H P (200、300、400、500、600、700、800和900μm o l /L )处理2h 来建立B R L3A 细胞损伤模型,由图3可知,-B H P浓度为200μm o l /L 时,细胞存活率与对照组相比显著下降,为26%左右;确定本实验中-B H P 对B R L3A 细胞最佳损伤浓度和时间为200μm o l /L 和2h .3.5 黑果枸杞花色苷对B R L3A 细胞毒性实验和保护作用由图4a 和4b 可知,在25~200μg/m L 浓度范围内,花色苷样品对B R L3A 细胞基本无毒副作用,此浓度范围可用于后续的实验研究.由图4c 和4d 可知,-B H P 损伤之后细胞存活率下降到44%,在10~100μg /m L 浓度范围内,L R E A 、L R N A 、L R P A 、L R E 、L R N 、L R P 细胞存活率最高分别恢复到71%、78%、72%、46%、81%和51%.当花色苷浓度小于60μg/m L 时,L R E A 、L R N A 、L R P A 、L R N 对B R L3A 细胞的保护作用均呈浓度依赖效应,花色苷浓度为60μg/m L 时对损伤细胞的保护效果最好当花色苷浓度大于第4期薛海瑞,等:黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究第60卷图3 200~900μm o l /L 的-B H P 处理B R L3A 细胞2h对细胞活力的影响**<0.01,与对照组相比F i g.3 E f f e c t so f 2ht r e a t m e n tw i t h200~900μm o l /L -B H Po nB R L3Ac e l l v i a b i l i t y**<0.01,c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l g r o u pL R N A 、L R P A 、L R N 花色苷对细胞的保护效果逐渐降低.L R E 、L R P 在10~100μg/m L 浓度范围内没有显著细胞保护作用.综上,在后续实验中,选用60μg/m L 继续探究不同花色苷样品的细胞保护作用.3.6 黑果枸杞花色苷对-B H P 诱导损伤的B R L 3A 细胞内活性氧的清除作用利用D C F H -D A 荧光探针,通过倒置荧光显微镜观察R O S 的生成,荧光强度与细胞内R O S 积累量呈现正相关.由图5荧光图以及流式量化结果分析可知,与对照组相比,模型组荧光强度显著增加,而L R N 、L R N A 花色苷处理组细胞的活性氧积累量显著降低,清除R O S 效果优于L R P 、L R -P A 、L R E 、L R E A ,说明L R N 、L R N A 、L R E A 、L R -P A 都能有效减缓-B H P 诱导的B R L3A 细胞内R O S 生成.流式结果图5c 表明L R N 、L R N A 清除RO S 效果较好,后续选择L R N 、L R N A 进行细胞膜损伤实验分析.图4 不同提取方法的花色苷对B R L3A 细胞基本无毒性并且对-B H P 诱导的损伤具有保护作用(a )纯化后不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的毒性作用;(b )未纯化不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的毒性作用;(c)纯化后不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的保护作用;(d )未纯化不同方法提取花色苷对B R L3A 细胞的保护作用;**<0.05,与对照组和-B H P处理组相比F i g .4 A n t h o c y a n i n s e x t r a c t e du s i n g d i f f e r e n tm e t h o d s a r e b a s i c a l l y no n -t o x i c t oB R L3Ac e l l s a n dh a v e a p r o t e c t i v e e f f e c t o n -B H P i n d u c e dd a m a ge (a )T o x i c i t y of a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y d i f f e r e n tm e t h o d s a f t e r p u r i f i c a t i o n o n B R L 3Ac e l l s ;(b )T o x i c i t y o f a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b yd i f -fe r e n tm e t h o d sw i t h o u t p u r if i c a t i o n o nB R L3Ac e l l s ;(c )P r o t e c t i v e e f f e c t o f p u r i f i e d a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y di f f e r e n tm e t h o d s o nB R L 3Ac e l l s ;(d )P r o t e c t i v e e f f e c t o f p u r i f i e d a n t h o c y a n i n s e x t r a c t e d b y d i f f e r e n tm e t h o d s o nB R L3Ac e l l s ;**<0.05,c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l g r o u p an d -B H P t r e a t m e n t g r o u p第60卷 四川大学学报(自然科学版) 第4期图5 细胞内活性氧水平检测(a)荧光显微镜观察R O S的生成(100×);(b)流式细胞仪分析细胞内R O S的生成;(c)流式细胞结果定量分析##<0.01与对照相比,**<0.01模型相比F i g.5 D e t e r m i n a t i o no f I n t r a c e l l u l a rR O SL e v e l s(a)R O S g e n e r a t i o nw a sv i s u a l i z e db y a f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e(100×);(b)R O S g e n e r a t i o nw a sd e t e c t e db y f l o wc y t o m e t e r;(c) Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e f l o wc y t o m e t r y r e s u l t s##<0.01v e r s u s c o n t r o l,**<0.01v e r s u sm o d e l3.7 黑果枸杞花色苷对-B H P诱导的B R L3A线粒体损伤的保护作用本实验利用J C-10荧光探针,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察线粒体的损伤程度.由图6a 可知模型组绿色荧光明显,说明线粒体膜电位下降,细胞膜受损,加药处理后可以观察到绿色荧光显著降低红色荧光显著增强,说明L R N、L R N A对线粒体具有保护作用,结合流式结果图6b、6c可知L R N、L R N A对-B H P诱导的细胞凋亡和线粒体损伤具有明显的保护作用.4 讨 论本研究采用单因素实验和响应面分析对不同提取方法进行了工艺优化,对比了不同方法提取得到的黑果枸杞花色苷的体外抗氧化活性.传统提取方法辅助手段单一且提取效率不高,本课题组采用超声波与纤维素酶两种手段辅助提取花色苷,得率更高.采用双水相萃取,与传统方法相比可以实现主要成分的纯化,条件更加温和,且不容易导致目的物质变性[15].通过响应面,优化了提取工艺,从而获得了黑果枸杞花色苷的最佳提取得率,为进一步的工业提取提供了基础资料.体外抗氧化实验(D P P H、A B T S自由基清除实验、总还原力测定实验),可以直接反应被检测物质的抗氧化活性,可以作为初步的体外抗氧化活性筛选.经过三种体外抗氧化实验研究,不同提取方法取得的花色苷体外抗氧化能力强弱的顺序为: L R N>L R P>L R E,说明双水相萃取的花色苷活性更强.在细胞实验中,使用-B H P建立了B R L3A 细胞损伤模型,通过检测细胞活力、R O S水平、细胞线粒体膜电位变化,探究不同花色苷样品对-。
钼提高植物抗逆性研究进展
第42卷 第6期2023年 11月华中农业大学学报Journal of Huazhong Agricultural UniversityVol.42 No.6Nov. 2023，50~58钼提高植物抗逆性研究进展秦晓明，赵优优，武松伟，胡承孝，孙学成华中农业大学新型肥料湖北省工程实验室/微量元素研究中心，武汉430070摘要 钼（Mo ）作为植物必需的微量元素，在促进植物生长发育和增强植物抗逆性方面发挥着关键作用。
植物对钼的吸收转运主要受到钼酸盐转运蛋白基因MOT1和MOT2调控，钼进入植物体内以含钼酶形式参与植物生长代谢，其中对植物抗逆性方面的调控主要表现为：钼通过含钼酶硝酸还原酶、醛氧化酶、黄嘌呤脱氢酶影响植物体内的光合碳氮代谢、激素合成和活性氧代谢进而调控植物抗寒性；钼通过硝酸还原酶和醛氧化酶介导的信号转导过程调控根系发育、养分水分利用及抗旱基因表达，进一步影响脂质合成与代谢调控植物抗旱性；最新研究还发现钼在植物适应盐胁迫、缓解重金属胁迫方面也具有重要作用。
这些研究结果为通过钼营养调控提升植物的抗逆性提供了新思路。
关键词 钼； 钼酶； 转运蛋白； 抗寒； 抗旱； 抗盐； 重金属抗性中图分类号 S143.7+1 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2023）06-0050-09农业生产会受到多种环境胁迫（如寒冷、干旱、盐碱、重金属等）的影响，如何通过营养调控提高植物的抗胁迫能力一直是科学家们关注的热点［1］。
大量元素磷、钾提高作物抗逆性的效应及机制较为明确，而微量元素与作物抗逆性的关系报道较少。
钼是植物体必需的微量元素，它在植物体的生理功能主要通过含钼酶来实现。
较早的研究发现低温处理下施钼增加了硝酸还原酶和黄嘌呤脱氢酶的活性，进而提高植物的低温耐受性［2］。
近年来，越来越多的研究证实钼不仅可提高植物抗寒性，还能提高植物抗旱、抗盐胁迫及抗重金属胁迫的能力。
本文以钼的吸收和转运、含钼酶调控的代谢过程为主线综述钼提高植物抗逆性的生理及分子机制，旨在为通过钼营养调控提升植物的抗逆性提供理论依据。
近三年承担的国家级代表性科研项目
国家计划
科技部
子课题
富油能源微藻的高通量筛选和系统评价
魏东
国家计划
科技部
子课题
植物生物质纤维改性和特种纸研究
付时雨
国家“”计划
科技部
面上项目
植物蛋白酶法改性共性关键技术研究
赵谋明
国家“”计划
科技部
一般项目
食品非热加工装备开发与新技术研究
曾新安
国家计划
科技部
子课题
生物质选择性快速热解制高品质燃油和化学品新技术
科技部
重大项目
烟道气利用及半碳法制糖工艺
扶雄
国家科技支撑计划
科技部
子课题
工作车速文化纸机的机电一体化系统集成工程
陈克复
Hale Waihona Puke 国家科技支撑计划科技部子课题
农作物秸秆生物转化制备燃料乙醇
林鹿
国家科技支撑计划
科技部
子课题
夹网成形器的研发
杨仁党
国家科技支撑计划
科技部
子课题
林纸一体化工程技术研究与示范
李军
国家科技支撑计划
武书彬
国家计划
科技部
子课题
磁性固定化酶高效制备低聚壳聚糖
李冰
国家计划
科技部
一般项目
高性能动力蓄电池隔膜的研制
梁云
国家计划
科技部
一般项目
木质纤维经乙酰丙酸脱羧脂化转化合成能源乙醇技术研究与开发
林鹿
国家计划
科技部
一般项目
抗性淀粉的酶法生产技术
高群玉
国家计划
科技部
一般项目
淀粉与聚乳酸反应共混制备生物全降解食品保鲜包装材料
赵海锋
玉米秸秆水解液为碳源培养产碱性蛋白酶耐高温菌株20101的研究
发酵 培养基 ： 萄糖 １ ， 白胨 １ ， 肉 葡 ０ｇ 蛋 ０ｇ 牛
膏 ｌ ， ａＩ５ｇ ， ２Ｐ ４１０ｇ Ｍ Ｓ ４ ． ， ０ｇ Ｎ Ｃ ＫＨ Ｏ ． ， ｇＯ ４ｇ 蒸 ０
馏 水 １ ｐ ００ Ｈ １ ．。 Ｌ， １２ 试 验 方 法 ．
１２１ 蛋 白 酶酶 活 力的 测 定 ．．
１０ ． ０ １０ ０
５Ｏ ． １０ ． １０ ５ ．０
０． ９
ｌ Ｏ ５０ ．
１０ ．
０４ ．
６ ０ ５Ｏ ． １０ ．
酪氨酸含量 ， ｕ ｇ
０４ｍ０ Ｌ碳 酸 钠 ／ ． ｌ ／ ｍＬ 福林酚试 剂 ／Ｌ ｍ
Ａ ０ ６８
０
５０ ． １ ． ０
１１１ 实验 仪 器 ．．
Ｈ Ｓ Ｈ水 浴 震 荡 器 ， 尔 滨 市 东 联 电 子 技 术 Ｚ— 哈 开 发 有 限公 司 ； Ｘ ９８ Ｅ数 显 电热 培 养 箱 ， ＨＰ 一 ０２ ＭＢ
作者 简 介 ： 李鸿 梅 （ ９ １ ） 女 ， １７ 一 ， 副教 授 ， 士 研 究 生导 师 ， 硕 主要 研 究方 向： 粮食 深加工 。
ａ ｄ ｓ ｉ．Ｔｈ ｒ ｎ ｐ ｒ ｎ ｙ ｏ ｙ ｉ ｉｃ ｅ ａ ｅ ｒ ｄ ｏ ｈ ａ ｅ ｎ ｐａ ｅ ｎ ｏｌ ｅ ｔａ ｓ ａ ｅ ｔｈ ｄｒ ｌｓｓ ｃｒ ｌ ｐｐ ａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｃ ｓ ｉ ｌｔｓ ｗｈｅ ｅ ｓｒ ｉ ０１ ｒ ｗ．Ｔｈ ｔａｎ ｇ ｅ ｒ ｔａｎ ２ ０１ ｇ ｅ ｅ ｓｒ ｉ ｗ ｒ
０２ ．℃恒 温 水 浴 中预 热 ５ｒｉ ，加 入 ｌ Ｌ稀 释 ｎ后 ａ ｍ １ ０倍 的样 品 液 混 匀 ，在 ４ ℃条 件 下 保 温 １ ｎ ０ ０ｍｉ， 在 ２ ｃ条 件 下 加 人 ２ｍ ５Ｃ Ｌ三 氯 乙酸 ，过 滤 去 除 沉 淀 。 １ｍ 取 Ｌ滤 液 加 入 ５ｍ ． ｍ ｌ Ｌ０４ ｏＬ的 Ｎ ２Ｏ 、 ／ ａ ，１ Ｃ ｍＬ福 林 酚试 剂 ， ４ ℃条 件 下 放 置 ２ ｎ显 色 。 在 ０ ０ｍｉ
国家级大学生创新创业训练计划
刘汉兰
20000
项目编号
项目名称
项目类型
项目负责
人姓名
指导教
师姓名
项目经费
（元）
201610504079
Bi/rGO/Bi2WO6三元复合材料的合成及光催化
性能研究
创新训练项目
刘文成
瞿阳
20000
201610504080
多孔金棒的生物模板合成方法研究
创新训练项目
梁晨楠
鲁哲学
20000
201610504081
20000
201610504050
白斑病毒分子蛋白A的分子研究
创新训练项目
李卓聪
兰江风
20000
201610504051
团头鲂颗粒溶素NK-lysin的生物学活性研究
创新训练项目
黄浩
袁改玲
20000
201610504052
光照和温度对蚤状溞生殖转化的诱导作用研究
创新训练项目
刘思甜
刘香江
20000
201610504053
创新训练项目
耿佩赟
பைடு நூலகம்刘睿
15000
201610504076
基于矩阵理论的亏损系统灵敏度模型
创新训练项目
黄文琳
沈婧芳
15000
201610504077
后基因组时代农药一基因相互作用数据库构建
创新训练项目
徐芳婷
位灯国，
郑芳
20000
201610504078
醚基离子液体的制备及其对纤维素溶解性能的
研究
创新训练项目
刘灵芝
20000
201610504090
大学生参与和使用众筹创业意愿及其影响因素 研究
提名国家自然科学奖项目公示项目名称生物质定向热解制取高品质液体
提名单位意见： 该项目在国家自然基金、863、973 等项目的资助下，针对生物质热解制取高品质 液体燃料中，由于含大量碳氧键，提质脱氧易缩聚的世界性难题，历经多年，解析了 生物质三组分（纤维素、半纤维素和木质素）碳氧键断键机理，提出了结构定向调变 预处理方法，发现了生物质直接催化热解一步法制备汽油、航油等不含氧燃料和生物 质快速热解-定向温和加氢制备醇类含氧燃料两条转化新途径，揭示了转化过程中碳氧 键演变机理和产物缩聚机制，提出了抑制缩聚方法，大幅提高了目标产物收率和品质。 该项目 8 篇代表性论文被欧、美、加、澳、中等国院士和著名学者在 Chem. Rev.、 Chem. Soc. Rev.等权威期刊 SCI 他引 567 次，获得了国内外同行的高度评价，为生物 质高值化科学与技术发展做出了突出贡献。项目负责人连续三年（2014-2016）入选能 源学科中国高被引学者，担任能源领域顶级期刊 Fuel Process. Technol.（IF3.75） 副主编，Int. J. Greenh. Gas. Con.（IF3.74） 、太阳能学报等期刊编委，教育部科 技委学部委员等学术兼职，具有广泛的学术影响。该项目曾获 2017 年教育部自然科学 一等奖，符合国家自然科学奖推荐条件，提名该项目申报 2018 年国家自然科学奖二等 奖。
代表性论文专著目录： （按照提名书表格列出主要内容，不需再做表格） 论 文 署 名 SC 论文专著 序 号 名称/刊名 /作者 影响 因子 年卷页 码 发 表 时 间 通 第 讯 一 作 作 者 者 国内作 者 I 他 引 次 数 他 引 总 次 数 单 位 是 否 包 含 国 外 单 位 Comparison of non-catalytic and catalytic fast 5.65 pyrolysis of corncob 1 in a fluidized bed reactor/Bioresource Technology/Huiyan Biomass fast He Zhang, Rui Xiao, pyrolysis a Huang, Gangin Xiao fluidized bed reactor under N2, CO2, 5.65 CO, CH4 and H2 1 atmospheres/Bioreso urce Technology/Huiyan Zhang, Rui Xiao, Denghui from Wang, Biodiesel palm Guangying He, oil via loading Shanshan Shao, KF/Ca-Al 3.21 Jubing Zhang, hydrotalcite 9 Zhaoping Zhong catalyst/Biomass & Bioenergy/Lijing Gao, guangyuan Teng, Guomin Xiao*, Ruiping Wei 2009 年 100 卷 1428-14 34 页 200 8年 张 张会岩， 09 肖 16 会 肖睿，黄 月 睿 7 岩 和，肖刚 30 日 张会岩， 2011 年 102 卷 4258-42 64 页 201 肖睿，王 0年 张 邓惠，何 12 肖 会 光莹，邵 月 睿 岩 珊珊，张 23 居兵，仲 日 兆平 2010 年 34 卷 1283-12 88 页 201 高李璟， 0年 肖 高 腾广远， 04 国 李 66 月 肖国民， 民 璟 28 魏瑞平 日
几种禾本科作物幼苗期谷胱甘肽过氧化物酶活力研究
几种禾本科作物幼苗期谷胱甘肽过氧化物酶活力研究杨继轩;任治鹏;徐悦;刘玉美;朱祥春;孟婧【摘要】采用DTNB直接法,对5种常见的禾本科作物小麦、高粱、玉米、大麦和水稻幼苗期不同器官的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力进行测定.结果表明,不同作物的不同器官GSH-Px活力不同,小麦、高粱和玉米根的GSH-Px活力较高,且小麦>高粱>玉米;大麦茎段的酶活力最高;水稻叶片的酶活力最高.各作物最高酶活力出现的时间不同,种子出芽后7 d,大麦茎段和水稻叶片的GSH-Px活力达到峰值,分别为80.50 U和45.17 U;高粱、玉米和小麦根系的GSH-Px活力分别在出芽后11、15、19 d达到峰值,酶活力分别为41.00、71.00、79.08 U.本研究可为禾本科作物源GSH-Px的开发利用提供参考.【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2018(000)005【总页数】4页(P1-3,5)【关键词】禾本科作物;幼苗期;谷胱甘肽过氧化物酶;酶活力【作者】杨继轩;任治鹏;徐悦;刘玉美;朱祥春;孟婧【作者单位】东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150030【正文语种】中文【中图分类】S51酶促抗氧化剂包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶（Se-GSH-Px）等。
多数类型的非生物胁迫（如干旱、盐胁迫、高温和低温胁迫）会破坏细胞的代谢平衡，导致活性氧（ROS）增加[1]。
GSH-Px 是一种含硒酶，其辅因子为硒元素，可以催化过氧化物分解，清除脂质过氧化物[2]和有机氢过氧化物，在ROS防御中起主要作用[3]。
复合胁迫下茭白体内镉、铅的亚细胞分布和植物络合素的合成
复合胁迫下茭白体内镉、铅的亚细胞分布和植物络合素的合成黄凯丰;江解增【摘要】以菱白(Zizania latifolia Turcz.)的单季茭品种‘蒋墅茭’和双季菱品种‘葑红早’为试材,进行Cd2+、Pb2+的单一及复合胁迫处理,测定了茭白根系和叶片中的非蛋白巯基(NPT)、谷胱甘肽(GSH)、植物络合素(PCs)的含量,同时测定了茭白植株各亚细胞组分中Cd2+、pb2+的积累量,以探讨茭白对重金属镉、铅胁迫的耐性机理.结果表明:Cd2+、pb2+的单一及其复合胁迫均能促进两菱白品种根系和叶片中NPT、GSH、PCs的含量及菱白各亚细胞组分中Cd2+、pb2+积累量的显著增加；复合胁迫时两茭白品种的NPT、GSH、PCs含量及各亚细胞组分中Cd2+、pb2+的积累量均高于单一胁迫,茭白的不同部位间,以根系中的NPT、GSH、PCs含量显著高于叶片；茭白各亚细胞组分中Cd2+、pb2+的积累量表现为:细胞壁高于原生质体,而可溶性部分高于细胞器.%A single-harvested cultivar,'Jiangshujiao',and a double-harvested cultivar, Fenghongzao', of Zizania latifolia were used as experimental materials to determine the content of non-protein-thiols (NPT), glutathione (GSH), and phytochelatins (PCs). To clarify the tolerance mechanism of Zizania latifolia to Cd2* and Pb2* stress, accumulation of Cd2* and Pb2* in subcellular fractions were also investigated. The results showed that content of NPT, GSH, and PCs and the accumulation of Cd2* and Pb2* in subcellular fractions increased significantly when treated with Cd2* and Pb2* stress. Content was higher when treated with combined stress than single stress. Content of NPT,GSH and PCs were significantly lower in leaves than in roots. The cell wall andthe soluble fraction of cells had higher Cd2+ and Pb2+ accumulation levels than the protoplast and the organelles, respectively.【期刊名称】《植物科学学报》【年(卷),期】2011(029)004【总页数】5页(P502-506)【关键词】茭白;胁迫;植物络合素;亚细胞组分;耐性机理【作者】黄凯丰;江解增【作者单位】扬州大学术生蔬菜研究室,江苏扬州225009;贵州师范大学生命科学学院植物遗传育种研究所,贵阳550001;扬州大学术生蔬菜研究室,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】Q945.78在重金属污染胁迫下，植物会启动多种不同的防御机制来降低重金属离子对细胞的毒害。
【国家自然科学基金】_碱性发酵_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
53 54 55 56 57 58 59 60 61
丁二酸 β -乳球蛋白 α -乳白蛋白 pseudomonas sp. ph调控 pcr-dgge d151树脂 ace抑制活性 2-酮基-l-古龙酸
1 1 1 1 1 1 1 1 1
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
53 54 55 56 57
2011年 科研热词 碱性蛋白酶 大豆分离蛋白 乳酸菌 餐厨垃圾 雅致放射毛霉 鉴定 酸性蛋白酶 酪蛋白水解物 起泡性 谷氨酰胺转移酶 表面性质 表层蛋白 血清生化 菌株 苏云金芽孢杆菌 脱氢酶 肉仔鸡 糖化 类蛋白反应 筛选 碳源 碱性发酵 盐分 生防细菌 生物质 甜瓜枯萎病菌 燃料乙醇 溶磷菌 温度 混合污泥 混合培养 涂膜 水解酸化 水解酶 氨基酸组成 氨基酸 植物致病真菌 枯草芽孢杆菌 果蔬 杀线虫活性 抗真菌活性 干酪乳杆菌 嵴岭分析 少孢根霉 壳聚糖衍生物 土壤 固氮菌 响应面法 响应面 可再生能源 发酵型黄芪提取物 厌氧发酵 推荐指数 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
科研热词 推荐指数 酶学性质 2 碱性蛋白酶 2 地衣芽孢杆菌 2 黑曲霉 1 骨髓间充质干细胞 1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 鉴定 1 里氏木霉 1 酯酶 1 通量 1 表达 1 血清生化指标 1 菌株筛选 1 芽孢杆菌 1 肉鸡 1 聚羟基丁酸与羟基辛酸 1 缓释微球 1 纳滤膜 1 纤维素酶 1 糠醛渣 1 筛选 1 碱性木聚糖酶 1 碱性成纤维细胞生长因子 1 碱性废水 1 短小芽孢杆菌 1 生产性能 1 混合污泥 1 混合发酵 1 水解产酸 1 木素 1 挥发性脂肪酸 1 截留率 1 增殖 1 固体发酵 1 响应面法(rsm) 1 响应面法 1 响应面分析法 1 同步糖化发酵 1 取代度 1 发酵条件优化 1 发酵型党参提取物 1 厌氧发酵 1 半干法 1 克隆 1 低取代度阳离子淀粉 1 传质机理 1 乙醇 1 rejection 1 ph调节 1 nanofiltration membrane 1 mass-transfer 1 flux 1
【国家自然科学基金】_植物抗逆性_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140731
推荐指数 6 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
推荐指数 8 3 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91
氧化胁迫 植物改良 杂种优势 数量性状 影响因子 尾矿库 实时荧光定量pcr 多样性 外来入侵植物 基因表达 基因型差异 基因克隆与异源表达 基因 品种选育 品种 发芽率(势) 发芽指数 原核表达 化感效应 化学组分 剑叶 分布格局 分布 傅里叶变换红外光谱 保护酶 产量 丛枝菌根真菌 wrky转录因子 sam合成酶 rt-pcr na+ mn毒 hsp100/clphiloxeroides
219525884_利用UPLC法对玉米须萜类物质提取工艺的比较分析
刘博，张树军，杨伊妮，等. 利用UPLC 法对玉米须萜类物质提取工艺的比较分析[J]. 食品工业科技，2023，44（14）：282−289. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080314LIU Bo, ZHANG Shujun, YANG Yini, et al. Comparative Analysis on Terpenoids of Extraction Process from Stigma Maydis by UPLC Method[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(14): 282−289. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080314· 分析检测 ·利用UPLC 法对玉米须萜类物质提取工艺的比较分析刘 博1，张树军1,2,3, *，杨伊妮1，王 丹1,2,3，孙立秋1,2,3，赵英楠1,2,3，王金兰1,2,3，赵 明1,2,3，李 军1,2,3，时志春1,2,3，王伟明4（1.齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省工业大麻加工技术创新中心，黑龙江齐齐哈尔 161006；3.国家市场监管技术创新中心（工业大麻），黑龙江齐齐哈尔 161006；4.黑龙江省中医药科学院中药研究所，黑龙江哈尔滨 150036）摘 要：为研究玉米须中萜类成分的提取工艺。
本文以玉米须中含有的玉米烯F （1）、3β-羟基-对映-贝壳杉-15-烯-17-酸-18-酯（2）和4α-羟基-19-降-对映贝壳杉烷型-15-烯-17-酸（3）为标准品，建立了玉米须提取物中三种萜类成分含量的测定UPLC 分析方法。
其色谱条件为：采用Polar C 18 100Ȧ（4.6 mm×150 mm ，2.6 μm ）色谱柱，以甲醇（A ）、0.1%磷酸-水溶液（B ）为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min ，柱温40 ℃，波长220 nm ，进样量5 μL 。
碱性双氧水预处理玉米秸秆性质研究
目前，常见的秸秆预处理手段包括物理法、化 学法、物理化学法及生物法等[4-6]。其中，化学处理 法操作便捷、经济，在实际应用中受到了广泛的关 注。化学处理法是指使用包括酸、碱及氧化剂在内 的化学试剂对秸秆进行预处理，其中碱处理在化学 处理方式中效果较优，常见的秸秆碱性处理方式包 括使用含氢氧化钠、氧化钙等碱性试剂的溶液浸泡 秸秆[7-9]，利用碱性物质的皂化作用，破坏纤维素、 半纤维素和木质素之间的结构，降低木质纤维素原
3. Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)
Abstract: The use of high alkaline hydrogen peroxide could dramatically enhance the enzymolysis of corn straw. The results showed that the optimal experiment condition was conducting straw with H2O2 and NaOH accounting 16% and 25.6% of the corn straw mass, respectively, at 40°C for 24 h. Enzymolusis of the straw pretreated by different agents showed the reducing sugar of corn straw pretreated by NaOH and alkaline hydrogen peroxide were 7.48 g/L and 8.26 g/L, respectively, while the reducing sugar of H2O and H2O2 pretreatment was only 1.35 g/L and 1.59 g/L. SEM and lignocellulose analysis reviewed that the lignin and cellulose in straw were mainly dissolved by NaOH and the surface structure of straw mainly destroyed by H2O2. The calculation of straw mass before and after pretreatment showed, although the present of H2O2 was not able to significantly enhance the mass loss of pretreated straw, it could decompose the macromolecule dissolved by NaOH. Therefore, the reaction mechanism and its productions should be further studied. Key words: straw pretreatment; alkaline hydrogen peroxide; enzymolysis; reaction mechanism
27040647_玉米秸秆皮、髓纤维素提取及表征
·玉米秸秆纤维素·玉米秸秆皮、髓纤维素提取及表征李梦扬李明昕张涛项钰洲岳金权*（东北林业大学生物质材料科学与技术教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨，150040）摘要：以玉米秸秆为原料，研究玉米秸秆皮、髓纤维素的性质。
玉米秸秆皮、髓分别用苯-醇抽提后，进一步用亚氯酸钠在酸性环境下脱除木质素，最后用氢氧化钾脱除多戊糖，得到玉米秸秆皮、髓纯化纤维素。
结果表明，秸秆皮中纤维束排列更整齐紧密，秸秆皮和髓化学组分相似。
从秸秆皮、髓得到的纯化纤维素得率分别为38.9%和38.2%，其中α-纤维素含量为87.5%和82.4%，绝大多数多戊糖和木质素被脱除。
秸秆皮、髓纯化纤维素的晶型结构仍为纤维素I 型，结晶度由纯化前的51.2%和30.4%提高到67.7%和42.1%；纯化纤维素的起始分解温度和最高分解温度相对于秸秆皮、髓均提高，热稳定性优于玉米秸秆皮、髓。
关键词：玉米秸秆；秸秆皮、髓；纤维素；纯化中图分类号：TS721+.4文献标识码：ADOI ：10.11980/j.issn.0254-508X.2022.05.009Extraction and Characterization of Cellulose from Corn Straw Bark and PithLI Mengyang LI Mingxin ZHANG Tao XIANG Yuzhou YUE Jinquan *（Key Lab of Bio -based Materials Science and Technology of Ministry of Education ，Northeast Forestry University ，Harbin ，Heilongjiang Province ，150040）（*E -mail ：yuejinq@ ）Abstract ：Corn straw was used as raw material to study the properties of cellulose in the bark and pith of corn straw.The purified cellulosefrom corn straw bark and pith was obtained by extracting the bark and pith with benzene -ethanol ，respectively ，and further removing lignin with sodium chlorite under acidic environment ，and finally removing pentosane by potassium hydroxide.The results showed that the fiber bundles in the straw bark were more neatly and tightly arranged ，and the chemical fractions of straw bark and pith were similar.The yield of purified cellulose from corn straw bark and pith were 38.9%and 38.2%，respectively ，of which the α-cellulose content was 87.5%and82.4%，respectively ，and most of pentosane and lignin were removed.The crystalline structure of purified cellulose from straw bark and pith was still cellulose type pared with corn straw bark and pith before purification ，the crystallinity of purified cellulose increasedfrom 51.2%and 30.4%to 67.7%and 42.1%，respectively.The starting and maximum decomposition temperatures of purified cellulosewere increased compared with those of straw bark and pith ，and the thermal stability was better than that of corn straw bark and pith.Key words ：corn straw ；corn straw bark and pith ；cellulose ；purification黑龙江省每年玉米秸秆产量约9万t [1]，资源丰富。
固体碱活性氧蒸煮用于木质生物质预处理和组分分离
固体碱活性氧蒸煮用于木质生物质预处理和组分分离蒋叶涛;林鹿【摘要】随着环境问题的日益突出和化石资源的逐渐枯竭,对可持续生物质资源的开发利用越来越引起人们的重视.由于木质生物质具有天然的抗降解屏障,有效预处理和组分分离被认为是实现生物质高值化利用的必要步骤,也是难点所在.近年来,基于生物质资源全组分、多元化综合利用的"生物精炼"理念兴起.基于生物精炼理念和绿色化学原则,笔者团队开发了一种新型的固体碱活性氧蒸煮预处理体系,并最终发展形成了系统的各组分高值化利用工艺路线.固体碱活性氧蒸煮工艺避免使用传统工艺常用到的水溶性强碱和含硫化合物,并以廉价的水为溶剂,成本低廉,环境友好,有很好的产业化利用前景.围绕固体碱活性氧作用机制、蒸煮工艺优化和各分离组分性质进行了概括总结,以期为该工艺的深入研究和木质生物质精炼技术的发展提供经验与参考.【期刊名称】《生物产业技术》【年(卷),期】2017(000)003【总页数】7页(P29-35)【关键词】木质生物质;生物精炼;固体碱;活性氧;制浆【作者】蒋叶涛;林鹿【作者单位】厦门大学能源学院生物质化学转化实验室,厦门 361102;厦门大学能源学院生物质化学转化实验室,厦门 361102【正文语种】中文林鹿，教授，博士生导师，厦门大学能源学院副院长，厦门现代农业生物质高值化技术重点实验室主任，Journal of Bio-Based Materials and Biofuels、Journalof Bioprocessing and Bioenergy和Frontiers in Bioenergy and Biofuels等杂志编委。
近5年，先后承担了10多项包括“973”计划课题、科技支撑计划课题、“863”计划项目、国家自然科学基金-广东联合基金重点项目、福建省产学研合作重大攻关项目、厦门市重大科技创新平台项目以及大型企业集团技术开发项目等的研究工作；在国内外有关刊物上发表科技论文200多篇，其中被SCI收录论文110多篇；申请发明专利40多项，获发明专利近20项；出版专著《制浆漂白生物技术》（2002年）、《生物质基乙酰丙酸化学与技术》（2009年）和《制浆漂白生物技术与原理》（2012年）。
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2010年9月农业机械学报第41卷增刊DO I :10.3969/j .issn .100021298.2010.Supp.030碱性氧化物预处理玉米秸秆维管柱、皮层和表皮研究3杨培周 姜绍通 郑 志 罗水忠 高星星(合肥工业大学生物与食品工程学院,合肥230009) 【摘要】 以玉米秸秆的维管柱、皮层和表皮为材料,分别考察固液比、发酵时间、碱性氧化物浓度和预处理时间对发酵液中还原糖含量以及FP A 酶活的影响;通过正交试验进一步优化糖化条件,结果表明,在固液比、发酵时间、碱性氧化物、预处理时间分别为1∶20、5d 、1%、3d,1∶15、515d 、1%、315d 和1∶15、5d 、1%、3d 条件下,发酵液中的还原糖含量最高,维管柱、皮层和表皮分别为15192%、12143%和5193%;木质纤维素糖化率分别为31184%、18165%和819%。
在糖含量较低时,FP A 与还原糖含量变化趋势基本一致。
关键词:玉米秸秆 木质纤维素 预处理 里氏木霉 糖化中图分类号:S38文献标识码:A文章编号:100021298(2010)S020137204Pretrea t m en t of M i cro 2colu mn ,Cortex and Ep i derm is ofCorn Stover by A lka li O x i deYang Peizhou J iang Shaot ong Zheng Zhi Luo Shuizhong Gao Xingxing(School of B iotechnology and Food Engineering,Hefei U niversity of Technology,Hefei 230009,China )AbstractM icr o 2colu mn,cortex and ep ider m is of corn st over were used t o p r oduce cellulases .The effects of s olid 2liquid rate (S L ),fer mentati on ti m e (FT ),concentrati on of alkali oxide (AO )and p retreat m ent ti m e (PT )on reducing sugar contents and filter paper activity (FP A )of the s oluti on in the br oth were investigated .O rthogonal tests were perfor med t o op ti m ize the saccharificati on conditi ons further .The results showed that the highest contents of reducing sugars were deter m ined f or the m icr o 2column,cortex and ep ider m is of corn st over under the conditi ons of S L 1∶20/FT 5d /AO 1%/PT 3d,S L 1∶15/FT 515d /AO 1%/PT 315d and S L 1∶15/FT 5d /AO 1%/PT 3d,res pectively .The contents of reducing sugar reached 15192%,12143%and 5193%,and the highest saccharificati on percentages of thelignocellul oses reached 31184%,18165%and 819%,res pectively under the above conditi ons .The devel op ing trend of filter paper activity was si m ilar t o the concentrati on of reducing sugar under l ower concentrati ons of reducing sugar .Key words Corn st over,L ignocellul oses,Pretreat m ent,Trichoder ma reesei,Saccharificati on收稿日期:2010207201 修回日期:20102072163“十一五”国家科技支撑计划资助项目(2007BAD34B00)和合肥工业大学科学研究发展基金资助项目(1132036404)作者简介:杨培周,博士后,主要从事生物炼制和酶工程研究,E 2mail:yangpeizhou@ 通讯作者:姜绍通,教授,博士生导师,主要从事农产品生物化工研究,E 2mail:jiangshaot ong@yahoo 引言生物质的高效糖化是制备生物燃料以及生物化工材料基质的前提和关键,其中,原料的预处理是糖化的必要过程[1～2]。
目前,主要采用物理法(粉碎、研磨、蒸煮、CO 2气爆、热解[3～4]、化学法(酸[5～6]、碱、过氧化物法、离子液催化[7～8]等)、物理化学联合法(碱气爆,氨气爆、碱微波[9])和生物法[10～11]等技术预处理原料以破坏晶体结构,增大木质纤维素的表面积,提高对纤维素酶的可及性和敏感度。
其中,碱性双氧水预处理不仅能够高效脱除木质素,减小结晶度,而且处理过程中生成的副产物对微生物发酵以及纤维素酶活的抑制作用小[12]。
不同种类秸秆以及同一种类不同部位的木质纤维素结构存在差异,不同组织结构的木质纤维素结晶特性影响预处理的效果,但对秸秆各组分进行预处理却鲜有报道。
本文以玉米秸秆为材料,考察各组分(维管柱、皮层和表皮)对预处理后发酵过程中木质纤维素糖化的影响,为玉米秸秆高效预处理提供参考。
1 材料与方法111 玉米秸秆预处理玉米秸秆取自安徽肥东县农田,为农民收获玉米后遗留在农田里的秸秆。
秸秆主要结构为维管柱、皮层和表皮(图1)。
去除玉米植株的叶子、根和灰尘,晒干,切割成维管柱、皮层和表皮,粉碎至1～3mm 长度。
称取粉碎后的玉米维管柱、皮层和表皮各15g,根据试验设计加入不同比例和不同浓度的氢氧化钠溶液(碱液中含1%过氧水)浸泡,自来水冲洗至pH 中性,尼龙布过滤,70℃干燥至恒重,然后粉碎至直径011～015mm 的粉末。
图1 玉米秸秆的维管柱、皮层和表皮横切面模式图Fig .1 Cr oss 2secti on model of m icr o 2colu mn,cortex and ep ider m is of corn st over112 糖化里氏木霉13052(ATCC56765)购自中国工业微 生物菌株保藏管理中心。
通过诱变选育出突变株Tr 228。
以秸秆为唯一碳源的发酵液中,该菌种分泌的纤维素酶系高效降解木质纤维素底物,转化为还原糖。
发酵产糖培养基为(NH 4)2S O 42%;KH 2P O 4011%;Na NO 3013%;MgS O 4・7H 2O 0105%,根据DNS 法测定总还原糖的含量[13]。
113 试验设计根据单因素的试验结果,选择正交试验的因素(表1),采用正交表L 9(34)。
表1 正交试验因素水平Tab .1 Factor level by orthogona l test水平因素发酵时间A /d碱液质量分数B /%浸泡时间C /d固液比D12150152151∶1523101103101∶1033151153151∶202 结果与分析211 固液比21111 固液比对还原糖含量的影响将不同类型的秸秆以1%碱性双氧水浸泡2d,发酵3d,考察固液比对还原糖和FP A 酶活的影响。
结果表明,各类型秸秆在固液质量比为1∶5和1∶10时的还原糖含量较低,为015%～1%;固液比为1∶15时,还原糖含量迅速增大,最高达到319%;固液比为1∶20和1∶25时,还原糖含量逐渐降低。
还原糖含量最高的固液比为1∶15,维管柱为底物发酵的发酵液中还原糖最多,以皮层和表皮为底物发酵的还原糖含量相近,如表2所示。
表2 固液比对发酵液中还原糖含量的影响Tab .2 Effect of reduc i n g sugar concen tra ti on s i n broth on the soli d 2li qu i d ra te%组分固液比1∶51∶101∶151∶201∶25维管柱0159±01040182±01073192±01113161±01042114±0109皮层0161±01020195±01022183±01122142±01052145±0105表皮0165±01050180±01042194±01232180±01122131±010821112 固液比对FP A 酶活的影响比较不同固液比对发酵液中FP A 酶活的影响,如表3所示,结果表明,固液比为1∶15时的FP A 酶活最高,以预处理后维管柱为底物发酵的产FP A 酶活性最高,达3112U /mL,其次为皮层。
212 发酵时间21211 发酵时间对还原糖含量的影响测定发酵3～7d 发酵液中的还原糖含量,如图2所示,结果表明,产糖量最高的为维管柱为底物,其次为皮层,最小的为表皮。
3种底物的还原糖 831农 业 机 械 学 报 2010年表3 固液比对FPA 酶活的影响Tab .3 Effect of f ilter paper acti v ity i n broth on soli d 2li qu i d ra teU /mL组分固液比1∶51∶101∶151∶201∶25维管柱1123±01052135±01253110±01121155±01320188±0109皮层1131±01032125±01053112±01051164±01250190±0107表皮1152±01042171±01112180±01022104±01051151±0101图2 发酵时间对发酵液还原糖含量的影响Fig .2 Effect of fer mentati on ti m e on reducingsugar concentrati ons in br oth含量趋势基本一致,3～5d 还原糖含量逐渐增加,第5天还原糖含量最高,第6天开始下降。