电针对帕金森病模型大鼠黑质细胞线粒体复合物活性的影

电针对帕金森病模型大鼠黑质细胞线粒体复合物活性的影响王彦春王培峻马骏许永海梁少荣何方周丹（湖北中医药大学，湖北武汉430061）〔摘要〕目的通过检测帕金森病（PD ）模型大鼠黑质细胞线粒体复合物活性的改变，探讨电针治疗对黑质细胞线粒体功能的影响，以期揭示电针治疗PD 的机制。

方法将48只SD 雄性大鼠随机分成4组：正常组、溶剂对照组、模型组、电针治疗组；采用鱼藤酮颈背部皮下注射法制备模型，按行为学评分标准记分；治疗结束后采用免疫组织化学技术检测中脑黑质酪氨酸羟化酶（TH ）阳性神经元数目；同时采用紫外分光光度法检测线粒体复合物Ⅰ Ⅳ的活性。

结果与模型组相比较，电针治疗组行为学异常明显改善（P ＜0.05）。

电针治疗组黑质TH 阳性神经元数目较模型组显著增加（P ＜0.01）。

模型组的线粒体复合物Ⅰ的活性明显低于正常组（P ＜0.01），电针治疗组的线粒体复合物Ⅰ的活性明显高于模型组（P ＜0.01）。

各组线粒体复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ无显著差异。

结论粒体复合物Ⅰ功能障碍在PD 发病中占有重要的地位，并可能是针刺治疗作用的靶点之一。

〔关键词〕帕金森病；黑质细胞；电针；线粒体；复合物〔中图分类号〕R749〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2013）03-0581-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2013.03.041Effects of electroacupuncture on the activity of mitochondrial complexes in Parkinson's disease model rat's nigral cellWANG Yan-Chun ，WANG Pei-Jun ，MA Jun ，et al .Hubei University of TCM ，Wuhan 430061，Hubei ，China【Abstract 】Objective To explore the effects of electroacupuncture treatment on nigral cell mitochondria function in Parkinson's dis-ease （PD ）model rats and reveal the mechanism of acupuncture treatment on PD by detecting mitochondrial complexes activity change of PD model rat nigral cell.Methods 48SD rats were divided into 4groups randomly ：normal ，solvent control ，model and electroacupuncture therapy groups.PD model was made by subcutaneous injection of rotenone in the back of neck.The behavior of rat was scored according to the standard of the behavior science calculated.TH positive neuron count of substantia nigra was detected by immunohistochemical method.The activity of mitochondrial complex Ⅰ Ⅳwere detected by ultraviolet spectrophotometry.Results Compared with model group ，the ab-normal changes of electroacupuncture therapy group were small （P ＜0.05）.Compared with model group ，TH positive neuron count of sub-stantia nigra of electroacupuncture therapy group was increased significantly （P ＜0.01）.The activity of mitochondrial complex Ⅰof model group was lower than that of normal group （P ＜0.01），and the activity of mitochondrial complex Ⅰof electroacupuncture therapy group was lower than that of model group （P ＜0.01）.While the activity of mitochondrial complex Ⅱ，Ⅲand Ⅳhad no obvious difference.Conclu-sions Electroacupuncture therapy can improve the abnormal behaviors and the activity of mitochondrial complexes and also can reduce the loss of dopamine neurons in substantia nigra.It explains that the dysfunction of mitochondrial Ⅰplays an important role in PD and it also can be one of the target points of electroacupuncture therapy.【Key words 】Parkinson's disease ；Nigral cell ；Electroacupuncture therapy ；Mitochondrial ；Complexes基金项目：国家自然科学基金项目（30300461，30973787，30973809）；湖北省科技厅科学技术项目（2009CDA068，2010CDA101）；湖北省教育厅科学技术研究项目（D200726001，Z20091601）；武汉市科学技术局科学技术研究项目（201060623269）通讯作者：马骏（1964-），女，教授，博士，主要从事中医药防治脑病研究。

第一作者：王彦春（1971-），男，教授，博士，主要从事中医药防治神经系统变性疾病研究。

帕金林病（PD ）的病因和发病机制迄今仍未彻底明确。

针对线粒体功能改变的研究，对阐明PD 的发病机制及指导临床治疗具有重要的意义。

临床针对PD 的治疗主要用多巴类药物以补充脑内DA 的含量，改善患者症状，但不能抑制疾病的发展且具有明显的副作用。

而针灸疗法能提高L-D A 类药物疗效，降低药物剂量和减少并发症，有效减缓PD 发展，是一种安全的自然疗法〔1，2〕，但机制不明。

本实验通过观察电针对PD模型大鼠的黑质酪氨酸羟化酶（TH ）阳性神经元数目及线粒体呼吸链复合物Ⅰ Ⅳ活性的影响，初步探讨电针治疗PD 。

1材料与方法1.1主要试剂及仪器鱼藤酮（Rotenone ）及葵花油乳化液（Sunflower oil ）购于Sigma 公司，水合氯醛、多聚甲醛、磷酸氢二·185·王彦春等电针对帕金森病模型大鼠黑质细胞线粒体复合物活性的影响第3期钠、磷酸二氢钠、氯化钠均为国产分析纯，即用型SABC 免疫组化染色试剂盒，考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒，线粒体分离试剂盒、线粒体呼吸链复合物Ⅰ Ⅳ活性比色法定量检测试剂盒购于GENMED 公司。

G6805电针治疗仪，低温超速离心机，752紫外可见分光光度计等。

1.2实验动物清洁级SD 大鼠48只，雄性，体重180220g ，购于华中科技大学同济医学院实验中心，许可证号：SCXK （鄂）2004-0007。

经过三次行为测试确认无自发行为异常后随机分为4组：①正常组；②溶剂对照组；③模型组；④电针治疗组。

正常组不做任何处理，假手术组只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液，余下2组先造模，再作相应处理。

1.3PD 大鼠模型制备将鱼藤酮溶解于葵花油乳化液中，浓度为2mg /ml ，棕色试剂瓶保存。

取大鼠称重，采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备模型，注射剂量为2mg ·kg －1·d －1。

每天注射一次，连续注射28d ，制备PD 大鼠模型。

通过观察大鼠的行为学改变及免疫组织化学技术检测中脑黑质神经元数目以确定PD 模型造模成功。

1.4电针治疗电针治疗组大鼠自造模7d 后开始电针治疗，参照华兴邦《实验动物穴位图谱》〔3〕取风府、太冲（太冲穴隔天左右交替使用），用0.5寸毫针针刺，接G6805电针治疗仪，连续波，频率2Hz ，每次治疗30min ，每天1次，治疗21d 。

1.5行为学观察自造模开始后，每天注意观察和记录各组大鼠的毛色、弓背、拒捕行为、不自主运动等行为。

采用陈忻等〔4〕制定的鱼藤酮PD 大鼠神经行为学评分体系对大鼠的行为学改变进行评分，记录造模7d （开始电针治疗）及造模28d （电针治疗结束）大鼠的行为学评分。

1.6免疫组化染色检测TH 的表达每组随机选取6只大鼠以水合氯醛麻醉后，先用250ml 生理盐水行左心室灌流，再用0.1mmol /L 的PBS 配制的4%的多聚甲醛溶液灌注固定。

取出脑组织置于4%的多聚甲醛溶液中继续固定24h ，石蜡包埋后行连续冠状切。

免疫组化SABC 法检测TH 。

免疫组织化学图像采用Image-Pro Plus software 对切片进行图像分析，所有切片均采用同一光强度，每个标本取相邻的3张切片，观察黑质区相同面积，分析阳性数密度及阳性面密度。

1.7线粒体的提取余下各组大鼠用水合氯醛麻醉后，于冰盘上迅速断头取出中脑黑质组织块，置于液氮罐中保存。

使用GENMED 动物组织线粒体分离试剂盒，采用组织匀浆法提取线粒体，放进-70ħ冰箱中保存。

1.8线粒体复合物Ⅰ Ⅳ活性检测运用线粒体复合物活性比色测定相应线粒体复合物的活性，具体的操作步骤参照定量检测试剂盒产品说明书用紫外分光光度法进行测定。

1.9统计学方法应用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析。

组间差异采用t 检验分析。

结果以x ʃs 表示。

2结果2.1电针对PD 模型大鼠行为学的影响自造模开始3 5d后，模型组逐渐出现毛色变脏变黄、运动缓慢、弓背、拒捕行为减弱及震颤等不自主运动，且随着造模时间延长，上述表现逐步加重。