提高D-酪氨酸生产效率的方法与相关技术

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本技术介绍了一种提高D酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。本技术通过分子生物学手段构建了一株双质粒共表达的重组菌，同时实现三种酶的高效表达，将L酪氨酸转化为D酪氨酸，并通过偶联辅酶再生系统，将NADP+转化为NADPH，使得NADPH循环再生，转化能够高效进行。并通过优化全细胞转化条件，实现了D酪氨酸的高效生产。通过本技术生产的D酪氨酸产量可达8.4g/L，转化率达93％。

技术要求

1.一种生产D-酪氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱

氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶选自奇异变形杆菌，

所述D-氨基酸脱氢酶选自谷氨酸棒状杆菌，所述葡萄糖脱氢酶选自巨大芽孢杆菌。

4.根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

5.一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-4任一

所述的重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生系统。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP+转化为NADPH。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化条件是：pH 7～9，转化温度为15～37℃，转化时间20～24h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用权利要求1-4任一所述的重组菌的湿细胞进行转化。

9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～

1500mmol/L，NADP+浓度为0.4～0.6mmol/L。

10.权利要求1-4任一所述的重组菌在食品、制药或化工领域的应用。

技术说明书

一种提高D-酪氨酸生产效率的方法

技术领域

本技术涉及一种提高D-酪氨酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-酪氨酸是一种非天然手性氨基酸，是多肽药物和抗肿瘤手性药物的重要中间体。以D-酪氨酸为手性前体可合成阿托西班、多肽、茴香霉素等物质，其中，阿托西班是一种保胎药；多肽在恶性肿瘤的治疗中具有特殊疗效；茴香霉素能够抗原虫、抗真菌、抗变形虫和抗肿瘤。

目前，D-酪氨酸的合成方法主要包括化学拆分法、生物拆分法和酶转化法。化学拆分法面临拆分试剂贵、反应条件苛刻、产物收率低的问题。生物拆分法是利用普通变性杆菌细胞为生物催化剂，选择性降解D/L-酪氨酸中的L-酪氨酸来制备D-酪氨酸，但收率也极低。而酶转化法反应条件温和、立体选择性高、效率高，且方便快捷易操作，具有广阔的工业化开发前景。但目前有关酶转化法生产D-酪氨酸的报道较少，有文献利用奇异变形杆菌来源的L-氨基酸脱氨酶、嗜热共生细菌来源的D-氨基酸脱氢酶转化L-酪氨酸来生产D-酪氨酸，并利用稳定伯克霍尔德菌来源的甲酸脱氢酶来实现辅酶NADPH的再生。但该级联系统对L-酪氨酸的转化率较低，只有45.3％。

技术内容

本技术的第一个目的在于提供一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达L-氨基酸脱氨酶、D-氨基酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，所述双质粒包括pRSFDuet-1质粒和pACYCDuet-1质粒。

在本技术的一种实施方式中，所述pRSFDuet-1质粒用于表达L-氨基酸脱氨酶，所述pACYCDuet-1质粒用于表达D-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

在本技术的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)选自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码L-氨基酸脱氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本技术的一种实施方式中，所述D-氨基酸脱氢酶(D-AADH)选自文献中报道的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述D-氨基酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本技术的一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶(GDH)选自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本技术的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

本技术第二个目的在于提供了一种转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法，所述方法为利用上述重组菌将L-酪氨酸转化为D-酪氨酸，并偶联辅酶再生体系。

在本技术的一种实施方式中，所述辅酶再生系统以D-葡萄糖为底物，通过葡萄糖脱氢酶将NADP+转化为NADPH的辅酶再生系统。

在本技术的一种实施方式中，所述转化的体系中，L-酪氨酸浓度为50～150mmol/L，D-葡萄糖浓度为300～900mmol/L，氯化铵浓度为500～1500mmol/L，NADP+浓度为0.4～

0.6mmol/L，所述重组菌经培养后以菌液的形式添加，转化温度为15～37℃，转化pH为7～9，转化的时间为20～24h。

在本技术的一种实施方式中，所述菌液的制备方式为离心收集菌体后溶于pH为7.0～9.0的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，菌体的添加量为10～30g/L。

本技术的第三个目的在于提供上述重组菌在食品、制药或化工中的应用。

本技术的有益效果：

(1)本技术所提供的利用重组菌转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的方法中，转化底物为价格低廉的L-酪氨酸，三种酶可在一种重组菌中同时高效表达，所述重组菌可大量培养，不需经过细胞破碎、冷冻干燥等处理过程，成本较低且操作简便，依据本技术可建立一个高效、低成本、易于工业化放大生产的生物酶法合成工艺。

(2)本技术所述的生产方法在将中间产物转化为D-酪氨酸的过程中利用辅酶再生系统，将NADP+转化为NADPH，使得NADPH在体系中能循环再生，转化能够高效进行。

(3)本方法具有专一性强、底物成本低、产物光学纯度高等优点，采用本方法制备D-酪氨酸，添加L-酪氨酸50mmol/L，D-酪氨酸产量为8.4g/L，转化率达93％以上，转化周期需24h。

附图说明

图1：转化L-酪氨酸生产D-酪氨酸的反应原理图。

图2：不同缓冲液种类对转化率的影响。

图3：不同缓冲液pH对转化率的影响。

图4：底物浓度对转化率的影响。