医学课件细胞总RNA提取及逆转录
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外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录
3. 4℃，12000rpm，离心10min。去上清，加入 500ul70%乙醇（不吹打！）4℃，12000rpm， 离心10min，去上清，烘干。
4. 加10ul DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。
逆转录-PCR的原理
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作 为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录 酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进 行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连 续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核 细胞中表达。
RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、 且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的 RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的 活性，减少RNA的降解。
抑制RNA酶活性的试剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能 够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以 抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括 RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA 酶活性。
实验步骤—— PCR扩增
反应体系：
10×Buffer 2 ml
Mg2+
1.5 ml
dNTP
2 ml
cDNA
5 ml
Taq
0.2 ml
primer
2 ml
ddH2O 总体积
17.3 ml 30 ml
反应条件： 94℃ 5min 94 ℃ 45s 56 ℃ 30s ×30c 72 ℃ 30s 72 ℃ 5min 4 ℃ 保存
结果与分析
PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，标明目的条 带，非目的条带。
具体实验结果分析，如果实验失败，请分析 原因，按实际实验出发。
注意事项——预防RNase污染
4. 加10ul DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。
逆转录-PCR的原理
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作 为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录 酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进 行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连 续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核 细胞中表达。
RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、 且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的 RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的 活性，减少RNA的降解。
抑制RNA酶活性的试剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能 够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以 抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括 RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA 酶活性。
实验步骤—— PCR扩增
反应体系：
10×Buffer 2 ml
Mg2+
1.5 ml
dNTP
2 ml
cDNA
5 ml
Taq
0.2 ml
primer
2 ml
ddH2O 总体积
17.3 ml 30 ml
反应条件： 94℃ 5min 94 ℃ 45s 56 ℃ 30s ×30c 72 ℃ 30s 72 ℃ 5min 4 ℃ 保存
结果与分析
PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，标明目的条 带，非目的条带。
具体实验结果分析，如果实验失败，请分析 原因，按实际实验出发。
注意事项——预防RNase污染
RNA基本操作技术ppt课件
免 疫 磁 珠 法 原 理
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
2、RNA的浓度
OD260 值 =1 ， 相 当 于 单 链 DNA 或 RNA 为 40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
3、RNA的完整性
rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度 接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加 0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟， 12000g离心10分钟
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例 加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然 后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分 钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并 保存于-70℃
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RNA的纯度、浓度与完整性
1、RNA的纯度
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0 之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
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2、RNA的浓度
OD260 值 =1 ， 相 当 于 单 链 DNA 或 RNA 为 40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。
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3、RNA的完整性
rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度 接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加 0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟， 12000g离心10分钟
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例 加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然 后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分 钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并 保存于-70℃
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RNA的纯度、浓度与完整性
1、RNA的纯度
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0 之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
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总RNA的提取和RT-PCRPPT课件
实验材料：HEK293人胚肾细胞
2020/2/14
12
操作步骤
1. 细胞中加入1 ml Trizol（RNAisoPlus）用移液枪反复吹吸直无明显沉 淀后，室温放置5min，使其充分裂解。
（注意：此时可放入-70℃长期保持。 ）
2. 按200 ul 氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3 min。
总RNA的提取、定量与 RT-PCR
周珏宇 博 士
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2020/2/14
1
目的
完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如 Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、 cDNA合成及体外翻译等的前提。
掌握从细胞中提取总RNA的方法
（注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层 酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。）
2020/2/14
13
操作步骤
5. 加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4℃放置5-10 min。 6. 4℃ 12,000g离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉
淀。 7. 加入1 ml 75%乙醇，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。 8. 4℃ 12,000g离心5 min，尽量弃上清。 9. 室温晾干或真空干燥5 min。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很
2020/2/14
15
紫外吸收检测RNA的浓度
10
加 样 枪 的 使 用
2020/2/14
11
操作步骤
样品处理
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行 裂解；
2020/2/14
12
操作步骤
1. 细胞中加入1 ml Trizol（RNAisoPlus）用移液枪反复吹吸直无明显沉 淀后，室温放置5min，使其充分裂解。
（注意：此时可放入-70℃长期保持。 ）
2. 按200 ul 氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3 min。
总RNA的提取、定量与 RT-PCR
周珏宇 博 士
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2020/2/14
1
目的
完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如 Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、 cDNA合成及体外翻译等的前提。
掌握从细胞中提取总RNA的方法
（注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层 酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。）
2020/2/14
13
操作步骤
5. 加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4℃放置5-10 min。 6. 4℃ 12,000g离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉
淀。 7. 加入1 ml 75%乙醇，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。 8. 4℃ 12,000g离心5 min，尽量弃上清。 9. 室温晾干或真空干燥5 min。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很
2020/2/14
15
紫外吸收检测RNA的浓度
10
加 样 枪 的 使 用
2020/2/14
11
操作步骤
样品处理
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行 裂解；
总RNA的提取和RCRPPT课件
除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸 水配制，然后经滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
加 样 枪 的 使 用
操作步骤
样品处理
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行 裂解；
RNA酶污染来源
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌 等。
严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于 操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器 械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各 种试剂的污染。
最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中 则含有大量内源性的RNA酶。
悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 ×106个细胞加1ml Trizol后，反复用 枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。
培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体 积按10cm2/ml比例加入。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与 Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)
难溶解。） 10. 加入10 ul无RNase的水，充分震荡混匀。
紫外光吸收法
原 理：
1. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2. 而且物质对光的吸收是具有选择性的 3. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱
因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会 被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度 有一定的比例关系.
操作步骤
5. 加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4℃放置5 min。 6. 4℃ 12,000g离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉
加 样 枪 的 使 用
操作步骤
样品处理
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行 裂解；
RNA酶污染来源
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌 等。
严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于 操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器 械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各 种试剂的污染。
最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中 则含有大量内源性的RNA酶。
悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 ×106个细胞加1ml Trizol后，反复用 枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。
培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体 积按10cm2/ml比例加入。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与 Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)
难溶解。） 10. 加入10 ul无RNase的水，充分震荡混匀。
紫外光吸收法
原 理：
1. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2. 而且物质对光的吸收是具有选择性的 3. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱
因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会 被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度 有一定的比例关系.
操作步骤
5. 加入等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4℃放置5 min。 6. 4℃ 12,000g离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉
RNA提取-反转录-半定量PCR
RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。
用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。
分子生物学 第7章 RNA复制与逆转录ppt课件
精选ppt课件2021
19
tRNA
R U5 PB
gag
R′ U′5
R U5 PB
gag
R′ U′5
PB
gag
负链 DNA
An
pol
env
U3 R
以 tRNA 为引物开始合成 cDNA 负链
pol
env
U3 R An
RNase H 降解模板 R 和 U5
An
pol
env
U3 R
负链 DNA3′端与模板 R 区配对（第一次跳跃）
精选ppt课件2021
11
7.2.1 RNA复制酶类
由病毒自己编码的RNA复制酶主要是依赖RNA的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）。
RNA复制酶功能与特性： ⑴ 以“–RNA”为模板合成“+RNA”活性高，而以“+RNA” 为模板合成“–RNA”活性低； ⑵ 合成RNA链方向为5′→3′； ⑶ 能将互补的双链RNA分开； ⑷ 缺少核酸酶活性，校正功能低，差错率高； ⑸ 多数分布在细胞质中，少数在细胞核中； ⑹ 酶活性具有可调控性，复制时，RdRP抑制外壳蛋白表达， 而成熟期，外壳蛋白抑制RdRP活性。
这类病毒包括滤泡性口腔炎病毒、流感病毒、
副流感病毒、莴苣坏死黄化病毒、麻疹病毒、狂犬病毒
等。
脱壳
病毒
RdRP
加工
亲代 –RNA
+RNA ① RdRP
子代
mRNA ② 翻译
–RNA
GpppN GpppN
帽子 mRNA
③ 翻译
子代病毒颗粒 组装
RNA 复制酶 病毒外壳蛋白 致病蛋白
《RNA的提取》课件
解决方案
可以采用离心、过滤、沉淀等方法去 除杂质，或者使用特定的吸附剂将杂 质吸附后一起去除。
提取效率低下的问题及解决方案
问题
在提取过程中，有时会出现提取效率低下的 问题，即提取出的RNA量较少或质量较差 。
解决方案
可以尝试优化提取条件，如改变缓冲液成分 、调整pH值、增加样本量等；同时，也可 以采用一些先进的提取方法和技术，如磁珠 法、亲和层析法等，以提高提取效率。
《RNA的提取》 PPT课件
目录
• RNA提取概述 • 实验材料准备 • RNA提取的方法 • RNA的质量检测 • RNA提取的常见问题及解决方案 • 实验结果分析
01 RNA提取概述
RNA的简介
总结词
RNA的基本信息
详细描述
RNA，全称为核糖核酸，是一种重要的生物分子，参与遗传信息的转录和翻译过程。它由核糖核苷酸通过磷酸二 酯键连接而成，分为mRNA、tRNA和rRNA三种类型，分别在蛋白质合成中起信使、转运和结构作用。
在提取过程中，应尽量保持低温，避免长时间暴露在高温 环境中；同时，控制好pH值，避免过酸或过碱环境对RNA 的破坏；此外，使用RNA酶抑制剂可以有效防止RNA被酶 降解。
提取过程中杂质的去除问题及解决方案
问题
在提取过程中，常常会伴随一些杂质 如蛋白质、多糖、色素等，这些杂质 会影响后续的实验结果。
谢谢聆听
酚-氯仿提取法
原理
利用酚和氯仿的混合液抽提细胞破碎后的上清液，使 RNA进入水相，而DNA和蛋白质则进入有机相。
01
步骤
样品匀浆→加酚-氯仿→离心取水相→ 加乙醇沉淀RNA→洗涤→溶解。
02
03
特点
酚-氯仿提取法是一种比较经典的方法 ，操作简便，但可能会损失部分RNA 。
可以采用离心、过滤、沉淀等方法去 除杂质，或者使用特定的吸附剂将杂 质吸附后一起去除。
提取效率低下的问题及解决方案
问题
在提取过程中，有时会出现提取效率低下的 问题，即提取出的RNA量较少或质量较差 。
解决方案
可以尝试优化提取条件，如改变缓冲液成分 、调整pH值、增加样本量等；同时，也可 以采用一些先进的提取方法和技术，如磁珠 法、亲和层析法等，以提高提取效率。
《RNA的提取》 PPT课件
目录
• RNA提取概述 • 实验材料准备 • RNA提取的方法 • RNA的质量检测 • RNA提取的常见问题及解决方案 • 实验结果分析
01 RNA提取概述
RNA的简介
总结词
RNA的基本信息
详细描述
RNA，全称为核糖核酸，是一种重要的生物分子，参与遗传信息的转录和翻译过程。它由核糖核苷酸通过磷酸二 酯键连接而成，分为mRNA、tRNA和rRNA三种类型，分别在蛋白质合成中起信使、转运和结构作用。
在提取过程中，应尽量保持低温，避免长时间暴露在高温 环境中；同时，控制好pH值，避免过酸或过碱环境对RNA 的破坏；此外，使用RNA酶抑制剂可以有效防止RNA被酶 降解。
提取过程中杂质的去除问题及解决方案
问题
在提取过程中，常常会伴随一些杂质 如蛋白质、多糖、色素等，这些杂质 会影响后续的实验结果。
谢谢聆听
酚-氯仿提取法
原理
利用酚和氯仿的混合液抽提细胞破碎后的上清液，使 RNA进入水相，而DNA和蛋白质则进入有机相。
01
步骤
样品匀浆→加酚-氯仿→离心取水相→ 加乙醇沉淀RNA→洗涤→溶解。
02
03
特点
酚-氯仿提取法是一种比较经典的方法 ，操作简便，但可能会损失部分RNA 。
实验一、RNA提取方法及原理30页PPT
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
实验一、RNA提取方法及原理
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
1ห้องสมุดไป่ตู้、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
RNA提取-逆转录
RNA提取和RT-PCR1.准备工作：检查提RNA专用的枪头，EP管，以及PBS，Trizol，氯仿，酚氯仿，异丙醇，75%乙醇，DEPC水（0.1%）。
2.从4℃取出Trizol恢复室温，预冷离心机到4℃。
3.用室温的PBS把细胞洗一次，加入1ml Trizol裂解细胞，静置5分钟，反复吹打10次，收集到EP管内，-80℃可储存一个月（解冻时需要离心）。
4.向Trizol裂解液内加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。
5.4℃，12000g离心15分钟，此时可见细胞裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA,脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。
6.转移上层的水相到新的EP管内，150ul吸三次，共450ul。
7.补充200ul的DEPC水，总体积即为650ul，加入等体积的酚氯仿，混匀，静置3分钟后，4℃离心，12000rcf,15分钟。
8.取上清500ul到新的EP管内，167ul吸三次。
加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。
9.小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1ml 75%乙醇, 上下颠倒，使沉淀块重悬起，加75%乙醇后4℃可储存一周， -20℃可储存一年。
10.4℃，12000g离心10分钟,小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。
晾干约15分钟，至管壁无液体。
11.加入适量体积（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。
12.取出3 ul定量，测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆=40µg/ml,A260/A2801.8~2.1）转录。
（1A26013.逆转录：a.根据定量结果取2μg RNA补充DEPC水至14μl；b.加入1μg oligod(T),70℃5min,取出后立刻冰上孵育5min；c.进行逆转录反应：在上一步反应管中直接加共40μl，42℃反应1h。
细胞总RNA提取及逆转录ppt课件
逆转录酶：
• RT
存在于逆转录病毒 体内。 常见有哺乳动 物型37oC，禽类型 42oC 。
以mRNA为模板的 DNA聚合酶，构成与 RNA碱基相互补DNA
mRNA
AAAAAA(n)
10min 68-70oC, annealing mRNA
mRNA cDNA
1-2h
AAAAAA(n) 3 -TTTTTT(18)-5 37-42oC, RTase
❖留意： RNA沉淀的溶解一定要耐心 充分，一定要用加样器反复多次吹打方 可。但由于溶液体积非常小，要防止出 现气泡影响RNA的溶解。
防止气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体
判别溶解程度：
吹打时液体流动不拐弯 为止。
14) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用 (将用于电泳)。
•第二步：逆转录反响
最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白量
变性。
有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。
用于浸泡各种器材。
灭活条件：高压。
在Tris溶液中半衰期为1.25min。
试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压)
储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。
留意: 电泳槽的清洁！ 一切试剂、器材、溶液需求灭RNA酶处置。 琼脂糖凝胶要新颖配制！ 紫外透射仪察看电泳结果
第二步：向上述反响溶液中依次参与以下试剂：
5RT-buffer
RNasin (40U/ml) dNTPs (10mmol/L) AMV
4 l 1 l 4 l 1 l
轻弹管底混合，置42℃水浴1h。
2、肝素： 运用浓度：0.1—10mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。
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RNase抑制剂介绍
1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐) 最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质 变性。 有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。 用于浸泡各种器材。 灭活条件：高压。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。
试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压)
储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。
2、肝素： 使用浓度：0.1—10mg/ml
效
果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。
如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制 效果。
三、RNA提取的实验操作
5)加入200 l氯仿， 震荡混匀20-30s， 室温放置5min（此期间液体开始分层， 此时不要轻易搅动液体）。 ６)10000 rpm，离心5min。
Protein
RNA (清澈透明) DNA
7) 将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。
8) 沉淀RNA： 加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。 10000rpm，离心10min。弃上清。 ９) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀 ) 10) 7500rpm离心1min，弃上清。 再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。
3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 小亚基40S: 18S=1874nt
二、RNA提取的注意事项
RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。
3、以总RNA为模板的逆转录反应
•第一步： 提取小鼠肝脏组织的RNA
一、真核细胞的总RNA
1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 5S=120nt 5.8S=160nt
1、打开电源
2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。 3、将样品标记好并配平, 对称放入离心机（管 的连接处朝外）。 4、设定离心的转速和时 间。 5、统一离心。
Team Work
1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。
实验一、 细胞总RNA的提取及
逆转录
实验内容： 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳
课间介绍 RNA提取的几种方法
1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同 时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，通过有机 溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT 纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。
【每名同学的3个实验报告放在一起，最后一次实验课交。 学生交卷后签名。教师按学号排卷。】
先介绍本轮实验中两种 常用仪器的使用方法
1. 加样器 2. 离心机
一、加样器的使用及注意事项
1、 用途 —— 微量吸取液体 2、 每组3支加样器
顶部标记加样器的最大量程，分别为： 20 l: 100 l: 1000 l: 0.5 ~ 20 l 20 ~ 100 l 200 ~ 1000 l
分子生物学实验
～欢迎大家参加分生实验课的学习！
1、 每组同学做一份实验；
2、 遵守实验室规则，穿白衣；
3、 同学们在听课时要作好记录;
4、 上课时间。
2013年 五年制 实验课考试形式
1. 实验成绩考核占总成绩15%。 2. 每次实验报告5分含随堂测试，共三次，合15分。 3. 缺实验课成绩者，本课程不予通过。
练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?
5、加样器使用步骤：
1）选择加样器,观察读数,调节读数。 安装吸头要紧密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。 2）在液面外，先按到第一挡。 3）将吸头插入液面下的适当深度:
过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。
第一挡为实际读数体积，
第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。 4）缓慢松开拇指 ,吸取液体。
3、 根据取样量，选择合适量程的加样器。 Q：如果要吸取5μl、50μl、150μl、 500μl的
液体，应选择哪个加样器?
4、如何调节？
(1)首先观察目前的读数,假设为050: 最大量程为20l的加样器 — 5l 最大量程为100l的加样器 — 50l 最大量程为1000l的加样器 — 500l (2) 顺时针调节--- 读数变小 逆时针调节--- 读数变大 (3) 注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最 小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量 程，将会损害加样器的精度。
RNA分离的关键因素：避免RNA酶1) 发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。 将1mL Trizol试剂移入Eppendorf管中。 2) 实验教师操作 : 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块 不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。
3) 将研磨后的组织 ( 小米粒大小 ) 转移至 1mL 的 Trizol 试 剂 中 ， 盖 紧 盖 ， 上 下 颠 倒 混 合 2min 以 上 。 使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成 均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。
完全放开拇指后，停留半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。 5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去 6）贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液 体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！) 7) 观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。
二、离心机的使用及注意事项