抗CD44mAbA3D8对卵巢癌球形体形成细胞增殖和凋亡的影响

卵巢癌是女性生殖系统最严重的恶性肿瘤，全球每年超过11万4千人因此病死亡[1]。

由于缺乏早期症状和特异性肿瘤标志物，因此难以早期发现。

尽管在卵巢癌的早期检测和治疗方面有诸多进展，但患者死亡率依然很高。

据报道，患者5年生存率仅30%[2]。

癌干细胞（cancer stem cells ，CSC ）能自我更新，多样分化，扩增，促进肿瘤生长。

关于CSC 或卵巢癌干祖样细胞分离和鉴定的研究目前已有报道[3]。

在进一步的研究中人们发现，与普通卵巢癌细胞相比，CSC 高表达CD44[4]，且CD44和卵巢癌的发生发展存在密切关系[5]。

如CD44被抗CD44单克隆抗体（monoclo⁃nal antibody ，mAb ）A3D8封闭，癌细胞的生长可在一抗CD44mAb A3D8对卵巢癌球形体形成细胞增殖和凋亡的影响*许静静杜涌瑞张秋月顾欣谷超李凤舞邓为民△摘要目的：探讨抗CD44单克隆抗体(mAb)A3D8对3种卵巢癌球形体形成细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其作用机制。

方法：用MTS 法检测A3D8对细胞增殖的影响；采用PI 染色及流式细胞仪检测A3D8对细胞周期的影响；用Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒检测A3D8在细胞凋亡中的作用；用罗丹明123试剂盒检测A3D8对细胞线粒体膜电位的影响；并采用Western Blotting 法检测A3D8作用于3种卵巢癌球形体形成细胞后，CDK2、cyclinA 、Bcl-2和cas⁃pase-3的改变。

结果：A3D8可抑制3种卵巢癌球形体形成细胞的增殖，且此抑制作用呈现剂量和时间依赖性；A3D8可在阻滞S 期的同时降低G0/G1期比例；A3D8可促进3种细胞凋亡，与顺铂（DDP ）联用，细胞凋亡率较单独使用DDP 增高；A3D8的处理可导致3种细胞的线粒体膜电位损失，CDK2、cyclinA 、Bcl-2蛋白表达下调，caspase-3表达上调。

结论：A3D8可能是通过影响p21/CDK2/cyclinA 途径阻滞细胞周期达到抑制3种卵巢癌球形体形成细胞增殖的结果，并且可通过线粒体途径促进细胞凋亡。

关键词抗原，CD44抗体，单克隆卵巢肿瘤细胞增殖细胞凋亡卵巢癌球形体形成细胞Influence of Anti-CD44mAb A3D8on Proliferation and Apoptosis in threeSphere-Forming Cells of Ovarian CancerXU Jingjing,DU Yongrui,ZHANG Qiuyue,GU Xin,GU Chao,LI Fengwu,DENG WeiminTianjin Medical University,Tianjin 300070,ChinaAbstractObjective:To explore the effects and mechanisms of A3D8(mAb)against CD44on proliferation and apopto⁃sis in three kinds of sphere-forming cells of ovarian cancer.Methods:The MTS assay was used to evaluate the effect of A3D8on the cell proliferation.The PI staining and flow cytometry was used to analyze the effect of A3D8on the cell cycle dis⁃tribution.Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit was used to analyze the effect of A3D8on the cell apoptosis.Rhoda⁃mine123apoptosis detection kit was used to detect the effect of A3D8on the change of mitochondrial transmembrane poten⁃tial (ΔψM).Western blotting assay was used to detect the effect of A3D8on the CDK2,cyclinA,Bcl-2and caspase-3protein levels in three kinds of sphere-forming cells of ovarian cancer.Results:A3D8inhibited the proliferation in three sphere-forming cells of ovarian cancer,which showed a concentration-and time-dependant manner.A3D8caused S arrest with G0/G1decrease via p21/CDK2/cyclinA pathways.A3D8promoted apoptosis rates of three kinds of cells.The apoptosis rates were higher in cells treated by A3D8combined with DDP than those of DDP treatment alone.A3D8caused ΔψM to de⁃crease,and decreased CDK2,cyclinA and Bcl-2protein levels,but increased caspase-3expression in three kinds of sphere-forming cells.Conclusion:A3D8inhibited the proliferation in three sphere-forming cells of ovarian cancer probablyby the cell cycle arrest via p21/CDK2/cyclin A pathways A3D8increased apoptosis rates via mitochondrial pathways.Key wordsantigens,CD44antibodies,monoclonal ovarian neoplasms cell proliferation apoptosis sphere-form⁃ing cells of ovarian cancer*国家自然科学基金资助项目(项目编号：30670801)；天津市科学技术委员会基金资助项目（项目编号：06YFJMJC08300）作者单位：300070天津医科大学基础医学院免疫学教研室△通讯作者E-mail:dengwm67@网络出版时间：2012-02-2116:58网络出版地址：/kcms/detail/12.1116.R.20120221.1658.001.html doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2012.07.001论著定程度上受到抑制。

本研究探讨A3D8在3种卵巢癌球形体形成细胞增殖和凋亡过程中的生物学行为和作用机制，以期为临床应用提供理论依据。

1材料与方法1.1材料腹水源卵巢癌球形体形成细胞（A-SFC），实体瘤源球形体形成细胞(T-SFC)；卵巢癌SKOV-3细胞系源的球形体形成细胞（S-SFC）来自天津医科大学免疫学教研室[3]；A3D8、3-（4，5-甲基噻唑）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2氢四唑盐（MTS）、碘化丙啶（PI）、RNA酶、Triton100、鼠IgG1购自Sigma公司；顺铂（DDP）购自山东齐鲁制药厂；DMEM/F12购自天润善达公司；罗丹明123（rhodamine-123）凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自凯基生物科技；兔抗人CDK2抗体、兔抗人cyclinA抗体购自Bio⁃world Technology；兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人caspase-3抗体购自Cell Signaling。

1.2方法1.2.1细胞培养A-SFC、T-SFC、S-SFC细胞用添加5mg/L 胰岛素、20μg/L表皮生长因子（EGF）、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、2%B27及1μg/L氢化可的松的DMEM/ F12无血清特殊生长培养基（special growth medium，SGM），37℃、5%CO2温箱培养。

1.2.2细胞增殖实验用无血清特殊培基SGM调整A-SFC、T-SFC、S-SFC细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔板中，100μL/孔。

每组设3个复孔，培养24h后，加入不同处理因素：（1）无血清特殊生长培养基SGM（阴性对照）。

（2）2mg/L鼠IgG1（同型对照）。

（3）不同浓度A3D8（0.2、2、6mg/L）。

（4）2.5 mg/L DDP。

分别孵育24、48和72h后，每孔加入20μL MTS，混匀后37℃孵育4h，490nm测定光密度(OD)值检测细胞增殖状态。

根据增殖抑制结果，选择24h、2mg/L为A3D8后续实验的最佳时间和质量浓度。

1.2.3PI染色及流式细胞术检测细胞周期A-SFC、T-SFC、S-SFC细胞培养24h后，加入不同处理因素：（1）无血清特殊生长培养基SGM（阴性对照）。

（2）2mg/L A3D8。

24h后，0.05%胰酶适度消化细胞，800r/min离心5min，冷PBS洗2次。

加入等体积70%的冷乙醇，4℃孵育过夜。

再次800 r/min离心5min，冷PBS洗2次，使细胞终浓度为1×106/mL，各自用5mg/L RNase（RNA酶）和1%TritonX-100处理，并用PI染色。

400目筛网过滤细胞悬液，流式细胞仪检测。

1.2.4流式细胞仪检测Annexin V-FITC和PI染色的细胞凋亡A-SFC、T-SFC、S-SFC细胞接种于24孔板上，500μL/孔。

培养24h后，加入不同处理因素：（1）无血清特殊生长培养基SGM（阴性对照）。

（2）2mg/L A3D8。

（3）2.5mg/L DDP。

（4）2 mg/L A3D8+2.5mg/L DDP。

24h后，用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒处理。

准备100mg/L的PI工作液，它是通过把5μL1g/L的PI原液混入45μL1×Annexin-连接缓冲液中混匀而得到。