甲基化检测原理及步骤 DNA实验技术方法汇总
dna甲基化测序原理
dna甲基化测序原理DNA甲基化测序原理DNA甲基化测序是一种用于检测DNA分子上甲基化修饰形式的方法。
甲基化是一种常见的DNA化学修饰形式,它可以影响基因的表达和细胞分化过程。
通过测序和分析DNA中的甲基化位点,科学家能够深入研究这种修饰对基因组功能的影响。
甲基化测序的原理基于DNA甲基化位点与未甲基化位点之间的区别。
在DNA分子中,甲基化通常发生在CpG位点(即DNA的Cytosine和Guanine碱基之间的连接点)。
未甲基化的CpG位点在测序中会被处理成TpG位点,而甲基化的CpG位点则保持不变。
甲基化测序通常通过两种方法进行:1. 亚硫酸转换法(Bisulfite Conversion):该方法通过使用亚硫酸盐将未甲基化的CpG位点转换为尿嘧啶(T),而甲基化的CpG位点则保持不变。
经过亚硫酸转换后的DNA样本可以通过测序技术直接检测出甲基化位点和未甲基化位点的差异。
2. 甲基化特异性切割(Methylation-specific cleavage):该方法使用甲基化特异性的限制性内切酶来识别甲基化的CpG位点,并在CpG位点附近切割DNA。
未甲基化的CpG位点由于没有甲基化修饰而不被切割。
通过测序这些切割的DNA片段,可以确定DNA分子上的甲基化位点的位置。
甲基化测序技术的发展为研究DNA甲基化在基因组中的分布和功能提供了重要的工具。
科学家可以利用这些技术研究不同细胞类型、病理状态以及环境因素对甲基化模式的影响,以及通过甲基化修饰调控基因表达的机制。
这些研究对于揭示基因组调控和疾病发生机制具有重要意义。
甲基化原理及方法
甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰测序法)基本原理在于:样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶(C)保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶(胸腺嘧啶),此时检测到的胞嘧啶(C)即是样品中本身的甲基化位点.第一部分基因组DNA的提取。
DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节:1:蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;2:RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二:1:紫外分光光度计计算OD比值;2:1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出,所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。
1:将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;2:加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;3:42℃水浴30min;水浴期间配制:4:10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)5:3.6M亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
甲基化测序原理
甲基化测序原理甲基化测序是一种广泛应用于DNA研究中的技术,用于检测DNA分子上的甲基化修饰。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式,可以对基因表达和染色质结构产生重要影响。
通过了解DNA序列的甲基化状态,人们能够更深入地研究生物学过程以及疾病的发生机制。
甲基化测序的原理是基于DNA序列中C(胞嘧啶)碱基的甲基化状态。
在正常情况下,DNA中的C碱基会被一个甲基分子修饰,形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。
然而,在一些情况下,这种甲基化修饰可能会发生异常,导致基因沉默或功能改变。
因此,分析DNA分子中的甲基化状态对于理解基因组功能和疾病机制非常重要。
甲基化测序的方法主要分为两种:全基因组甲基化测序和特定位点甲基化测序。
全基因组甲基化测序是指对整个基因组进行甲基化的分析,可以提供全面的甲基化图谱。
特定位点甲基化测序则是选取特定的DNA区域进行检测,可以更加深入地研究某些关键基因或区域的甲基化状态。
甲基化测序的过程首先需要将DNA样本进行处理,包括DNA提取和断裂。
接着,通过特定的化学反应将5-mC转化为甲基化敏感的测序标记物。
然后,使用高通量测序技术对DNA样本进行测序,得到包含甲基化信息的DNA序列。
最后,通过对测序结果进行分析和比对,可以确定DNA序列中每个碱基的甲基化状态。
甲基化测序技术的发展为研究者提供了一个非常有力的工具,可以帮助他们深入了解DNA的甲基化修饰和相关生物学过程。
这种技术在癌症研究、遗传学研究以及表观遗传学研究中具有重要的应用价值。
随着技术的不断进步,甲基化测序将进一步发展,为科学家解开生命奥秘提供更多帮助。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术,少说也有十几种。
大致可以分为两类:特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析,后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。
下面大家介绍一些常用的方法。
特异位点的甲基化检测甲基化特异性PCR(MS-PCR)这种方法经济实用,无需特殊仪器,因此是目前应用最为广泛的方法。
在亚硫酸氢盐处理后,即可开展MS-PCR。
在传统的MSP方法中,通常设计两对引物,一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板,而另一对扩增未甲基化片段。
若第一对引物能扩增出片段,则说明该检测位点存在甲基化,若第二对引物能扩增出片段,则说明该检测位点不存在甲基化。
这种方法灵敏度高,可用于石蜡包埋样本,且不受内切酶的限制。
不过也存在一定的缺陷,你要预先知道待测片段的DNA序列,并设计出好的引物,这至关重要。
另外,若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况,那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理+测序这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。
它的过程如下:经过亚硫酸氢盐处理后,用PCR扩增目的片段,并对PCR产物进行测序,将序列与未经处理的序列进行比较,判断CpG位点是否发生甲基化。
这种方法可靠,且精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)DNA样本经亚硫酸氢盐处理后,利用PCR扩增。
扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。
若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG),则PCR扩增后保留为CGCG,BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中,C未发生甲基化,则PCR后转变为TGTG,BstUI识别位点丢失,不能进行切割。
这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单,可快速定量几个已知CpG位点的甲基化,且需要的样本量少。
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式,通过甲基化在DNA分子上的加合,可以调节基因表达和遗传信息传递。
因此,DNA甲基化检测在遗传学研究、疾病诊断和治疗中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法,并对其原理、优缺点进行详细讨论。
1.甲基化特异性PCR法(MSP)甲基化特异性PCR法是一种利用特异性甲基化酶、限制性内切酶或碱性处理剂以及增强法进行检测的方法。
该方法的原理是通过甲基化特异性的酶对DNA进行酶切,使得未甲基化的DNA片段与经PCR增强的片段长度不同,从而通过凝胶电泳进行检测和分析。
优点是简单、快速且成本低廉,但缺点是需要设计和合成特异性甲基化酶。
2.基于测序的甲基化特异性分析基于测序的甲基化特异性分析方法主要有甲基化抑制PCR法(MIP)和甲基化敏感限制性内切酶测序法(MSRE-Seq)等。
甲基化抑制PCR法是通过特殊的多聚合酶在特定温度下对未甲基化的DNA完成增长,而甲基化DNA则无法进行扩增,从而区分甲基化和未甲基化的位点。
甲基化敏感限制性内切酶测序法则是首先使用甲基敏感限制性内切酶对DNA进行切割,然后进行测序分析。
这两种方法具有较高的精确性和灵敏性,但测序成本较高。
3. 甲基化特异性酶切测序法(MRE-Seq)甲基化特异性酶切测序法是一种通过甲基化特异性酶切和测序进行检测的方法。
该方法首先使用甲基敏感限制性内切酶将DNA切割成小片段,并在切割位点的两端加入特异性的测序引物,然后进行PCR增强和高通量测序。
通过测序得到的序列和甲基化位点的分布情况可以对DNA甲基化进行精确的定量和定位分析。
甲基化特异性酶切测序法具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点,但仍存在PCR偏差等问题。
4.甲基化微阵列甲基化微阵列是一种通过DNA的甲基化特异性杂交来检测和定量DNA 甲基化水平的方法。
该方法利用DNA片段与微阵列芯片上的探针发生特异性杂交,然后通过荧光信号检测和分析。
DNA甲基化检测技术
MS-HRM检测方法及步骤
1. 引物设计:
MS-HRM检测方法及步骤
2. DNA样本的准备:
可使用新鲜组织或石蜡组织样本,一般不使用血液样本;
3. 仪器选择(一般可进行HRM分析的仪器均可):
如LightCycler480 (Roche), RotorGene6000 (Corbett Research), Applied Biosystems 7500 FAST real-time PCR system(Applied Biosystems), LightScanner System and the HR-1 instrument(Idaho Technologies).
DNA甲基化的生物学意义
1、转录抑制
基因启动 子区的甲基化可 影响转录激活因 子和其识别序列 的结合.
DNA甲基化的生物学意义
2、影响基因表达
直接抑制基因表达 或甲基化的 CpG双核苷 酸序列可被甲基结合蛋 白家族 识别,而后者可通 过吸引补充组蛋白去乙 酞化酶 和组蛋白甲基化 转移酶 等组蛋 白修饰蛋 白质来改变染色质的活 性 ,以间接方式影响基因 表达.
MS-HRM检测结果分析
Figure 4. The MS-HRM assay for BNIP3 methylation. Results of the BNIP3-MS-HRM assay for five clinical samples compared to the dilution standards. Samples 1–5 show different methylation levels. The samples have been distributed over three panels to help distinguish the individual samples.
DNA甲基化实验操作原理及方法
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法(DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION)实验操作原理及方法一、实验目的:通过本实验,可以检测特定DNA序列的甲基化状态。
二、实验原理:DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基基团,在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的作用下,将CpG 二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化为5-甲基化胞嘧啶(5-m C)的一种化学反应。
DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。
DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。
DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种:(1)DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。
(2)序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合,募集一些蛋白,形成转录抑制复合物,阻止转录因子与启动子区靶序列的结合,从而影响基因的转录。
(3)DNA 甲基化通过改变染色质结构,抑制基因表达。
重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理,可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。
此反应的步骤是:1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基;2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐;3、在碱性条件下去硫酸化。
在这个过程中,5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。
在重亚硫酸氢盐处理后,使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。
在这个PCR产物中,每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶,而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。
BSP(bisulfate sequencing PCR) :重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,进行PCR扩增。
最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。
DNA甲基化实验
3. DNA 甲基化的检测
A.基因组甲基化水平 (Methylation Content)的分析: 高效液相色谱 (High-performance Liquid Chromatography, HPLC) 高效毛细管电泳法 (High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE)
2. DNA 甲基化的生物学意义
1. DNA甲基化与遗传物质的稳定性 2. DNA甲基化与基因表达调控 3. DNA甲基化与表观遗传学 4. DNA甲基化与胚胎发育 5. DNA甲基化与肿瘤
2. DNA 甲基化的生物学意义
DNA甲基化与遗传物质的稳定性
a) 研究证明细菌DNA复制起始与DNA甲基化以及DNA与细菌质膜的相互作用有关。 DNA便甲基化作为一种标签决定了复制起始点与细胞膜的结合,控制了复制起始, 使得DNA复制与细胞分裂保持一致。
适用于基因组整体的甲基化水平研究,无法定位甲基化位点。
B.甲 基 化 敏 感 性 限 制 性 内 切 酶 - P C R /Southern法 ( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern),常使用的甲基化敏感的限制性内切 酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。
哺乳动物基因组中约有 5%- 10% 是 CpG位点,其中约有 70%为 mCpG。
CpG 位点不是均匀分布,而是呈 现局部聚集倾向,形成一些 GC 含 量较高、CpG 双核苷酸相对聚集的 区域,即 CpG 岛, CpG 岛通常呈 现低甲基化状态。
2. DNA 甲基化的生物学意义
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略DNA甲基化是指DNA分子中的碱基Cytosine(胞嘧啶)在其C5位点上与甲基基团结合形成5-甲基胞嘧啶的化学反应。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式,被认为在基因组的稳定性和调控中起着关键的作用。
DNA甲基化异常与多种疾病的发生和发展密切相关,包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。
因此,开发DNA甲基化检测技术,对于深入研究疾病的发生机制、早期诊断、疾病分型和治疗方案的制定具有重要意义。
一、DNA甲基化检测方法1.甲基特异性PCR(MSP)甲基特异性PCR是一种将DNA甲基化水平转化为PCR信号的方法。
该方法针对DNA甲基化位点进行甲基化特异性的酶切反应,然后利用PCR扩增技术对甲基化和非甲基化的DNA片段进行分离和测定。
2.甲基化特异性限制酶切(MSRE)甲基化特异性限制酶切方法依赖于特定甲基化位点上的酶切敏感性。
该方法先通过限制酶切鉴定DNA甲基化位点的状态,然后通过聚合酶链反应(PCR)或更高通量的测序技术进行测定。
3.甲基化特异性测序甲基特异性测序技术是一种通过测序方法直接确定DNA甲基化位点的状态。
这种方法依赖于高通量测序技术,可以同时测定数百万个甲基化位点。
4.甲基化敏感扩增多态性(MS-AFLP)甲基化敏感扩增多态性方法是一种将甲基化位点转化为特定扩增片段的方法。
该方法利用比较性PCR和限制酶切结合的方法,挑选与DNA甲基化状态相关的扩增产物,从而实现对DNA甲基化状态的测定。
二、DNA甲基化检测技术的应用1.疾病早期诊断2.疾病分型不同疾病的DNA甲基化模式存在差异,通过检测DNA甲基化状态可以将疾病进行分型,从而有针对性地制定治疗方案。
3.肿瘤治疗效果评估针对肿瘤治疗过程中的DNA甲基化变化,可以通过检测DNA甲基化状态来评估治疗效果。
如果治疗有效,DNA甲基化状态会发生改变。
4.基因组稳定性分析三、DNA甲基化检测技术的优势和挑战优势:1.高灵敏度和特异性:DNA甲基化检测技术具有高灵敏度和特异性,可以测量DNA甲基化的水平和位点。
dna基因甲基化检测技术
dna基因甲基化检测技术
DNA基因甲基化检测技术是一种用于检测DNA分子中的甲基化修饰的方法。
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式,通过在DNA分子中加入甲基基团来改变基因的表达。
甲基化
修饰在基因组稳定性、细胞分化、发育和疾病发生发展等方面起着重要作用。
常见的DNA基因甲基化检测技术包括以下几种:
1. 甲基化特异性PCR(MSP):该方法通过甲基化特异性酶
切和PCR扩增来分析DNA区域的甲基化状态。
甲基化和非甲基化的DNA片段通过特异性引物进行扩增,并通过凝胶电泳
来分析甲基化水平。
2. 甲基化敏感性限制性内切酶(MSRE)消化-PCR:该方法利用一些能够识别甲基化和非甲基化位点的酶进行DNA消化和PCR扩增。
甲基化位点在酶消化后会有不同的PCR产物,通
过凝胶电泳来判断甲基化状态。
3. 甲基化特异性测序:该方法通过测序检测DNA甲基化状态。
利用甲基化特异性的测序方法,比如甲基化特异性测序(Methyl-Seq)、甲基化敏感性等位突变测序(MAIM-Seq)等,可以直接确定甲基化位点的位置和水平。
4. 甲基化芯片(microarray):该方法使用DNA芯片来检测DNA甲基化状态。
芯片上固定了大量已知甲基化位点的DNA
序列,通过甲基化特异性探针杂交实现甲基化位点的检测和分
析。
以上是常见的DNA基因甲基化检测技术,它们在研究DNA 甲基化在基因调控和疾病中的作用方面发挥着重要的作用。
DNA甲基化谱图分析的步骤与技巧
DNA甲基化谱图分析的步骤与技巧DNA甲基化是指DNA分子上的甲基基团(CH3)与DNA碱基之间的化学修饰。
甲基化是真核生物中一种重要的表观遗传修饰方式,对基因的表达和细胞分化具有关键的调控作用。
通过进行DNA甲基化谱图分析,我们可以深入了解DNA甲基化模式及其在疾病发展中的关联。
本文将介绍DNA甲基化谱图分析的步骤与一些技巧。
DNA甲基化谱图分析步骤如下:1. DNA提取:首先从样本(例如血液、组织)中提取DNA。
目前常用的DNA 提取方法有酚-氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。
提取的DNA应具有足够的纯度和质量。
2. 甲基化酶处理:将提取的DNA与DNA甲基化酶一起反应,使DNA上的未甲基化位点与酶反应形成的底物结合。
DNA甲基化酶有多种选择,如DNMT3A、DNMT1和M.SssI等。
反应的时间和温度需要根据实验需求进行调整。
3. 甲基化位点富集:使用合适的方法富集DNA上的甲基化位点。
常用的方法包括甲基化特异性抗体富集、甲基化诱导剂富集和化学法富集等。
这些方法都可有效提高甲基化位点的富集效率。
4. DNA测序:将富集后的甲基化DNA样本进行测序,生成原始的测序数据。
目前,常用的测序技术有二代测序技术如Illumina HiSeq和三代测序技术如PacBio SMRT。
5. 数据分析:利用生物信息学工具和软件分析原始测序数据,得到甲基化谱图。
数据分析过程包括原始数据的质控、序列比对、甲基化位点识别和甲基化水平计算等。
常用的数据分析工具包括Bismark、MethylKit和MethylC-seq等。
DNA甲基化谱图分析的技巧如下:1. 样品选择与准备:选择与研究目标相关的样本,如疾病患者组织或动物实验模型。
确保样本的质量和纯度对于得到准确的结果至关重要。
2. 实验条件优化:基于实验目的和样本特点,优化DNA甲基化过程中的反应条件,如甲基化酶的浓度、反应时间和温度等。
这一步骤需要进行一系列实验和优化以确保实验结果的可靠性。
甲基化检测原理及步骤DNA实验技术方法汇总
甲基化检测原理及步骤DNA实验技术方法汇总DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计:使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一,一种包含亚硫酸氢根的钠盐,可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨,产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合,并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步:试剂准备(1)3 M NaOH原料(用前现配)把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱,注意小心谨慎和实验操作。
(2)20 mM NaOH/90% EtOH(用前现配)配制1mL该溶液需:900μl 100%的乙醇,93.4μl水,6.6μl 3M 的氢氧化钠。
(3)溶解试剂Ⅰ(用前现配)打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本,称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎,因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0,用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果,试剂应在配置后立即使用。
(4)溶解试剂Ⅱ打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA 修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步:DNA修饰程序1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中:将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中(10ng/μl),混匀。
注意:如果样本含有的DNA量不到1.0μg,就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略DNA甲基化是指DNA分子上的甲基基团与DNA碱基结合,从而调节基因的转录活性。
甲基化的变化在许多疾病和发育过程中起着重要作用。
因此,DNA甲基化检测技术成为了研究和诊断领域中的关键工具之一、本文将介绍DNA甲基化检测技术的全攻略,包括常用的方法和关键步骤。
一、DNA甲基化检测技术的基本原理全基因组的甲基化检测通常使用甲基化敏感的限制酶来区分甲基化和非甲基化的DNA。
通过将DNA与限制酶一起处理,只有非甲基化的DNA会被酶切割。
然后可以使用聚合酶链反应(PCR)或基因芯片等方法来扩增和检测特定的DNA片段。
位点特异性的甲基化检测主要通过甲基化特异性的PCR或测序方法来实现。
首先需要设计特异性的引物,这些引物能够在甲基化和非甲基化的DNA片段上扩增。
接着,通过PCR扩增或测序分析来确定甲基化位点的状态。
二、DNA甲基化检测技术的常用方法1.甲基化敏感的限制酶消化法:通过将DNA与甲基化敏感的限制酶一起处理,只有非甲基化的DNA会被酶切割。
然后可以使用PCR或基因芯片等方法来扩增和检测特定的DNA片段。
2.甲基化特异性的PCR:通过设计甲基化特异性的引物,来扩增甲基化和非甲基化的DNA片段。
这种方法可以用于位点特异性的甲基化检测。
3.甲基化特异性的测序方法:通过测序分析来确定DNA片段上的甲基化状态。
这种方法可以用于全基因组的甲基化检测。
三、DNA甲基化检测技术的关键步骤1.样本的准备:样本可以是基因组DNA或特定的DNA片段。
对于全基因组的甲基化检测,需要提取和纯化高质量的基因组DNA。
对于位点特异性的甲基化检测,可能需要对DNA进行限制酶切割或甲基化特异性的PCR 前处理。
2.甲基化敏感的限制酶消化或甲基化特异性的PCR:根据实验设计,选择合适的方法来检测甲基化状态。
对于甲基化敏感的限制酶消化法,将DNA和甲基化敏感的限制酶一起处理,然后使用PCR或基因芯片等检测方法来扩增和检测特定的DNA片段。
dna质谱检测甲基化的原理
dna质谱检测甲基化的原理DNA质谱检测甲基化是一种常见的基因组DNA甲基化检测方法,它具有高灵敏度、高精度和高分辨率等优点,被广泛应用于基因表达调控、疾病诊断和治疗等领域。
本文将介绍DNA质谱检测甲基化的原理,主要包含基因组DNA甲基化检测原理、甲基化测序原理和质谱检测原理等方面。
一、基因组DNA甲基化检测原理基因组DNA甲基化是指DNA分子中的胞嘧啶(C)被甲基化,形成5-甲基胞嘧啶(5mC)的现象。
基因组DNA甲基化对基因表达调控具有重要作用,它可以通过影响转座子活性和基因转录水平来影响细胞功能和分化。
基因组DNA甲基化检测原理主要包括DNA甲基化水平表示、测定方法和基本原理等。
1.DNA甲基化水平表示DNA甲基化水平通常用5mC的含量表示。
在基因组中,5mC可以以不同的丰度存在,因此可以根据5mC的含量计算出DNA甲基化水平。
一般来说,较低的5mC含量意味着较高的基因表达水平,而较高的5mC含量则意味着较低的基因表达水平。
2.测定方法基因组DNA甲基化水平的测定方法主要包括甲基化敏感扩增多态性(MS-PCR)和亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing)等。
MS-PCR 是一种基于PCR的方法,通过设计特异引物,在扩增过程中对未甲基化的C进行特异性切割,从而实现对5mC的定量检测。
亚硫酸氢盐测序则是一种基于高通量测序的方法,通过将DNA进行亚硫酸氢盐修饰,使未甲基化的C转化为尿嘧啶(U),而5mC则保持不变,从而实现对5mC的定量检测。
3.基本原理基因组DNA甲基化检测的基本原理是利用DNA分子中5mC与A、G、T等其他碱基在化学性质上的差异,实现对5mC的特异性识别和定量检测。
在MS-PCR方法中,未甲基化的C可以被特异性切割,而5mC则不会被切割,因此可以通过比较切割前后的PCR产物量来计算5mC的含量。
在亚硫酸氢盐测序方法中,未甲基化的C被转化为U,而5mC则保持不变,因此可以通过比较修饰前后的测序数据来计算5mC的含量。
dna甲基化测序原理
dna甲基化测序原理DNA甲基化是指在DNA分子中甲基群的加入,可以在DNA模板特定的环境下形成5-甲基脱氧胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)和其它DNA甲基化修饰,这些甲基化修饰在遗传学、肿瘤学和分子生物学等领域有重要的研究意义。
甲基化序列检测技术可以用来鉴定不同基因组区域的甲基化状态,在流域高通量测序技术的帮助下,如今这一技术已经得到了大规模推广。
本文将详细介绍DNA甲基化测序的原理和技术流程。
在DNA甲基化测序中,主要使用外显子组测序(整个基因组的外显子组成)或全基因组测序技术进行分析。
首先将DNA提取出来,并将其切成片段,接着对DNA片段进行限制性消化或随机剪切,然后使用甲基转移酶进行甲基化。
大多数甲基化酶无法依赖于核酸序列,其作用受到区域和基因序列的协同作用。
最后,将甲基化后的DNA片段进行测序,可以获得特定细胞或组织中的甲基化模式。
在整个测序过程中,主要使用特异性测序技术、基于PCR扩增和微作用元件(microfluidics)的针对片段缩小技术。
DNA甲基化测序的技术流程1. 取样提取需要研究的组织样本,包括血液、肿瘤组织、胚胎干细胞等。
2. DNA提取和质量检测从获得的样本中提取DNA,并使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop等仪器检测DNA质量。
3. DNA片段文库制备将DNA样品随机切割成适当长度的片段,并在片段两端添加外部适配体,以检索DNA 片段序列。
4. Bisulfite DNA处理对DNA进行较为精确的甲基化转化,可供特定的测序分析。
5. PCR扩增使用PCR对处理后的DNA进行扩增,以获取足够的DNA量供测序使用。
6. 高通量测序将扩增后的DNA片段送至高通量测序仪进行测序。
7. 数据分析使用生物信息学工具分析得到的DNA测序数据,确定DNA甲基化模式并进行图像化。
总结DNA甲基化测序已经得到了广泛的应用,可以在癌症研究、分子生物学研究和遗传学研究等领域中使用。
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法DNA甲基化检测方法主要包括基于测序的方法和基于非测序的方法。
基于测序的方法包括甲基化指纹测序 (Methylome Sequencing) 和全基因组甲基化分析 (Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)。
基于非测序的方法包括限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 和甲基化特异性PCR (Methylation-Specific PCR, MSP)。
下面分别介绍这些方法的原理和应用。
全基因组甲基化分析是一种基于测序的DNA甲基化检测方法。
它通过对全基因组进行测序,得到每个碱基的甲基化状态。
首先,将DNA进行亚硫酸盐处理,将未甲基化的胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶,再进行测序。
然后,通过比对测序结果和参考基因组,可以得到每个位置的甲基化状态。
限制性片段长度多态性是一种基于非测序的DNA甲基化检测方法。
它通过酶切DNA后,观察酶切位点是否发生改变来判断甲基化的差异。
该方法利用了限制酶对于未甲基化的CpG位点酶切敏感,而对于甲基化的CpG位点酶切不敏感的特性。
首先,将DNA进行酶切,然后使用凝胶电泳等方法,观察DNA片段的长度差异。
甲基化特异性PCR是一种基于非测序的DNA甲基化检测方法。
它通过PCR扩增甲基化和未甲基化的DNA片段来检测甲基化的差异。
首先,将DNA进行亚硫酸盐处理,将未甲基化的胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶。
然后,设计特异性引物,选择甲基化和未甲基化的DNA片段进行PCR扩增。
最后,通过凝胶电泳等方法观察PCR产物,确定甲基化的差异。
DNA甲基化检测方法在许多领域广泛应用。
在癌症研究中,可以通过甲基化指纹测序和全基因组甲基化分析来鉴定癌细胞和正常细胞之间的甲基化差异,进一步了解癌症发生发展的机制。
在遗传学研究中,可以通过DNA甲基化检测来鉴定父母遗传给子代的甲基化模式,进一步研究甲基化在遗传变异中的作用。
DNA甲基化检测技术解读
肿瘤类型
乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝 癌 乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌 肺癌 乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 乳腺癌、前列腺癌 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌 肺癌、脑瘤 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌 肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌 成视网膜细胞瘤、少突神经胶质(细胞)瘤 肾细胞癌
DNA甲基化与肿瘤的关系
MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启 动子肿瘤特异性甲基化,可以抑制MGMT蛋白的活性,从而使得肿瘤细胞对 烷化类的抗肿瘤药物敏感,因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。
Figure: Kaplan–Meier Estimates of Overall Survival, According to
动子含有CpG岛。
— 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点
CpG island的功能:通过甲基化与去甲基化,调控下游基因的表达 —— 基因表达的调控开关
DNA甲基化的生物学意义
1、转录抑制
基因启动子 区的甲基化可影 响转录激活因子 和其识别序列 的结合.
DNA甲基化的生物学意义
2、影响基因表达
在甲基转移酶的催化下,DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添 加甲基基团的化学修饰现象。
DNA甲基化的形式:
DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟
嘌呤(7-mG)
CpG 岛(CpG Island)
在基因组的某些区域中,通常是基因的启动子区域,5’端非翻译 区和第一个外显子区,CpG序列密度非常高,超过均值5倍以上,成为 鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区,称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。 正常结构基因组中70%~ 90% 的独立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 岛 主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域,约有60%以上基因的启
甲基化pcr原理
甲基化pcr原理甲基化PCR是一种通过特殊处理方法检测DNA中是否存在DNA甲基化修饰的方法。
DNA 甲基化是指在DNA链中某些处存在甲基基团,它一般会改变DNA的结构和功能,并且通过遗传方式传递给后代。
DNA甲基化在许多生物过程中都扮演着重要角色,例如细胞分化、基因表达等,同时它还与人类疾病如肿瘤等有关。
甲基化PCR是遵循PCR(聚合酶链式反应)原理进行的,基于该方法,可以在PCR体系中分析DNA样本的甲基化状态。
该方法基本流程如下:第一步:DNA样品输入将待检测的DNA样品输入反应管中,通常DNA需要通过钠离子的作用,而变性为单链状态,使得甲基化酶在不同的节点上完成甲基化操作。
这样的操作能够确保反应体系到位的甲基化修饰,从而使得后续PCR步骤能够够准确地分析。
第二步:甲基化修饰在这一步,样品DNA和甲基转移酶一起反应,甲基化酶通过将甲基基团连接到DNA的胞嘧啶残基上进行修饰。
此时,DNA样品将发生一些化学变化,其中DNA的骨架结构保持不变。
在此过程中,甲基化酶不能在已经有甲基化修饰的位点上起作用,其功能仅限于未被甲基化的胞嘧啶残基上。
第三步:反转在这一步,样品DNA被反转为双链结构,这使得PCR反应得以进行。
这个步骤通过热循环反应,在高温下熔解DNA,而在低温下恢复其结构,使其形成一些连续的双链DNA。
第四步:PCR反应在此步骤中,DNA的一系列选择性PCR反应被实现,从而能够定向扩增特定的DNA片段或者基因。
通过PCR反应,我们可以检测DNA是否被甲基化,并且这种检测方法不需要特殊的测序化学方法。
该步骤基于聚合酶链式反应(PCR)机制,它可以扩增DNA分子的数量,并且能够在扩增过程中进行其他的DNA标记,常常使用荧光标记物。
该步骤将扩增样品DNA,并对样品进行迅速检测,以来判断样品是否有甲基化修饰。
如果DNA样品在这个过程中扩增,我们就可以得到一个清晰的甲基化PCR条带图,从而准确地分析与检测样品中的甲基化DNA片段。
dna甲基化检测原理
dna甲基化检测原理DNA甲基化检测是通过检测DNA分子上甲基化修饰的部位和数量来研究DNA甲基化的状态和变化。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式,通过在DNA分子上特定的碱基上附加一个甲基基团来改变DNA序列的可读性和稳定性。
在DNA甲基化检测中,常用的方法有基于限制酶切特定序列、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、甲基化敏感的聚合酶链反应(MS-PCR)、甲基化敏感的限制酶切分析(MS-RE)、甲基化敏感的序列依赖的鉴别放大(MS-SNuPE)等。
这些方法在特定的条件下可以辨别甲基化和非甲基化的DNA序列,并通过一系列的实验步骤进行检测和分析。
其中,基于限制酶切特定序列的方法是最早的一种DNA甲基化检测方法。
这种方法利用限制酶对甲基化和非甲基化的DNA序列的不同敏感性,通过限制酶切割DNA分子并通过聚合酶链反应、酶切片段分析等方法进行检测。
甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)是一种常用的DNA甲基化检测方法。
在这种方法中,通过设计特异性的引物,选择性地扩增甲基化和非甲基化的DNA序列,然后通过电泳分析扩增产物的大小和形式来确定DNA的甲基化状态。
甲基化敏感的聚合酶链反应(MS-PCR)是另一种常用的DNA甲基化检测方法。
在这种方法中,通过选择性的引物和适当的反应条件,将甲基化和非甲基化的DNA序列放大,并通过电泳分析扩增产物的大小和形式来确定DNA的甲基化状态。
甲基化敏感的限制酶切分析(MS-RE)是基于限制酶识别甲基化和非甲基化的DNA序列的不同敏感性进行检测的方法。
通过选择不同的限制酶和适当的反应条件,可以鉴别出DNA 序列中的甲基化位点。
甲基化敏感的序列依赖的鉴别放大(MS-SNuPE)是一种高分辨率的DNA甲基化检测方法。
该方法利用引物扩增特定的甲基化位点,并通过序列依赖的鉴别放大和后续的电泳分析来确定DNA的甲基化状态。
综上所述,DNA甲基化检测原理主要是通过选择性地扩增甲基化和非甲基化的DNA序列,并通过一系列的实验步骤和技术手段来确定DNA的甲基化状态。
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DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计:使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一,一种包含亚硫酸氢根的钠盐,可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨,产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合,并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步:试剂准备
(1)3 M NaOH原料(用前现配)
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱,注意小心谨慎和实验操作。
(2)20 mM NaOH/90% EtOH(用前现配)
配制1mL该溶液需:900μl 100%的乙醇,93.4μl水,6.6μl 3M的氢氧化钠。
(3)溶解试剂Ⅰ(用前现配)
打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本,称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎,因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0,用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果,试剂应在配置后立即使用。
(4)溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步:DNA修饰程序
1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中:将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中(10ng/μl),混匀。
注意:如果样本含有的DNA量不到1.0μg,就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。
2、50℃ DNA孵育10分钟(加热块或水浴)
3、加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
4、加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。
第三步:初步脱盐
1、强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。
用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。
2、向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ。
3、加入750μl DNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀。
4、室温孵育5-10分钟。
5、5000 X g离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。
(应出现一种白色的小颗粒。
)弃去上清。
6、加入1.0mL 70%的乙醇,涡旋振荡,5000 X g离心10秒,弃去上清。
该步骤重复进行,共3次。
7、将第三次上清弃去后,离心管高速离心2分钟,用塑料移液管枪头移去剩余上清。
第四步:完成DNA修饰(脱磺酸基作用),再次脱盐,并洗脱。
1、适量样本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
2、充分涡旋振荡悬浮颗粒,再室温孵育5分钟。
3、5000 X g离心以移除管顶所有成分。
加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。
再旋转,除去上清。
再次重复该步骤。
4、第二次洗脱除去上清后,高速离心样本3分钟。
5、用塑料移液管头除去所有剩余上清。
试管室温晾干10-20分钟(必须除去酒精气味)。
6、加入TE缓冲液。
注意:加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。
例如,如果加入25μl TE,基于完全恢复1μg DNA的最终浓度应为40ng/μl。
快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。
用手轻打或轻敲内容物至管顶(但是不要离心)。
7、50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA。
8、高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样本(上清)到新管。
9、进行MSP或测序,或-15~-25℃可保存达2个月,-80℃可保存6个月。
避免重复融化和解冻;可分量储存。
不要将DNA存储在自动除霜冰箱。