甲基化--经验

Ensembl data bank

甲基化测序BSP法的那个黑白点状图（黑表示甲基化、白点表示非甲基化）是怎么做出来的呀上

用BiQ ANALYZER软件，免费的可以下载，安装需要最新的java程序

，关于后续的一些步骤，我看了一篇国内的硕士论文，如下：

2.2.1.4.6连接反应产物的转化

(l)每个连接反应准备1个含有氨节青霉素的LB平板，涂板前半小时将平板从冰箱

中取出平衡至室温。

(2)离心使连接反应内容物汇集到管底，吸取10ul连接反应产物加到置于冰上的

1.5ml离心管中.

(3)将冻存的JM109高效率感受态细胞从一70℃冰箱中取出，放置在冰浴直至融化

(大概5分钟)，轻轻振动离心管使之混匀。

(4)向步骤2准备的每个转化管中加入50ul感受态细胞。

(5)轻轻振动小管混匀，冰浴30分钟。

(6)在精确的42℃水浴中热击45一50秒(不要振动)。

(7)迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。

(8)每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的200ulLB培养基，

(9)在37℃振荡培养(150rpm)1小时。

(10)将每个转化培养基200ul涂到LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上。

(11)将平板于37℃恒温箱中过夜培养(16一24小时)。

2.2.L4.7阳性克隆筛选

从培养箱中取出平板，置于4℃冰箱使蓝色充分显现。挑取白斑菌落到5mLB培

基，37℃摇床上培养过夜。吸取lml菌液送测序，引物为通用引物M13。

进入丁香园，是从做MSP开始的。从对DNA甲基化的一无所知到MSP实验成功，经历了很多艰难，同时也收获得了不少经验。从丁香园的帖子可以看出，近几年来，国内对DNA 甲基化的研究在逐年增加，战友们在实验中遇到的困难也不少。在这里谈一下对MSP,及BSP的一点体会，希望能对新手们有所帮助，也请老手们批评补充。

亚硫酸氢盐转化和PCR扩增是MSP,BSP的两个基本步骤。亚硫酸氢盐转化，估计现在做手工修饰的也不多了，试剂盒能够很方便的帮我们解决问题。但PCR中的引物设计，现在可能还是个难题。看到很多帖子里提到的引物都是来源于文献的，但事实上在很多情况下，我们是没法找到现存引物的，因此掌握BSP,MSP引物的设计就显得非常必要了。

BSP，MSP引物设计的一个最大问题在于亚硫酸氢盐的转化使得模板的序列复杂性大大降低，而且经常产生T或G或者富含GC片段交替出现的序列。这个会使引物选择变得困难。因此，往往我们需要设计巢式引物来解决这个问题。BSP,MSP引物的设计，除了要遵循引物设计的基本原则外，还要注意一下一些规则：

（1）引物结合位点应该在原始序列中包含4个以上胞嘧啶来确保转化后的DNA的特异性。（2）BSP引物不应包含CG二核苷酸，长度在25－30bp较为合适；MSP引物因为往往具有较高的GC比，长度应适当缩短。

（3）扩增片段一般认为不要超过650bp，以保证PCR的效率。

（4）对于MSP引物，应该包含3－5个潜在可甲基化位点，且引物的3端应该是一个潜在的可甲基化胞嘧啶，以得到最大化的特异性。

（5）MSP中，U引物与M引物应该具有接近的TM值。

一些网站提供了BSP,MSP引物的免费设计服务，本人也尝试在网上设计过，感觉里面算法过于简单，无法得到满意的引物。在实验中，本人采用了premier5设计的引物。具体做法如下：

（1）获取感兴趣的启动子序列，将序列中非CG二核苷酸的C全部转化为T（word可实现此功能）；

（2）序列载入premier5，按上述原则筛选引物。

（3）MSP引物中的一条往往是由需要确定，因此我们可以直接利用premier5筛选其互补引物。

MSP引物要求的苛刻性常常使得引物的设计变得不可能，在满足规则（4）的情况下，可设计外侧BSP引物，利用BSP产物进行MSP.

BSP,MSP引物设计的另一个困难在于无法进行全基因组的blast，这也让巢式扩增显得更加必要。

做了点甲基化研究，从头下来，也有一点点体会。也看了院子里不少牛人的新的体会。本人将每一个步骤的具体操作、每个操作的具体注意事项和心得进行初步总结，慢慢叙来，抛砖引玉，欢迎拍砖。

做到现在，有成功的喜悦，也有失败痛苦，且行且歌，总得来说，BSP/MSP，想说爱你不容易。

如有时间，想谈谈：BSP/MSP引物设计；基因组海量甲基化数据分析；MSP设计及操作；当前MSP的研究进展，等等吧……

1. 确定目的基因后，登陆一下网址：/

2. 选网页左边的：Genome Browser后，进入基因检索界面

3. 在Assembly下拉菜单选择：Mar.2006

4. 在position or search term 输入基因名称，如APC后，submit

5. 在RefSeq 里面选择你的基因，如这里较多亚型时，最好参照您的NM_000000进行选择；如没有，调最长的isoform，点击之

6. 此时进入附图画面，在左边你可以看到标记蓝底的APC基因，点击之，进入下一界面

7. 在links to the sequence里面，选择Genomic sequence

8. 点击进入后，可在Promoter/Upstream by里面根据需要填个数值，比如500

9. submit 后进入基因系列

10. 大些字母处即为转录起始处，transcription start site，TSS

11. 从头开始，选定基因序列至完全涵盖TSS，可以长点，复制

12. 打开/methprimer/index1.html

13. 在复制框里面黏贴

14. 选择你要的引物类型，如Bisulfite Sequencing，点击submit

15. 可看到参考引物，按你感兴趣的位点选择引物即可。引物的具体信息下面会有详细介绍。待续。

BSP 主要目的是，通过测定亚硫酸盐修饰后的DNA序列，了解特定基因的具体CpG位点的甲基化情况。而MSP只能获得该样本是否发生甲基化的信息，BSP则可以详细了解每一个CpG位点的甲基化情况。

1，首先，按前帖设计引物后，确定BSP反应条件。我们实验室一般都做45个cycle.

提个有意思的题外话，通常BSP的退货温度，会比相应的MSP的退货温度低。

2，BSPCR后，取10ul跑PCR，如条带单一，则直接克隆，具体操作按照Invitrogen的TOPO试剂盒进行；如条带有杂带，需要进行PCR Screen，具体操作及原理以后再讲；

3，克隆后在LB胶上，培养过夜后，后通常取8-12个克隆，LB培养过夜；

4，过夜后LB液浑浊；按照5-Primer的Mini Plasmid DNA提取试剂盒操作说明，提取质粒DNA；

5，半量反应后，送Genomic Core测序；

6，测序结果报告用FinchTV软件阅读(可用GOOGLE搜索后在线注册下载安装)，寻找出目的片段后，建立每一个克隆序列的TEXT文章（后续的BiQ Analyzer用这个文件导入）。

7，将上述文件导入BiQ Analyzer后，按研究需要质控，最后生成BSP直观图，如附图。