罗非鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定
惠州地区罗非鱼细菌性疾病病原鉴定及药敏分析
病害监测DISEASE MONITORING惠州地区罗非鱼细菌性疾病病原鉴定及药敏分析■ 王贺 （惠州市海洋技术中心，广东 惠州 516001）李庆勇（惠州市渔业研究推广中心，广东 惠州 516001）惠州是水产养殖大市，全市水产养殖面积51万亩，其中海水养殖12万亩，淡水养殖39万亩，罗非鱼是目前惠州最主要的淡水鱼类养殖品种。
近年来，惠州罗非鱼细菌性疾病多次爆发，导致大量罗非鱼死亡，严重影响了惠州罗非鱼产业乃至整个水产养殖业，十分有必要对罗非鱼细菌性疾病的病原进行分子生物学鉴定并开展药敏试验，弄清惠州地区罗非鱼细菌性疾病的致病原和敏感药物，为罗非鱼细菌性疾病的治疗提供参考。
与传统的细菌鉴定相比，细菌的分子生物学鉴定具有快速、准确以及成本低等特点，且已经建立了完善的鉴定方法步骤，对市级水产养殖技术人员比较适用。
1 材料与方法1.1试验材料试验菌株为2014-2017年在惠州辖区内患病罗非鱼体内采集保存的菌株，共172株。
脑心浸液培养基、血平板等微生物培养试剂耗材全部购自广东环凯生物科技有限公司；药敏片为英国产OXOID品牌；分子鉴定试剂耗材购自大连宝生生物有限公司（TaKaRa）。
1.2 病原鉴定革兰氏染色初步判断。
按照DNA提取试剂盒说明书的方法提取细菌DNA作为模板，以1492r/F27为引物，进行PCR 扩增（扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min）。
PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定条带后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，测序结果在GenBank 上进行序列比对，进行16S rRNA的分子鉴定。
1.3 药敏分析根据已报道的文献选取常用药物纸片20种（表1）。
挑取单克隆菌落接种至BHI液体培养基中，28℃摇床培养过夜培养，使用BioPhotometer plus 测定菌液OD600数值，空白对照为同批次的灭菌BHI液体培养基。
淡水养殖罗非鱼中病原菌和腐败菌的 分离与鉴定初探
测定天数(n=27) 实测值
2007/5/14～06/08 适宜范围
表 2 罗非鱼养殖池水的理化指标 (X ± SD) Table 2 Physicochemical parameters in pond culture water (X ± SD)
水温(℃) 28～35 32.17±2.06 25～34
参考标准 GB/T 4789.6 － 2003
SN 0184 － 93 GB/T 4789.4 － 2003 GB/T 4789.10 － 2003 GB/T 4789.7 － 2003 GB/T 4789.11 － 2003
SN/T 0475 － 95 GB 7918.4 － 87
－
培养基 乳糖胆盐发酵培养基、E M B 培养基、生化试验配套试剂 F R A S E R 增菌液、O X A 平板、T S A - T E 、T S B - Y E 、生化试验配套试剂 B P 缓冲液、S C 增菌液、S S 琼脂、生化试验配套试剂 7.5%NaCl 肉汤、Baird-parker 琼脂、血平板、生化试验配套试剂 氯化钠结晶紫增菌液、N a C l 蔗糖培养基、嗜盐琼脂培养基、生化试验配套试剂
so on; but the dominant position were changed with different samples. The bacterial flora were simple in putrid meat, Pseudomonas
cepacie, Aeromonas hydrophila and Bacillus brevis were dominant spoilage organism, with a small number of Edwardsiella tarda
罗非鱼嗜水气单胞菌病的诊治
罗非鱼嗜水气单胞菌病的诊治海南潭牛一养殖池塘出现罗非鱼暴发性死亡，发病初期死亡40-60尾/天，高峰期死亡700-800尾/天，通过采样、实验室诊断治疗，取得了较好的效果。
2015年11月中下旬，海南潭牛一养殖池塘出现罗非鱼暴发性死亡，发病初期死亡40-60尾/天，高峰期死亡700-800尾/天，情况严重。
水产养殖动物疾病防控技术国家地方联合工程实验室（简称“国家工程实验室”）通过对该地区的罗非鱼进行现场采样，并进行实验室诊断治疗，取得了较好的效果，本文就此病诊疗情况介绍如下，以期对今后罗非鱼嗜水气单胞菌病的防治提供借鉴。
一、发病鱼的临床症状池塘水温为26-28℃，暴发疾病的鱼规格主要为400-500g，发病初期死亡40-60尾/天，而后逐渐增多，高峰期死亡量达800尾/天以上。
患病鱼主要表现为食欲下降，离群独游，反应迟钝，在水面上层漂浮游动。
病鱼鳃盖出血、肛门红肿、鳍条、上下颌和腹部充出血。
解剖后观察发现，有胃出血、胆囊变大、胆囊壁变薄、肝脏充血或出血或呈现花斑症状，肠道内无食物的症状。
发病初期，养殖户认为可能是链球菌病感染所致，就使用了磺胺类抗生素，但死亡量并未减少。
后送样至本国家工程实验室进行诊断。
二、实验室诊断实验室诊断未发现寄生虫，使用通威股份最新研发的无乳链球菌快速诊断试纸条未检测到无乳链球菌。
而通过对病原菌分离，采用脑心浸液（BHI）培养基在患病鱼体内分离到一株革兰氏阴性短杆菌，菌体两端钝圆，菌株大小为（0.3-0.6）μm×（1.0-1.5）μm，在28℃条件恒温培养18-24h，形成针尖状、直径约为1mm左右、表面光滑、边缘整齐、圆形半透明的菌落。
通过16SrDNA基因扩增，得到约1500bp的扩增条带，测序后在NCBI上进行BLAST比对，分离菌株与嗜水气单胞菌的同源性最高，序列相似性达到99.5%。
将分离到的细菌接种到健康罗非鱼，在36h内实验组出现死亡，且体表有点状出血、鳍条出血、剖解见内脏充血或出血。
罗非鱼（tilapianilotica）简达气单胞菌病的病原分离鉴定及药敏试验
第36卷 第4期 渔 业 科 学 进 展Vol.36, No.4 2015年8月Aug., 2015* 三亚市院地科技合作项目(2011YD115；2012YD73)和三亚市重点实验室建设项目(L1209)共同资助。
杨 宁，E-mail:******************① 通讯作者：黄 海，研究员，E-mail:******************收稿日期: 2014-06-23, 收修改稿日期: 2014-08-261) 邓恒为. 海南罗非鱼链球菌病病原分离鉴定及防治中草药筛选. 海南大学硕士研究生学位论文, 2013, 18−25DOI: 10.11758/yykxjz.20150411 /罗非鱼(Tilapia nilotica )简达气单胞菌病的病原分离鉴定及药敏试验*杨 宁1 姜芳燕2 黄 海1①焦 健3(1. 三亚市南繁科学技术研究院 三亚 572000; 2. 琼州学院 三亚 572022；3. 邯郸市永年县农牧局水产技术服务站 邯郸 057150)摘要 从患病罗非鱼(Tilapia nilotica )体内分离得到细菌NL05，通过回归感染试验确定NL05为致病菌，并测出NL05对罗非鱼的半致死量(LD 50)为1×103 CFU/g 。
结合细菌形态学特征、生理生化指标和16S rRNA 基因同源分析，鉴定NL05为简达气单胞菌(Aeromonas jandaei )。
形态学观察发现，NL05为革兰氏阴性、短杆状；生理生化试验中麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、水杨素、硫化氢等13种指标为阳性，蔗糖、阿拉伯糖、木糖、肌醇、卫矛醇等10种指标为阴性。
药敏试验显示，NL05对奥复星、丙氟哌酸、丁胺卡那霉素、多粘菌素B 、氟哌酸、利福平、洁霉素等13种抗生素敏感，对阿奇霉素、菌必治、卡那霉素、链霉素、美满霉素5种抗生素中介，对氨苄青霉素、阿莫西林、恩诺沙星、复方新诺明、甲氧苄啶等13种抗生素耐药。
一例脆肉罗非鱼病原的鉴定及防治
蚕豆或脆化饲料(主要原料为蚕豆粉)饲喂罗非鱼，经过90天左右的养殖，罗非鱼肉质变紧致且硬，口感爽脆，这种脆化后的罗非鱼称为脆肉罗非鱼。
脆肉罗非鱼是改善罗非鱼肉质的一种特殊方式，有利于罗非鱼的品质提升，显著提高了养殖经济效益。
因此，脆肉罗非鱼在广东主养区养殖面积及产量逐渐扩大。
但随之也带来较多的营养及病害问题，蚕豆作为罗非鱼脆化饲料主要成分，其适口性会显著下降，罗非鱼摄食减少。
研究表明，长期饲喂脆化饲料导致罗非鱼胃肠道各种消化酶活力显著降低，对营养物质的吸收和利用也大大减少，导致脆化期间的罗非鱼营养不均衡，鱼体生长受到抑制，降低了鱼体的免疫力，同时其抗病能力也大大削弱，导致易发生病害。
2023年7月，惠州市渔业研究推广中心养殖的脆肉罗非鱼出现大量死亡，技术人员经过采样、病原分离及鉴定，确定属于两种致病菌混合感染，通过改善养殖环境、增强鱼体免疫力及给药治疗后，死亡情况得以控制。
现将有关情况介绍如下，为脆肉罗非鱼养殖业发展提供参考。
一、基本情况发病罗非鱼为吉富罗非鱼，均重2.1千克/尾。
其养殖方式为车间循环水养殖，单个养殖池约30米3水体，放养罗非鱼300尾，水体24小时不间断供氧，每日投喂1次脆化饲料(饲料为自制)。
发病时已投喂脆化饲料40天左右。
二、患病罗非鱼特征患病罗非鱼体色发黑，离群独游，部分呈现眼球突出症状(图1a)。
解剖可见肌肉中有被膜包裹的淤血块脓肿(图1b 红色圈中部分)，腹腔打开有浑浊腹水，肠道明显胀气，肝胆肿大(图1c、1d)。
三、病原分离与鉴定取患病罗非鱼的眼球组织、肌肉中的淤血块以及肝脏，划线接种至血平板，置于28℃培养箱中培养36小时。
结果显示，眼球和淤血块中均分离到大量的菌落(图2a、2b)，肝脏菌落二次培养后呈现出2c 菌落形态。
通过菌株的测序与分析，结果表明眼球中的分离菌株主要为迟缓爱德华氏菌，肌肉中分离的菌株主要为嗜水气单胞菌，而肝脏中分离的菌株为无乳链球菌。
四、病因分析此次在患病脆肉罗非鱼体内同时分离到3种病基金项目：财政部和农业农村部——国家现代农业产业技术体系(CARS46)；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设项目(2024KJ150)李庆勇，刘艺，叶林（惠州市渔业研究推广中心，广东惠州516055)图1患病罗非鱼图2划线接种培养结果原菌，这是一种较为罕见的现象。
鱼类嗜水气单胞菌的几种检测方法
水 温 较 高 的 季 节 发 病 率 最 高 。 白 １８ ９ ９年 以 来 ，淡 水 鱼 暴 发 性 传 染 病 在 我 国广 为流 行 ， 造 成 严 重 的 经 济
损 失 ， 原大 多 数 为 嗜 水 气 单 胞 菌Ｉ。特 种 名 贵 鱼 类 病 “ 如 香 鱼 、黄 鳝 等 也 可 感 染 本病 Ｉ Ｉ 此 外 ，在 冷 水 鱼 。 一 及 观 赏 热 带 鱼 中亦 有 类 似 报 道 。 目前 ， 已经 确 诊 曾 感 染 本 菌 的 重 要 养 殖 鱼 类 有 鲫 、鲢 、鲤 、草 鱼 、虹 鳟 、尼 罗 罗 非 鱼 、狼 鲈 等 。人 感 染 嗜 水 气 单 胞 菌 而
这 种 方 法 简 单 、实 Ｊ ，但 是 使 用 选 择 培 养基 时 ， Ｈ ｊ 温 度 和 时 间要 求 较 严 格 ，培 养 时 间 较 长 ， 能 Ｊ 于 粗 只 Ｈ ｊ 略 检 测 ，不 甚 精 确 。
２ 葡萄球 菌 Ａ蛋 白协 同凝集 试验 （ ＡＣ ｎ ｌｔ ａｉｎ ＳＰ － ｏ ｑｕｉ ｔ ｎ ｏ
６ １ 后 ，用 该 法 检 测 病 原 ，在 ３ｒｉ 即 ｎ 判 断 结 ～ ８ｈ ｎ内 ａ ｒ
选 择 性 培 养 基 鉴 别 培 养 法 是 利 用 不 同培 养 基 成 分 和 培 养 条 件 ，抑 制 多 数 细 菌 生 Ｋ ， 只 利 于 某 一 种 或 某 一 类 细 菌 生 长的 检 测 方 法 。 选 掸 性 培 养 基 制 作 容 易 ，使 用 方 便 ， 困外 不 少 鱼 病 空 将 其 作 为 日常 主
要 的 诊 断 方 法 。 鱼 类 嗜 水 气 单 胞 菌 的 榆 测 口 使 用 ｒ Ｒｉ ｅ —ｈ ｒ ｍｌｒ Ｓ ｏｔ 养 基 ， ３ ｓ培 在 ７℃ 和 ３ ７℃ 以下 培 养 ， 呈 黄 色 的菌 落 分 别 为 嗜 水 气 单 胞 菌 和 杀鲑 气 单 胞 菌 ｆ ．
二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究
嗜水气单胞菌属 弧菌科 、 气单 胞 菌属 ， 嗜温 、 动 是 有
菌 、 多杀性 巴氏杆菌和 沙门 氏菌 ３ ￣ 禽 ７Ｃ培养 ２ ４ｈ的马 丁 汤培养 物 ， 置于 ４Ｃ冰箱备用 。 ￣
１６ 病原 Ｄ Ａ 的提 取 ． Ｎ
力的气单胞菌群 。该菌是一种典 型的人 一兽 一鱼 共患病
行二温式 Ｐ Ｒ扩增 ， Ｃ 测定其 敏感性 。
１ １ Ｐ Ｒ 产 物 分 析 ．１ Ｃ
均购 自大连 宝生 Ｔ ｋｒ ａａ ａ生物工程有 限公司 。
１ ５ 细 菌 培 养 ．
将８ 株罗非鱼嗜水气单胞菌分 离株在 ２￣生化 培养 ８ Ｃ 箱 中培养 ２ ４ｈ的马丁汤培养 物及 弧菌 、 肠炎杆 菌 、 大肠杆
维普资讯
２０ ０ ７年 第 ２ ７卷 第 ４ 期
水 利 渔 业
（ 第 １２期 ） 总 ５
・ ９・ ９
二 温式 Ｐ Ｒ检 测 罗 非 鱼 嗜 水 气 单 胞 菌 的 研 究 Ｃ
刘加 波 ， 芝勋 ， 小飞 ， 谢 唐 邓显 文 ， 耀珊 ， 志 勤 庞 谢
１３ Ｐ ． ＣＲ仪
伸条件及 循环次数等反应参数进 行优化。
１９ 二温式 Ｐ ． ＣＲ 特 异 性 试 验
对 ８株嗜 水 气单 胞 菌 分 离 株及 其 它 ５个 病原 体 的 Ｄ Ａ进行二 温式 Ｐ Ｒ扩增 ， Ｎ Ｃ 检测其特异性 。
１ １ 二 温 式 Ｐ Ｒ 敏 感 性 试 验 ．０ Ｃ
病原 … ， 广泛存 在 于 淡水 、 土壤 、 污水 、 泥 和 人 类粪 便 淤
中， 能引起人类腹泻及 软组织 损伤感 染 “ ； 是鱼类 疾病
的主要病原 ， 引起 的致死 性 出血性 败血 症 发病 率 和死
罗非鱼药敏总结
罗非鱼药敏总结细菌病暴发是造成罗非鱼经济损失的重要原因之一，而嗜水气单胞菌作为主要的病原菌之一，其发病率及耐药性也逐年增加。
近年来，大量资料证明，嗜水气单胞菌可引发人类的食物中毒、败血症、脑膜炎、蜂窝组织炎及伤口感染，影响食物安全，是重要的“人，兽，鱼”共患病病原菌。
由于发病鱼的表观主要临床症状之一为眼球突出，且有临死前于水面打转或间歇性窜游的表现，因此也怀疑为链球菌病，革兰氏染色镜检也发现一种阳性球菌，经PCR鉴定为海豚链球菌。
在致病性研究中也一起进行了攻毒试验，结果10尾鱼中仅有2尾死亡，说明该球菌的致病力比较弱，这说明嗜水气单胞菌是导致此次尼罗罗非鱼发病的主要致病菌，但临床感染中这种混合感染的情况值得关注和防范。
嗜水气单胞菌广泛存在于水、土壤以及水生动物中，是条件性致病菌。
本次网箱尼罗罗非鱼的发病即是由于转群引起，转入网箱前鱼体表现正常，无死鱼，转入网箱后开始发病，连续一周内，每天均有四五十尾鱼死亡。
细菌分离鉴定后进行药敏试验，结果发现该菌株对菌必治、环丙沙星、氧氟沙星、四环素以及恩诺沙星表现极敏感，对头孢氨苄、新霉素、氟苯尼考、阿莫西林、妥布霉素、卡那霉素和罗红霉素较敏感，对链霉素、青霉素、新生霉素不敏感。
这一结果与以往的报道有较大差异，蔡完其等在发病罗非鱼的温和气单胞菌的病原研究和药敏试验中发现，丁胺卡那霉素对分离到的嗜水气单胞菌具有很好地抑菌效果，而对本研究中分离到的菌株却不敏感；董忠典等的研究发现，分离到的4株菌对丁胺卡那、链霉素极为敏感，对头孢噻吩不敏感，而本次分离到的菌株对头孢噻吩敏感，对丁胺卡那、链霉素不敏感。
这可能与不同地区的用药情况有关，但随着各种药物耐药程度的不断升高，建议临床以加强管理，预防发病为主，用药时尽量采用轮换用药，避免一种药物长期应用，或是采用有好的抑菌效果的中药制剂。
随着人们对鱼类健康养殖的需求日益增加，使用疫苗预防各种水产疾病的发生是目前研究的重点，然而疫苗菌株的选择及合适的剂型是目前研究需要解决的重要问题，鱼类免疫不同于其他动物，通过腹腔注射进行免疫会耗费大量的人力物力，很难应用于实际生产，因此开发浸泡和口服疫苗是适用水产动物的最佳途径。
水产动物致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定
１ ２ ２ 生理生 化 特性 测 定 采 用 微量 发酵 管 法 系 ．．
１ １ １ 细 菌来 源 ． ．
７株 试 验 菌 株 分离 于 不 同 的养
统测 定各 分离 菌 株生 理生 化特 性 ，８℃恒 温 箱 中观 ２ 察 ７ｄ 测 定包 括糖 的发 酵试验 、 基酸 代谢 试验 、 ， 氨 细 菌酶 试 验 、 试 验 及 血琼 脂 平 板 溶 血试 验 等 生场 （ １ ， 表 ） 嗜水 气单胞 菌 标 准株 Ｊ一１ 株
由南 京 农 业 大 学 兽 医 微 生 物 教 研 组 陆 承 平 教 授
惠赠 。
１ １ ２ 实验动 物 和 细菌 微 量 生 化发 酵 ．．
小 鼠体 重
１ ２ ３ 玻片凝 集试 验 ．．
取 １滴 全 菌 血 清置 于 载 玻
实验动 物 中心 。鲫 鱼购 自合 肥 市 某鱼 场 ， 择 平均 选 个体 重约 １０ｇ 外伤 健壮活 泼 的鲫鱼 ， ５ ｍ × ０ 无 于 ０ｃ ２ ｍ× ０ｃ 的玻璃 水 族 箱 中放 养 ７ｄ以上 ， 温 ０ｃ ５ ｍ 水
控制 在 ２ ２ ． ℃之 间 ， 认 健 康 无 病 后 用 于试 ８～ ９ ５ 确
１ ２ 方 法 ．
１ ２ １ 细 菌 的分 离 纯 化 ．．
无 菌 操 作 采 取 鱼 、 的 鳖
肝、 ‘ 脏器 ， 肾等 划线 接种 于营养 琼 脂平 板上 ， ２ 置 ８℃
恒温 培养 １ ２ ， 离单 个 菌落 。细 菌经 反 复传 ８～ ４ｈ 分 代 ２～ ３次纯化后 ， 种 于普通琼 脂 斜面 培养 基上保 转
维普资讯
一
１２一 ７
江苏农业 科学
２０ ０ ８年第 ２期
嗜水气单胞菌的分离与16SrDNA鉴定
嗜水气单胞菌的分离与16SrDNA鉴定作者：孙亭亭等来源：《安徽农业科学》2014年第13期摘要 [目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌，并构建系统发育分析。
[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养，并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析。
[结果]分离培养到1株细菌，命名为Ah1305。
经表型鉴定、生化试验及16S rDNA 系统发育分析，鉴定为嗜水气单胞菌。
[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考。
关键词嗜水气单胞菌；分离鉴定；16S rDNA中图分类号 S182；Q93-331 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03907-04Abstract [Objective] The aim was to isolate and identify Aeromonas hydrophila and establish the phylogeny. [Method] Lesion tissue of fish was collected from a certain farm in Yunnan Province，and then the isolated strain was identified by preliminary identification， 16S rDNA identification and phylogenetic analysis. [Result] The bacteria were isolated and named as Ah1305. Through the morphological identification， biochemical test and 16S rDNA phylogeny analysis， it was identified as Aeromonas hydrophila. [Conclusion] The study can provide reference for quick and accurately test the disease caused by Aeromonas hydrophila.Key words Aeromonas hydrophila； Isolation and identification； 16S rDNA致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于气单胞菌科（Aermonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，直或略弯，单个或成双排列，有极端单鞭毛，固体培养基上有周鞭毛，无荚膜，不形成芽孢，最适生长温度为28 ℃。
金鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验
金鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验周毅;张培培;徐晔;曹洁;孟学平;段宏安【摘要】自病死金鱼肝脏中分离到一株优势菌，对其进行感染试验、培养特性观察、生化特性鉴定及16S rRNA序列分析。
试验结果表明，该分离菌株为嗜水气单胞菌，与已报道的嗜水气单胞菌的16S rRNA序列同源性＞99．3％。
用纸片扩散法进行药敏试验，试验结果显示，该分离株对四环素类、喹诺酮类、磺胺类、头孢呋新、头孢他啶、头孢吡肟等21种药物敏感，对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、林可霉素、麦迪霉素耐药。
本次金鱼发病是由嗜水气单胞菌感染引起，可选用强力霉素、麦迪霉素、复方新诺明、磺胺甲基异恶唑、阿奇霉素、恩诺沙星、诺氟沙星等多种药物进行防治。
%Aeromonas hydrophila is one of the main pathogen of freshwater fish bacterial septicemia .The bacterium was isolated and identified from dead gold fish and drug sensitive tests were performed in order to provide references for the bacterial disease prevention and control in ornamental fish .A dominant bacteria strain was isolated from hepatopancreas of dead Carassius auratus and identified by artificial infection experiment ,cultural characteristics ,physical and chemical characters ,and 16S rRNA sequence analysis .The results showed that the strain was A .hydrophila .Homology of 16S rRNA of the isolated strain and other several A .hydrophila was more than 99 .3% .Drug sensitive test revealed that the isolated strain was highly sensitive to 21 kinds of drugs , including tetracyclines ,quinolones , sulfonamides , cefuroxime ,ceftazidimeand cefepime ,and resistant to penicillinG ,ampicillin ,amoxicillin ,cefalexin , lincomycin and medemycin . Results inthis study showed that many antibiotics (such as doxycycline , midecamycin ,co‐trimoxazole ,sulfamethoxazole ,azithromycin ,enrofloxacin ,and norfloxaci) can be used to control and prevent bacterial disease caused byA .hydrophila in gold fish .【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6页(P379-384)【关键词】金鱼;嗜水气单胞菌;分离;鉴定;16S rRNA;药敏试验【作者】周毅;张培培;徐晔;曹洁;孟学平;段宏安【作者单位】连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;淮海工学院海洋学院，江苏连云港 222005;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;淮海工学院海洋学院，江苏连云港222005;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042【正文语种】中文【中图分类】S917嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属弧菌科、气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端鞭毛，无芽孢，无荚膜，广泛分布于水体环境中[1-3]。
尼罗罗非鱼致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定与药敏试验
ｓ ｌｅｉ［ ． ｕｃｌ ｒ， ０ ９ ２ ７ ７ － ４ ｅ ａｖ ）］Ａｑ ａｕｔ ｅ ２ ０ ， ９ ： ８ ８ ． ｍｉ ｓＪ ｕ
洪云汉． 鱼类单个胚胎染色体标本 的快速制备法 【． Ｊ 淡水渔业， ］
１８ （）３ － ６ ９ ７１ ５ ３ ． ：
【 ］ 周丽青， ９ 杨爱国， 柳学周， 半滑舌鳎染色体核型分析［． 等． Ｊ 水产 】
学报， ０ ５ ２ （）４ ７ ４ ９ ２ ０ ， ９３： １— １．
Ｃ ｅ ，Ｓ ａＺ Ｘ，Ｙ ｈｎ Ｓ Ｌ ｈ ｅ Ｈ Ｑ．Ｅ ｔ ｌ ｈ ｎ ｆａｐｕｉｏ ｎ ｓ ｂｉ ｍｅｔｏ ｌｒ ｔ ｔ ａ ｓ ｐｅ
ｅ ｒｏ ｉ ｓ ｍ ｃｌ ｌ ｅｆ ｍ ｓａｐ ｒｈ Ｌ ｔ ｌｂａ ｐ ｎｃｓ ｍｂｙ ｎｃ ｔ ｅｌ ｉ ｒ ｅ ｅｃ ， ａｅ ａ ｒｘｊ ｏ ｉ ， ｅ ｎ ｏ ｏ ａ ｕ
【
【
２ 】
３ １
第４卷 第６ ３ 期
２ １年 ６ ０２ 月
东
北
农
业
大
学
学
报
４ （）１ ０ １５ ３６： １ ￣ １
Ｊ ｎ ０１ ｕ ｅ２ ２
Ｊｕｒａ ｆＮｏｔｅ ｔ ｒｃ ｌｕａ ｉｅｓｔ ｏ ｎ ｌ ｒｈ ￣ ｉｕｔｒｌ ｏ Ａｇ Ｕｎ ｖ ｒｉｙ
尼 罗 罗非 鱼 致病 性 嗜水 气 单胞 菌 的分 离 鉴 定 与药 敏 试 验
Ｂａｔｌ ｍｂ ｏ［］Ａ ｕ ２ ０ ， １： ４ — ５ ． ｌｓ ａｅ ｒ ｓ ． ｑ ， ０ ３ ２ ８ １ １ １ １ ｕ ｙ Ｊ
【 】 吴政安． ｌ Ｏ 鱼类细 胞的培养及其染色体标本 的制 备【． Ｊ 动物学 杂 １
志 ， ９ １２：０ ５ ． １８ （）５－ ４
一株嗜水气单胞菌的分离鉴定及其杀虫特性研究
关键 词 气 单胞 茵 ； 分 离鉴 定 ； 胃瘤 线 虫 ； 杀 虫特 性 中 图分 类号 ￥ ９ ４ ３ 文 献标 识码 Ａ 文 章编 号
１ ０ ０ ７ — ５ ７ ３ ９ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ９ — ０ ２ ７ １ — ０ １
世 界 的 许 多 地 方均 有 过 报 道 ， 给 渔 业生 产 带 来 了 较 大 的损
操作 按说 明 书要 求进 行 。
１ － ２ ． ４ １ ６ Ｓ — ｒ Ｒ Ｎ Ａ序 列 分析 。 提 取 分 离 菌株 的 Ｄ ＮＡ。 将 提 取 的Ｄ Ｎ Ａ作 为 模 板 ， 用 １ ６ Ｓ — ｒ Ｒ Ｎ Ａ通 用 引 物 进 行 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 。
ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ（ Ｌ Ｃ ５ ０） ｏ ｆ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｊ Ｚ 一１ ｗ ａ ｓ １ ． ９ ２ ￣１ ０ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍＬ． Ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｗ ｓ ａ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ａ ｓ Ａｅ ｒ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ｂ ｙ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｌ ａ ｃ ｈ ｒａ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ， ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍ ｉ ｃ ｌ ａ ａ ｎ ｄ ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ｌ ａ ｃ ｈ ｒａ ａ ｃ ｔ ｅ ｉｓ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ ． １ ６ Ｓ — ｒ ＲＮＡ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｎｄ ａ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｈ ｙ ｌ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｅ ｔ ｒ ｅ ｅ ． Ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｓ ａ ｍｅ ｔ ｉ ｍｅ ， ｔ ｌ ｌ ｅ １ ６ Ｓ — ｒ ＲＮ Ａ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ
一株罗非鱼出血病致病菌的分离与鉴定及组织病理观察
一株罗非鱼出血病致病菌的分离与鉴定及组织病理观察王忠敏;黄惠莉【摘要】从患有出血病症状的罗非鱼病灶部位分离筛选出一株高致病性菌(编号为BC-2),结合对菌落形态观察、生理生化实验及16S rDNA测序,确定该高致病菌为一种致罗非鱼死亡的蜡状芽孢杆菌.通过对健康鱼进行不同浓度致病菌的感染试验及定性数据机率的分析,可知其半数致死量(LD50)的对数值为7.534 8、感染的菌浓度为3.4×107 cfu· mL-1、置信限为95％.通过对患病鱼的不同组织器官的切片病理结构观察,可以发现鳃和肠是病变最明显的部位.%A highly pathogenic bacterium (No. BC-2) was isolated from the infected hemorrhage tilapia. Combination of the colonial morphology observation, the biochemistry test and 16S rDNA sequencing, the highly pathogenic bacterium was determined as Bacillus cereus, which could cause tilapia dead. Then infective test was carried out to normal tilapias with different concentrations of the pathogen, and the qualitative probability data analysis results showed that the logarithmic concentration of LD50 was 7. 534 8 with the confidence interval 95% when the infective concentration was 3. 4X 107 cfu· mL-1. After observing the pathological structure of different tissue and organ sections from infected tilapia, we found gill and intestine were the most evident lesion parts.【期刊名称】《华侨大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(033)006【总页数】7页(P660-666)【关键词】罗非鱼;蜡状芽孢杆菌;出血病;组织切片;病理【作者】王忠敏;黄惠莉【作者单位】华侨大学化工学院,福建厦门361021;华侨大学化工学院,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q939.124罗非鱼（Tilapia）属于热带鱼类，在广东、海南、福建等地都有大面积养殖，是我国一种主要经济鱼类.导致罗非鱼死亡的主要原因，有溶氧量过低、有毒物质的侵害、温度过低及病原体的感染等.在病原体中，细菌性疾病对罗非鱼的影响最为普遍，如嗜水气单胞菌导致的运动性气单胞菌病、链球菌引起的链球菌病、爱德华氏菌引起的爱德华氏病，以及柱状屈杆菌引起的烂腮鳃病［1］等.近些年，我国科研工作者从鱼体内分离出致病的气单胞菌［2］、嗜水气单胞菌［3］和无乳链球菌［4］；在国外，文献［5－7］分别报道柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）、格氏乳球菌（Streptococcus agalactiae）和弗朗西斯氏菌（Francisella sp.）均可引起罗非鱼感染发病.蜡状芽孢杆菌是一种条件致病菌，其致病性受宿主和环境的综合影响.随着水产养殖密度的增大，鱼体的栖息环境越来越恶劣，蜡状芽孢杆菌也很可能从机会致病菌中成为常见病原体.有研究表明［8］：蜡状芽孢杆菌也能通过食物中毒引起人体产生腹泻、呕吐症状的一种食源性病原菌，其本身通常是弱毒性，但其分泌的毒素会引起暴发性的食物中毒.2000年，冯斯敏等［9］报道了蜡状芽孢杆菌能引起军曹鱼大量死亡.本文针对当地养殖中暴发过的一次大批量罗非鱼死亡（以出血病为主）情况，从病灶的肌肉与肠部位分离筛选出致鱼出血病的高致病菌之一，并对该菌进行生理生化实验，观察该菌感染健康鱼后不同组织器官的微观病理结构变化.罗非鱼，由福建厦门集美台商养殖场提供 .无菌脱纤维羊血（购自上海源叶生物科技有限公司），苏木素－伊红法（HE）染色液（购自江苏南京建成生物工程研究所）.培养基，主要成分为氯化钠、蛋白胨、酵母膏、琼脂、无菌脱纤维羊血.用75%酒精对病鱼表面进行消毒处理，从病灶部位（肌肉、肠）取少量组织进行研磨成糊，加入10 mL，0.5%的无菌生理盐水混匀，在3 000r·min－1离心机上离心3～5min；然后，取上清液0.5mL，加入到4.5mL，0.5%的无菌生理盐水中，依次制成10－3，10－4，10－5，10－6，10－7，10－8等稀释度备用.取200μL上述每个稀释度进行LB血琼脂平板［10］涂布培养，每个稀释度3个平行，于35℃培养24h.对初筛的各个单菌落在LB琼脂平板中进行纯化培养，直至为单菌落为止，并对每个单菌落进行显微镜观察以确保无杂菌 .最后，用LB血琼脂平板对每个菌落进行涂布以记录观察菌落形态.选取大小基本一致的罗非鱼，分为13组，每组鱼5条 .其中：未注射任何物质的编号BC－00，注射生理盐水的编号BC－0，注射11种浓度致病菌的分别编号BC－1至BC－11.水温控制为20～25℃，水体pH值为6.8～7.0.实验进行腹腔注射［11］.对所筛选菌分别扩大培养后制成2.4×107 cfu·mL－1的菌悬液，每条鱼注射剂量0.2mL.制备6.56×109 cfu·mL－1的原菌液，进行不同浓度（10－1，10－2，10－3，10－4）稀释及腹腔注射0.2 mL，并对受感染鱼成活时间和死亡率进行统计 .取感染致死鱼的肌肉、鳃、肠、肝约5mm×5mm×2 mm大小的组织，经中性缓福尔马林固定液固定24h，再经脱水、透明、透蜡、包埋、切片（切片的厚度为15μm）及贴片处理等；然后，根据HE染色试剂盒进行染色，并在油镜下进行观察.供试菌的生理生化实验参考文献［12］.经细菌液体培养、离心获得菌体、裂解细胞（破碎或溶菌酶）、沉淀离心、溶解、PCR扩增，最后把扩增的序列送北京三博远志公司和生工生物工程（上海）有限公司进行16SrDNA测序测定.依据实验方法，从鱼的鳃、肠、肌肉等病灶部位筛选到11种菌，其中5株优势菌的形态如表1所示.BC－2菌落与菌株的电镜扫描形态，如图1所示.从图1可知：BC－2菌落呈灰色，菌落直径大小在4～8 mm，溶血圈较大，直径约11mm，为β溶血型；电镜下的BC－2菌为杆菌，从表面上无法看出有无芽孢；革兰氏染色BC－2菌的染色结果为蓝紫色，表明为G＋；芽孢染色观察发现菌体成蓝色而芽孢成浅红色.依据实验方法正常充气喂养7d后，对每天每组鱼的感染情况及死亡率进行统计，结果如表2所示.表2中：NI为感染鱼尾数；ND为不同时间死亡鱼的尾数；η为死亡率.从表2可知：BC－2菌的死亡率最大达到80%，且BC－2菌出现病症及死亡时间最快；空白组（BC－0与BC－00两组的死亡率为0%）.从各种菌感染后，鱼体表现出的症状所出现的时间快慢、死亡率的高低、症状的差异，表明BC－2菌感染罗非鱼的症状为出血病，且病变反应时间最快，死亡率也最高.此外，BC－2菌的菌落溶血圈明显，说明这种菌是罗非鱼的致病菌，而且是高致病出血病的病原体之一 .所以选BC－2菌为目标菌.BC－2菌的感染症状，主要是鳞有血丝、脱鳞、鳞片间有血丝、腹腔肿胀、大量皮肤表面鳞和皮肤的脱落，如图2所示.选取不同菌浓度（C）的BC－2菌，对6组健康鱼（每组10条）进行感染，统计致病菌后72h罗非鱼的死亡情况，结果如表3所示.根据英国学者D.J.Finney的Probit Analysis机率分析理论［13］，运用DPS软件中的生物测定对其进行计数型数据机值分析，并确定其半数致死量（LD50）.即拟合程度的卡方值χ2＝1.968 3＜7.815（自由度等于3时，＝7.815），表明所求的毒力回归曲线是合适的，即否定所求模型的异质性的假设.从计算结果中可以得出：LD50的对数值为7.534 8；感染的菌浓度为3.4×107 cfu·mL－1，其置信限为95%，菌的有效作用浓度在9.24×105～3.6×108 cfu·mL－1范围内.将在感染过程中感染致死的死鱼及时保存于4℃冰箱中，以备进行病理组织切片.经过组织切片观察，观察结果如图3所示.图3中，未感染鱼组织做空白对照.从图3可知：未感染鱼的鳃丝的横切片比较完整，而感染组的鱼鳃丝肿大；未感染鱼组的肠上皮细胞排列紧密，而感染组的鱼肠上皮细胞较为疏松，并有裂痕；未感染鱼组与感染组的肌肉结构区别不是很明显，只是细胞略微变大；未感染鱼组与感染组的肝组织细胞变化不大，只是感染组的肝细胞变得修长，且有一些零散的游离细胞.从图3可知：未感染鱼空白组与感染组的鳃与肠的结构有明显的变化，而肌肉和肝的区别不是很明显，故从病理组织结构上进一步确定BC－2是罗非鱼的一种致病菌.所发现供试菌对罗非鱼的病变明显部位在于鳃与肠，对肝的症状却不是很明显，这可能与分泌的肠毒素有一定的关系，有待进一步的研究.经革兰氏染色镜检发现BC－2菌为G＋杆菌（图1），其生理生化的鉴定结果如表4所示.由北京三博远志公司测定BC－2菌的16SrDNA的序列长度为1 242bp，GenBank公司经BankIt提交申请获得国际基因库接受的序列号为JN230702.经Blast比对分析后显示与该基因序列同源性较高的全部是芽孢杆菌，其中大部分为蜡状芽孢杆菌.图4为系统发育树，其中括号内编号为GenBank序列号，结点处数字为Bootstrap值.从图4可知：该菌与编号为DQ420176.1的同源性最高（达97%），且聚为一分支 .综合BC－2的形态、生理生化鉴定与16SrDNA基因序列分析结果，将BC－2致病菌鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）.蜡状芽孢杆菌群包括蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌［14］.蜡状芽孢杆菌是一种革兰氏阳性，需氧，特定条件下厌氧，运动型的，能产生内生孢子并产生有毒物质的棒状杆菌.其内生孢子是一种高度物化的处于休眠状态的一类细胞，能抵抗极端环境，如热、脱水及其他物理刺激 .蜡状芽孢杆菌能在苛刻环境中幸存是由于其孢子，一旦生存环境有利，则孢子会生长并大量繁殖［15］.但也有人发现孢子形成的环境对孢子的特性有影响，如耐热性与孢子形成的温度有关［3，16］.近年来，对蜡状芽孢杆菌的致病性的研究表明，蜡状芽孢杆菌能引起人体产生腹泻和呕吐［17］、出血病［18］、角膜炎［19］、急性眼内炎［20－21］.Lee等［22］报导了有关革兰氏阳性芽孢杆菌引起的皮肤类白侯感染症状.Xing等［23］发现在免疫缺陷病人中蜡状芽孢杆菌能引起肝脓肿和出血病.Chatterjee等［24］通过统计发现4 407只疟蚊幼体中有2.8%被蜡状芽孢杆菌所感染.Andrea等［25］发现在肝病晚期病人中蜡状芽孢杆菌引起的噬肉病，并且认为蜡状芽孢杆菌应该被视为一种病原菌而不仅仅是污染.研究表明蜡状芽孢杆菌是一种能引起人类产生食物中毒的病原菌［8］.本研究表明：蜡状芽孢杆菌也能致罗非鱼感染，表现出出血病状并引起高致死率.其不仅对人类健康食品生产是一种威胁，而且对罗非鱼也具潜在危害.因此，进行水产养殖中罗非鱼的致病菌之一——蜡状芽孢杆菌的研究，对于食品安全及水产养殖两方面都具有积极的意义，就像Andrea所呼吁的一样，蜡状芽孢杆菌应该被视为一种致病菌而非仅是一种对食品的污染.关于鱼的病理组织结构已经有不少科学工作者有过相关的研究.蔡完其等［26］研究罗非鱼溃烂病的病理结构时发现其患病骨胳肿大、肝细胞和肾上皮细胞颗粒变性，并且乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等同工酶活性减弱或消失 .秦蕾等［27］对养殖中的大菱鲆的爱德华氏病进行了菌种分离，并经16SrDNA鉴定为迟钝爱德华氏菌；而对患病的大菱鲆的组织切片发现的肾脏病变最为明显，用光镜与电镜发现该病的要主特征是巨噬细胞增生以及肉芽肿的形成 .汪开毓等［28］从斑点叉尾急性流行病分离到一株嗜麦芽寡养单胞菌，并对其进行组织病理观察，发现病变主要表现为全身组织器官广泛性水肿，其骨骼肌、肝等部位损伤较为严重，超微结构发现其线粒体与细胞核明显损伤.隗黎丽［29］研究了微囊藻毒素对鱼类的组织结构的变化，发现肝和肾脏等组织有一定程度的受损.这些相关文献的报道，发现病原菌对鱼的病变的主要部位在肝.文中从患出血病的罗非鱼病灶部位筛选出致罗非鱼产生较大死亡率的病源菌，从病理组织切片发现其病变组织最明显的是鳃和肠，其中鳃明显肿胀，而小肠则表现为上皮细胞松散、组织结构明显遭受破坏 .这与之前相关研究人员报道的爱德华氏菌导致的肝是主要的病变部位有区别［26－28，30－31］.以该蜡状芽孢杆菌为出发菌株，开发对罗非鱼及水产养殖中对抗此种病的各种疫苗的研制，通过免疫来增强鱼体自身免疫力、减少抗生素的使用营造一个健康、生态的食物链关系，具有一定的研究意义和广泛的应用前景.（责任编辑：钱筠英文审校：刘源岗）【相关文献】［1］曹维国.常见尼罗罗非鱼病的诊治［J］.中国水产，1984（2）：24－25.［2］李槿年，沈守琼，余为一，等.正常鱼体内条件致病菌种类的调查研究［J］.淡水渔业，1999（2）：21－24.［3］邓国成，江小燕，叶星，等.草鱼出血病混合感染的嗜水气单胞菌的分离、鉴定与理化特性［J］.微生物学通报，2009，36（8）：1170－1173.［4］卢迈新，黎炯，叶星，等.广东与海南养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析［J］.微生物学通报，2010，37（5）：766－774.［5］FIGUEIREDO H C P，KLESIUS P H，ARIAS C R，et al.Isolation and characterization of strains of Flavobacterium columnare from Brazil［J］.Journal of Fish Diseases，2005，28（4）：199－204.［6］EVANS J J，KLESIUS P H，PASNIK D J，et al.Human streptococcus agalactiae Isolate in nile tilapia（Oreochromis niloticus）［J］.Emerging Infectious Diseases，2009，15（5）：774－776.［7］SOTO E，HAWKE J P，FERNANDEZ D，et al.Francisella sp.，an emerging pathogenof tilapia，Oreochromis niloticus （L.），in Costa Rica［J］.Journal of Fish Diseases，2009，32（8）：713－722.［8］NA J S，KIM T H，KIM H S，et al.Liver abscess and sepsis with Bacillus pantothenticus in an immunocompetent patient：A first case report［J］.World Journal of Gastroenterology，2009，15（42）：5360－5363.［9］冯斯敏，云金蕊.蜡状芽胞杆菌引起军曹鱼大批死亡的报告［J］.中国水产，2000（8）：39－40.［10］彭喜春，张宁，冉艳红，等.海产品中溶藻弧菌的筛选及其致病因子的研究［J］.现代食品科技，2008，24（4）：312－315.［11］刘云，刘允坤，杨栋，等.牙鲆迟缓爱德华氏菌急性感染实验：4种不同方法的比较［J］.海洋科学，2001，25（2）：8－11.［12］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.［13］FINNEY D J.Probit analysis［M］.Cambridge：Cambridge University Press，1977. ［14］ABEE T，GROOT M N，TEMPELAARS M，et al.Germination and outgrowth of spores of Bacillus cereus group members：Diversity and role of germinant receptors ［J］.Food Microbiology，2011，28（2）：199－208.［15］BEDNARCZYK A，DACZKOWSKA－KOZON E G.Pathogenic features of bacteriafrom the Bacillus cereus group［J］.Postepy Mikrobiologii，2008，47（1）：51－63. ［16］CARLIN F，BRILLARD J，BROUSSOLLE V，et al.Adaptation of Bacillus cereus，an ubiquitous worldwide－distributed foodborne pathogen，to a changing environment ［J］.Food Research International，2010，43（7）：1885－1894.［17］ARAGON－ALEGRO L C，PALCICH G，LOPES G V，et al.Enterotoxigenic and genetic profiles of Bacillus cereus strains of food origin in Brazil［J］.Journal of Food Protection，2008，71（10）：2115－2118.［18］施彪，戚爱军.蜡样芽孢杆菌引起败血症1例［J］.淮海医药，1999，17（增刊1）：2. ［19］张国富，姚远.蜡样芽孢杆菌引起角膜炎结膜炎的诊断与分析［J］.实用医技杂志，2001，8（4）：252.［20］陈滨，胡勇平，项燕，等.蜡样芽孢杆菌致暴发性眼内炎2例［J］.中国眼耳鼻喉科杂志，2009，9（4）：255，274.［21］刘春林，徐红云，李红，等.蜡样芽孢杆菌致急性眼内炎1例［J］.中国实用医药，2010，5（6）：154.［22］LEE P L，LEMOS B，O′BRIEN S H，et al.Cutaneous diphtheroid infection and review of other cutaneous grampositive Bacillus infections［J］.Cutis，2007，79（5）：371－377. ［23］XING Jian－ming，ZHANG Su，DU Ying，et al.Rapid detection of intestinal pathogens in fecal samples by an improved reverse dot blot method［J］.World Journalof Gastroenterology，2009，15（20）：2537－2542.［24］CHATTERJEE S，GHOSH T S，DAS S.Virulence of Bacillus cereus as natural facultative pathogen of Anopheles subpictus Grassi（Diptera：Culicidae）larvae in submerged rice－fields and shallow ponds［J］.African Journal of Biotechnology，2010，9（41）：6983－6986.［25］ANDREA H，GUPTE A，MCAULIFFE P F，et al.Bacillus cereus necrotizing fasciitis in a patient with end－stage liver disease［J］.Surgical Infections，2010，11（5）：469－474.［26］蔡完其，黄琪琰.尼罗罗非鱼溃烂病的病理研究［J］.水产学报，1986，10（3）：261－271.［27］秦蕾.养殖大菱鲆爱德华氏菌病及其几种重要疾病的病理学研究［D］.青岛：中国海洋大学，2006.［28］汪开毓，耿毅，陈德芳，等.斑点叉尾鮰急性流行性传染病的病原分离与病理学观察［J］.中国水产科学，2007，14（3）：457－465.［29］隗黎丽.微囊藻毒素对鱼类的毒性效应［J］.生态学报，2010，30（12）：3304－3310. ［30］郭琼林，卢全章.鳗鲡爱德华氏菌病的组织病理学研究［J］.水生生物学报，1995，19（1）：56－60.［31］韩先朴，李伟，潘金培.爱德华氏菌人工经口感染及病理观察［J］.水生生物学报，1995，19（3）：245－249.。
罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析
收稿日期:2007-03-06基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻00428001-1).通讯作者谢芝勋,研究员,x z x @6作者简介唐小飞,66年生,女,苗族,广西永福人,高级兽医师,主要从事动物传染病研究工作。
罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析唐小飞1,谢芝勋1,邓显文1,余晓丽2,刘加波1,庞耀珊1,谢志勤1,谢丽基1(1.广西兽医研究所,广西南宁 530001; 2.广西水产研究所,广西南宁 530021)摘要:根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Ae r )毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR 技术,扩增GX L3、G X L5、GX L9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到p MD18-T 载体上进行序列测定。
测序结果表明,3个菌株Ae r 毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、9114%、9114%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性。
应用分子生物软件分析广西分离株GX L9Aer 成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5。
关键词:嗜水气单胞菌;气溶素(Aer)毒素基因;克隆中图分类号:Q952 文献标识码:A 文章编号:1003-1278(2008)03-0101-03 嗜水气单胞菌(Aero mona s hydrophila AH )是引起鱼类爆发性疾病的重要病原之一,给水产养殖业造成了重大的经济损失[1～3]。
由于此菌抗原成分复杂,存在众多血清型,不同地区流行的菌株在毒力和免疫原性方面又存在着明显差异,使其灭活苗的使用受到限制,商品化生产使用并不理想[3,4]。
嗜水气单胞菌也是人和动物共患的重要病原,致病因子很广。
目前已发现的嗜水气单胞菌的毒力因子有外毒素、蛋白酶、S 层、菌毛、转铁蛋白和外膜蛋白等;其中,外毒素是嗜水气单胞菌的最重要致病因子[5]。
湛江地区罗非鱼病原菌分离鉴定及毒力基因检测
片段大小
Fragment size∥bp
53
120
54
300
55
350
52
572
55
933
60
258
59
594
60
280
58
700
56
402
52
1 553
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ52
705
54
1 004
55
843
56
742
2 结果与分析
带情况为:华纳葡萄球菌携带 gap,大肠杆菌携带 pap、afa,粪
97
52 卷 5 期 罗帅帅等 湛江地区罗非鱼病原菌分离鉴定及毒力基因检测
法构建系统树,用 1 000 个自举法检测系统树中各个分支的
段大小见表 1,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1. 2. 4 毒力基因检测。 毒力基因引物序列、退火温度和片
兽医药理学与毒理学。 ∗通信作者,教授,博士,硕士生导
师,从事兽医药理学与毒理学研究。
收稿日期 2023-04-10
1. 1 材料
1. 1. 2 试剂。 脑心浸液肉汤培养基、营养肉汤琼脂培养基
购自广东环凯生物有限公司;Taq 酶、溶菌酶购自 Takara 公
司;细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公
R:5′-CGCCCTAATTGCTGGCGAC-3′
F:5′-AAGAAAAAGTAGACCAAC-3′
R:5′-AACGGCAAGACAAGTAAATA-3′
F:5′-GACAGACCCTCACGAATA-3′
R:5′-AGTTCATCATGCTGCTGTAGTA-3′
抑制嗜水气单胞菌乳酸菌的筛选、鉴定及抑菌作用
抑制嗜水气单胞菌乳酸菌的筛选、鉴定及抑菌作用江宇航;辛维岗;徐美余;杨瑞思;张棋麟;林连兵【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2022(42)1【摘要】从健康成年尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肠道中分离纯化得到乳酸菌,采用牛津杯双层平板法筛选具有抑制嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)活性的乳酸菌菌株,借助16S rRNA分子鉴定乳酸菌种类。
通过排除有机酸和过氧化氢干扰及蛋白酶敏感性等试验分析抑菌活性最佳乳酸菌的抑菌活性物质成分,并进行热、酸碱稳定性和扫描电镜观察等确定抑菌活性物质对嗜水气单胞菌的抑菌作用。
结果显示,尼罗罗非鱼肠道中有3株乳酸菌对嗜水气单胞菌表现出良好的抑菌效果,经鉴定后分别为植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。
其中,菌株LX3的抑菌活性最佳,抑菌圈直径可达到(25.25±0.23)mm且对多种蛋白酶敏感,经不同温度和酸碱性处理后抑菌活性物质仍保持较高的抑菌活性,特别是在pH 12和100℃处理后,抑菌圈直径仍达到(13.87±0.12)和(16.65±0.26)mm。
此外,扫描电镜观察发现菌株LX3抑菌活性物质主要破坏了嗜水气单胞菌的细胞结构,使细胞内容物流出,致其死亡。
结果表明,尼罗罗非鱼肠道中拥有较为丰富的抑制嗜水气单胞菌乳酸菌资源,尤其是菌株LX3显示出良好的抑菌活性与抑菌作用,这对于替代抗生素防治嗜水气单胞菌引发的相关鱼类疾病具有重要价值。
【总页数】6页(P61-66)【作者】江宇航;辛维岗;徐美余;杨瑞思;张棋麟;林连兵【作者单位】昆明理工大学生命科学与技术学院;云南省高校饲用抗生素替代技术工程研究中心【正文语种】中文【中图分类】Q93-331【相关文献】1.滤纸片法筛选抑制嗜水气单胞菌群体感应的乳酸菌及抑制作用分析2.抗嗜水气单胞菌NJ-1感染的乳酸菌筛选及其免疫调节作用3.传统腌渍蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选4.降解嗜水气单胞菌群体感应AHLs信号分子的乳酸菌筛选及淬灭作用5.传统发酵蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选与鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
几种常见的鱼类致病菌及其培养鉴定方法
爱德华氏菌属1. 迟缓爱德华氏菌特征：迟缓爱德华氏菌为革兰氏阴性病原菌，短杆菌，大小多在（～1）μｍ×（1-3）μｍ，无荚膜，亦不形成芽孢，为周毛菌，能运动。
生长温度范围为15-42℃，最适为37℃，适宜pH值范围为。
但以pH 较好，耐食盐浓度为0-4%，培养：该菌在普通营养琼脂培养基上25℃培养24，能形成圆形隆起灰白色湿润并带有光泽呈半透明状的菌落直径约为，在含5%-10%血液的普通营养琼脂培养基平板常用绵羊或家兔脱纤血液上的菌落与在普通营养琼脂上的基本一致，但稍大些。
在麦康凯琼脂、SS琼脂、胆盐硫化氢乳糖琼脂（DHL）、木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐（XLD）琼脂等肠道菌选择性培养基上可形成较小菌落因其产生硫化氢能使菌落中央为黑色。
在普通营养肉汤中呈均匀混浊生长。
危害：德华氏菌感染症，鳖发生白板病，鳗鲡红头病，鳝鱼的红病和渠道鲇鱼的气肿性腐烂病等感染：感染可发生于全年缺乏明显的季节性，在水温20℃以上时均可发生，但一般认为水温在15℃时，就能发生高峰期多出现在水温25-30℃时，一般于春季和夏季易发流行。
人工养殖的淡水鱼和海水鱼中均发现有该菌感染的发生如鲫、金鱼、虹鳟、大鳞大马哈鱼、黑鲈、真鲷、丽鲷、黑鲷、鲻鱼、川鲽、牙鲆等均可被感染发病，实验性可感染鲤鱼和青蛙。
分离培养：对于迟钝爱德华氏菌的分离培养，常见的临床标本材料是表皮肌肉坏死组织及内脏器官组织等。
通常将被检材料接种于普通营养琼脂血液琼脂及某种肠道菌选择性培养基（如SS琼脂、DHL琼脂、XLD琼脂、麦康凯琼脂等）平板，置28℃或37℃恒温培养18-24h。
形态特征检查：包括对标本材料中及纯培养物的爱德华氏菌形态检查，常采用革兰氏染色镜检，按该菌相应形态特征予以判定。
2. 鲇鱼爱德华氏菌特征：鲇鱼爱德华氏菌属于爱德华氏菌属，在该属细菌中最难培养。
菌体大小约1um×（2-3） um，为小直杆菌，革兰氏染色阴性，无荚膜，不形成芽孢，兼性厌氧，25℃时有动力，在37℃时无动力。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
１ 材料 和方 法
１１ 病 鱼 ．
来 自广西某 江 的 网箱养 鱼 场发 病罗 非鱼， 到实 验 送
室进 行 细 菌 分 离 鉴定 。
另一管不作处理， 置于 ４３备用 。同时取 １管正 常马丁 肉 １
维普资讯
・
１０ ・ （ ０ 总第 １６期 ） ４
水
利 渔 业
２０ ０ ６年 第 ２ ６卷第 ４期
罗非 鱼嗜水 气单胞 茵的分离鉴定
刘加 波， 芝勋 ， 显文 ， 小飞 ， 耀珊 ， 志 勤 谢 邓 唐 庞 谢
（ 西兽医研 究所， 广 南宁 ５００ ） ３ ０ １
按常 规方 法进 行 葡 萄 糖、 糖 、 糖 、 芽 糖 、 子 乳 蔗 麦 棉
糖、 阿拉伯糖 、 Ｄ一核糖、 木糖 、 叶苷、 七 甘露醇 、 杨 酸、 水 硫 化氢、 化 钾 、 素、 胶 液 化、 酸 盐 还 原 、 ｏ ｅ 氰 尿 明 硝 Ｖ ｇｓ— Ｐｃｋ ｕｒＶ ） Ｍｅｈ ｌ ｅ （ Ｒ） ｒ ａｅ（ Ｐ 、 ｔｙ Ｒ ｄ Ｍ 等生 理生 化 试验及 氧 ￣
中图分类号 ：９１４ ，９５ １５ ￥４ ． ￥６ ． ２ ２
文献标识码 ： 文章编 号 ： ０ — ２８２０ ）４ ００ — ４ Ａ １ ３ １７ ｆ０６０ — １０ ０ ０
２ ℃培养 ２ 。 ８ ４ｈ 取单菌 落接种于 含 １５ ． ％脱脂奶蔗糖胰 蛋
白胨琼脂平板上，８ ２ ℃培养 ２ 判定 ， ４ｈ 以在点种 菌生长 菌 落周 围 出现清晰溶蛋 白圈者判为 阳性 。 １７ 细菌鉴定系统鉴定 ．
腔注射正 常马丁肉汤 ０ １ｍ 。隔 离饲养 ， 察记 录小 白 ． Ｅ 观
养基 平板上， ８ ２ ℃培养 ２ ， 察溶血情 况及羊 血琼脂 平 ４ｈ 观
板上 的 菌 落形 态 。
１５ 生理生化特 性鉴定 ．
鼠发病和死亡情 况， 亡小 白鼠及 时解 剖并 进 行致 病 菌 死
分离鉴定 。
２０ ０ ３年 １ ～１ １ ２月， 西某沿江网箱养 鱼场 的罗非鱼 广 出现大批 发 病、 亡， 天 死 鱼 近 ５ ０ｋ 病鱼 主要 症 死 每 ０ 状： 发病初期病鱼眼睛发炎 、 血、 出， 充 突 覆盖一 层 白色的
纤维素性膜， 随后眼睛凹 陷、 疡， 表鳞 片、 鳍和 背鳍 溃 体 尾
ห้องสมุดไป่ตู้汤作对照。
１２ 病原菌的分离培养 ． 无菌 采取发病 或濒死 罗 非鱼 的肝 、 、 划 线接 种 脾 眼， 于血斜面培养基和普通 营养 培养 基上， ８ ２ ℃培养 ２ ， ４ｈ 分
离病原菌。
１８ ２ 罗非鱼致病 性试验 ．．
将 ５ ～１０ｖ 尾的小罗非鱼 ０ ０ ／ ．
分组 。 每组 ３尾。８ 组实验 鱼分 别腹腔 注射 ８株分离 菌马 丁肉汤培养物 ０ １ｍＥ 尾 （ 菌约 ０ ６ ． ／ 细 ． ～１亿／ ； 组 对 尾） １
照鱼腹腔注射 ０ ３ｍ 正常马丁 肉汤。隔 离饲养， ． Ｅ 死亡 罗 非鱼及时解剖并进 行致病 菌分离鉴定。 １ ８ ３ 小 白鼠致病 性试 验 将 １ ～２ ／ ．． ８ ２ ｇ 只的小 白 鼠分 组， 每组 ３只。每个菌株第 １组小 白鼠尾 静脉注射无菌滤 液 ０３ｍ ／ 第 ２组小 白鼠腹 腔注 射 马 丁 肉汤 培养 物 ． 只， Ｅ
１３ 形态学鉴定 ． 观察该分 离菌在 普 通琼 脂 板上 的菌 落形态 ， 兰 氏 革
染色、 膜染 色、 检。 荚 镜 １４ 溶 血 试 验 ．
取 纯化的 ８株分 离 菌 的培养 物， 接种 于羊 血 琼脂 培
０ １ ／ 细菌 约 ０ ６ １亿／ ） ． 尾（ Ｅ ｍ ．～ 尾 。第 １对 照组 小 白 鼠 尾静脉注射 ０ ３ｍＬ正常马丁 肉汤 ； ２对照组 小 白鼠腹 ． 第
化 酶和 接触 酶试 验 。 １６ 蛋 白酶 的检 测 ． 将 ８个 分 离 菌 株 分 别 接 种于 绵 羊 血 琼 脂 平 板 上，
１９ 药敏试验 ． 用杭州天和 微生 物试 剂有 限 公 司生产 的 药敏 纸 片，
按常规纸片法进行药敏试验 。 １１ Ｐ Ｒ检 测 ．０ Ｃ １１ ． 病原 Ｄ ．０ １ ＮＡ 的提 取 取 上述 ８个 分 离菌 株 马丁
溃烂， 的鱼鳞 片表面部 分覆盖 一层 白色彩 膜， 数鱼还 有 少 出现鳃盖 骨 溃烂。 剖检 病变 ： 稍 肿 大， 部 分 呈 土黄 肝 大
选取分离菌 株接 种于 普通 营养琼 脂 血平 板上，２ ℃ ８
培养 １ －２ ， ８ ４ ｈ 用美 国产 自动微生 物鉴 定 系统 （ ， Ｊ Ⅵ Ⅱ、 —
肉汤 培 养 物 及 弧 菌 、 炎 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 １ｍ 于 １ ５ 肠 Ｅ ．
摘要 ： 广西某 江网箱养 鱼场的发病或濒死罗非鱼 中分离到 ８株呈 ｐ 从 溶血 的革兰 氏阴性杆菌， 符合 嗜水
气单胞 菌的特征 ， 致病性试验 结果显示 ８株分离菌均具有较强的致病性 ， 均能致死 小 白鼠和 罗非鱼 ，并都 能 产生较强的毒素致死 小白 鼠； ８株分离菌对 环丙 沙星 、 氟哌酸、 氯霉素 、 庆大霉素等高度敏感 。 关键词 ： 非鱼 ； 罗 嗜水气单胞 菌 ； 离； 分 鉴定
色， 部分胰腺呈淡 土黄色 ， 囊高度 充盈 ， 胆 脾脏 呈 暗黑 色， 肾脏周 围有出血点 。我们 从不 同网箱 的病鱼 或濒死 鱼体 内分离 到 ８株致病 菌。 现将分离鉴定结 果报 告如下。
Ａ 一６ ） ＭＳ ０ 鉴定。 鉴定 板为美国进 口 儿３ Ｋ革兰 氏阴性 菌 ２
种鉴定卡（ ＧＭ ） 。 １８ 动物致病性试验 ． １８ １ 分 离菌株的培养及处理 ８株分 离菌株 均分别 接 ．． 种 到 ２管 马 丁 肉汤 中，２ ℃ 培 养 ２ ， 管 以 ３０ ０ｒ ８ ４ｈ后 一 ０ ／