嗜水气单胞菌感受态细胞的制备

嗜水气单胞菌电转化感受态细胞的制备

（1）将嗜水气单胞菌单菌落接种于 5 mL LB 培养基中,在30℃下振荡培养5h。取5mL培养液倒入100 mL LB培养基(用500 mL三角瓶)中,在30 ℃下振荡(300 r/min)培养至OD600为0.9-1.0

(2) 将培养物在冰水中放置15-30分钟,然后倒入500ml的离心瓶中,在4℃下1000g离心15分钟,弃去上清液。用100ml冰水悬浮细胞,1000g离心20分钟

(3)弃上清,用10ml冰冷的10%甘油悬浮细胞,1000g离心20分钟。

(4)重复步骤3一次。

(5)用冰冷的GYT培养基悬浮沉淀,分装的40uL样品可直接用于电转化或保存于-80 ℃,备用

嗜水气单胞菌的电转化

（1）将电转仪参数调至2.5 kv,时间5ms,电容5μF,脉冲阻抗控制在400-1000Ω。

(2)从冰箱中取出感受态细胞,在冰上解冻。在管中加入质粒1-2uL,轻旋以混匀内容物,在冰上放4-5 min。同时把电击杯放置冰上预冷。

(3)将转化混合物转移到电击杯中,吸干杯的外表面,放入电转化仪的样品槽中。

(4)充电到1.25kV,放电,进行脉冲电转化。

(5)取出电击杯,加入1mL LB培养基后,用移液器反复吹打,然后将菌液转移到无菌的离心管中,30℃中振荡培养120min。

(6)取200-800 uL涂布于含有氯霉素的LB平板上。

(7)将平板置于室温直至液体被吸干。30℃倒置培养,转化菌落在12-48h内出现

GYT培养基：10%(v/v)甘油0.125%(m/v)酵母提取物

0.25%(m/v)胰蛋白胨

使用0.22um滤器过滤除菌，分装成2.5ml一份，保存于4℃