RegIV基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及pcDNA-RegIV的构建与转染

1高峰，郑声琴，张宇伟，金月玲，田小强，黄培林东南大学医学院病理学系 (210009)E-mail：hpl@摘要: 目的探讨RegIV基因在四种结直肠癌细胞系中的表达水平，构建并转染pcDNA-RegIV重组质粒，为阐明RegIV基因在结直肠癌发生发展中的作用机制奠定基础；方法采用RT-PCR方法检测HT-29、CaCo2、Sw480、LoV o细胞系的RegIV基因的表达水平，将获得目的基因RegIV克隆于pcDNA3.1⁄（−）质粒上，用PCR、酶切进行鉴定后，脂质体转染至低表达甚至不表达RegIV的结直癌细胞系，用G418筛选后进行RT-PCR鉴定；结果 HT-29、CaCo2细胞系RegIV基因高表达，Sw480细胞系表达较前两者弱，LoV o细胞系RegIV阴性表达；构建的重组质粒中含有RegIV基因，经pcDNA-RegIV转染的LoV o细胞RegIV基因呈阳性表达；结论 RegIV基因在不同的结直肠癌细胞系中表达水平不同，成功构建和转染了pcDNA-RegIV可使得RegIV（-）的LoV o细胞系RegIV基因呈阳性表达。

关键词: RegIV基因，结直肠癌，重组质粒，基因表达，基因转染RegIV是Reg家族中的一个在结直肠腺瘤高表达的差异表达基因，它的高表达与腺瘤的形成、腺癌的发生有关[1-3]；并用反向Northern Blot得以证实[4]。

尤其在癌前病变（腺瘤、溃疡性结肠炎[5]）、结直肠腺瘤癌变区的高表达提示它可能是一个消化系统癌微转移的有效生物标记物。

目前RegIV基因在结直肠癌中的表达改变已逐渐被人们所关注，但RegIV在癌中的上调是一种癌发生的伴随现象，还是一种肿瘤特异性的反应？或者只是组织损伤的敏感的反应物？还是在癌中起癌基因的作用？等问题尚未阐明。

本实验通过检测RegIV基因在四种结直肠细胞系中的mRNA表达水平，然后将高表达RegIV的cDNA目的基因构建成重组质粒pcDNA-RegIV，转染[6，7]低表达甚至不表达RegIV的结直肠癌细胞系中，为RegIV在癌发生中的作用机制的阐明提供了一个有效可靠的方法。

1. 材料与方法1.1 材料E.coli DH5α 大肠杆菌为东南大学分子病理研究所保存；HT29、Sw480、 Caco2、LoVo 细胞系购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所；pcDNA3.1⁄ （−）质粒、Trizol、1本课题得到国家自然科学基金资助（30400534）11.2 方法1.2.1 引物的设计与合成[6]根据Genebank RegIV基因cds序列（全长477bp）和pcDNA3.1⁄ （−）质粒特点，按照酶切位点对侧翼序列的要求设计引物并附带相应的酶切位点：上游引物：5′-CATGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG-3′；下游引物：5′-CGCGGATCCCTATGGTCGGTACTTGCACAG-3′另外，设计一对片段长度为270bp的 ß-actin基因引物：上游引物：5′- CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′下游引物：5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′1.2.2 RegIV RT-PCR扩增用Trizol提取四种结直肠癌细胞系的总RNA，然后进行逆转录合成cDNA：接着再按如下条件行PCR扩增：94℃ 2min，94℃ 30sec、60℃ 30sec、72℃ 1min， 30cycles，72℃ 7min。

1%琼脂糖电泳检测，然后用PCR Purification Kit纯化回收，定量备用。

1.2.3 pcDNA-RegIV载体的构建将纯化的RegIV片段（496bp，含酶切位点）和质粒pcDNA3.1⁄ （−）分别按如下反应体系进行双酶切反应：RegIV 12µl，pcDNA3.1⁄（−）12µl，10×Buffer 4µl，EcoR1 1.5µl, BamH1 1.5µl, ddH20 21µl, 然后置37℃水浴2小时，行琼脂糖电泳后分别用PCR Purification Kit 纯化回收。

将酶切纯化回收后的RegIV片段和质粒pcDNA3.1⁄ （−）分别按如下反应体系进行连接反应：10×Buffer 1µl，T4连接酶1µl，pcDNA3.1⁄ （−）3µl，RegIV 5µl，16℃过夜，然后转化用Cacl2制备的新鲜感受态细菌DH5α。

次日在含100µg ⁄ml羧苄青的LB平板上挑取2个单菌落进行双酶切鉴定、PCR鉴定及采用PCR产物测序鉴定（ PCR产物需用回收胶试剂盒纯化）。

1.2.4 pcDNA-RegIV转染LoVo细胞系重组质粒pcDNA-RegIV 0.8µg置于50µl Opti-MEM中，2µl Lipofectamine 2000置于50µl Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min后合并为100µl，再轻轻混匀室温放置20min，加入24孔板培养的LoVo细胞系中24h，然后传代一次，加300µg ⁄ ml G418筛选一周后行RT-PCR；转染成功后改用100µg ⁄ ml G418维持培养，细胞的靶基因RegIV可稳定表达。

22.1 四种癌细胞系RegIV 的RT-PCR 结果RegIV 的RT-PCR 扩增产物电泳结果见下图1，可见3泳道只有270bp 的ß-actin,未见496bp 的目的基因；其它1、2、5、6泳道均可见。

1 2 3 4 5 6图1：RegIV 基因在四种结直肠癌细胞系中的表达水平1、2--HT29细胞, 3--LoVo 细胞,4--100bp Mark,5--Caco2细胞, 6--Sw480细胞2.2 重组质粒pcDNA-RegIV的酶切鉴定结果见下图21、3泳道均可见5.4Kb 的质粒及496bp 目的基因。

1 2 3图2：pcDNA-RegIV 的酶切鉴定结果 1、3为双酶切结果 2 为天为时代的Mark IV（从小到大为500bp、1kb、2kb、2.5kb、5.5kb、7kb） 32.3 质粒pcDNA-RegIV的PCR鉴定结果见下图31、2泳道均可见496bp目的基因。

1 2 3图3：pcDNA-RegIV的PCR鉴定结果1、2为PCR产物电泳结果，3为DL2000 Mark2.4 PCR产物的测序PCR产物采用下游引物进行反向测序，结果如下：GTTGGCGCTTGTTGCATTCGTTGCTGCTCCAAGTTAAAAAGTTGTTAT TGGAGCTCATCTCAGCACAGTGCTTGTTCCCACCCATGGACTTGCCAGACC AGGATCTGTACAGATACATGGCCCCATCAATCCACTGCCACTGCTGCCTCT TCTGTGGGTCGTGCAGGCCAATCCATATCGGCTGGCTTCTCTGATAGCCAC TTATGTACTCTGCTATGGTGCTGGCTTCCTTTAAACTCAGGATAGATGCCA GGTGGGCTCCGTTTCCGTAAGACTGACACTCGAGCTCGGCATCAGACCAG TTCCTCAGCTTCCTGAAGTAACCATAGCAATTGGACTTGTGGTAAAACCAT CCAGGAGCACAGCTGGGTCTCATGATGATATCACCCAGGACTCCTGTTTTG GCCAGGCAGCTCAGCAATAGGAGCAGCCGCATGCTTCTGGAAGCCATGAA TTCCATG42泳道可见496bp目的基因，3、4泳道未见。

1 2 3 4图4：pcDNA-RegIV转染LoVo细胞后的RT-PCR结果1为100bp Mark，2为pcDNA-RegIV（+）转染LoVo细胞，3为质粒pcDNA3.1⁄ （−）转染LoVo细胞，4为未转染的LoVo细胞。

3. 讨论Reg 家族的第一个成员被发现已有15年历史，据文献证实Reg基因家族参与肝、胰、胃和肠细胞的增殖分化、糖尿病炎症与创伤、肿瘤（消化系统肿瘤）有关，亦有文献报道它可能与微卫星不稳定性、细胞凋亡、肿瘤的发生发展和癌症的不良预后有关。

Zhang 等1999年通过抑制性差减杂交法(suppression subtractive hybridization，SSH)在一个同时患有结肠腺瘤及结肠腺癌的病例的正常结肠粘膜、腺瘤及腺癌建立了三个差减文库，研究结果显示：RegIV的高表达与腺瘤的形成，腺癌的发生有关[Zhang YW, Lai MD, Lv BJ, et al. Overexpression of Reg IV in colorectal adenoma. Cancer Letters 2003; 200: 69-76]。

获得的差异表达基因RegIV是已发现的Reg家族17个成员中的一个；2001年Hartupee等报道RegIV位于1号染色体长臂，其不仅基因序列与先前研究较多的RegI部分同源、结构也有相似之处、在结直肠癌的上调率也与RegI相近；到目前为止，国内外关于Reg IV的研究文献鲜见。

在本实验中，我们对四种结直肠癌细胞系（HT-29、CaCo2、Sw480、LoVo细胞系）的RegIV 基因表达水平进行了检测，结果显示HT-29、CaCo2细胞系RegIV基因高表达，Sw480细胞系表达较前两者弱，LoVo细胞系RegIV阴性表达，其与Sabine Violette等报道的不相一致[9]，我们分析其原因可能与各个实验室的实验条件和实验方法有关。

为此我们构建了重组质粒pcDNA-RegIV，并对RegIV（-）LoVo细胞系的进行了基因转染，以观察转染前后的RegIV mRNA5常用的基因转染技术是利用一定的载体和导入方法将外源基因或靶基因导入靶细胞，并使其在靶细胞内表达。

转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细胞可选用不同的方法，其目的是要达到提高转染效率。

我们选用的是脂质体转染，它具有高效、快速、方便易行的特点，可对各种类型的细胞达到最高的效率。

本实验通过构建含目的基因（RegIV）的重组质粒载体转入低表达或表达缺失的细胞系，观察转染后细胞的RegIV的表达水平，我们构建的重组质粒载体经过PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果与Genebank RegIV基因进行了比对，证实为RegIV基因序列；RT-PCR检测结果表明经转染的LoVo癌细胞能够高表达RegIV mRNA。