胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。

本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。

关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。

在特定条件下，它可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。

前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。

胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。

它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。

自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。

自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗,包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。

1 胚胎干细胞的分离自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的分离方法，在这里主要介绍三种：1.1 分离自胚胎内细胞团内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。

从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。

由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。

可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。

1.2分离自原始生殖细胞原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC）是生殖细胞前体，具有二倍体染色体，经减数分裂形成生殖细胞。

哺乳动物的原始生殖细胞最早出现在靠近尿囊基部的卵黄囊内胚层内，随着后期胚胎的纵向折转，卵黄囊这部分成为胚胎的后肠，其中的原始生殖细胞向生殖嵴移动。

因此，通过获取原始生殖细胞移动到的相应组织就可以获得原始生殖细胞。

所获得的组织经过消化后接种于饲养层细胞上进行分化抑制培养就可以获得干细胞。

1.3分离自胚胎瘤细胞胚胎瘤细胞（embryonic carcinoma cell）是可以形成畸胎瘤的细胞。

分离自胚胎瘤细胞的干细胞称为EC细胞。

EC细胞转化成恶性表型的可能性小[1]。

1.4 分离自生殖克隆细胞生殖克隆 ( 治疗性克隆 ) 由体细胞核转移 (Somatic cell nuclear transfer，SCNT)。

即将去核的卵细胞移植入另一体细胞核进行克隆使之形成囊胚，然后分离内细胞群，获得胚胎干细胞。

[5]2 体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异。

这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。

胚胎干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化[2,7]，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。

体外诱导细胞定向分化的机制主要包括基因因素、细胞质在细胞分化中的作用、细胞外因素[3]。

2.1基因因素基因的差异表达是在个体发育中，基因按着一定程序，有选择地相继活化的现象。

组织特异性基因对细胞决定着细胞向特殊类型分化的物质基础，如编码肌细胞肌球蛋白基因，编码结缔组织的胶原蛋白基因等。

2.2 细胞质在细胞分化中的作用调节基因差异表达的物质存在于细胞质中。

每个子细胞所继承细胞质的差异决定了各子细胞沿特定的方向分化。

2.3 细胞外因素（1）细胞间的相互作用。

①诱导。

一部分细胞对邻近细胞产生影响，并决定邻近细胞分化方向及形态发生的过程。

②细胞抑制。

是指在胚胎发育中，已分化的组织细胞产生抑素，抑制邻近细胞进行同样分化，避免相同的器官重复发生或过度发育。

（2）细胞外物质的介导作用。

细胞外起介导作用的物质包括细胞外基质、黏附分子、激素和细胞因子等，生长因子可诱导胚胎干细胞在体外分化，但还没有一种生长因子能诱导人胚胎干细胞定向分化为一种特定细胞，生长因子仅仅是增加某一种类型细胞的相对数量。

3 胚胎干细胞体外诱导的方法在特定的体外培养条件和诱导剂作用下，胚胎干细胞可以分化形成其他类型的细胞。

胚胎干细胞的诱导分化是目前研究的热点，人们通过不同的途径来实现这个目的。

目前胚胎干细胞体外诱导分化的方法有胚胎干细胞与其它细胞进行共培养、外源性生长因子诱导[3]、特异性转录因子异位表达法、选择性标记基因筛选目的细胞[1]。

3.1胚胎干细胞与其它细胞进行共培养诱导胚胎干细胞分化胚胎干细胞生长的微环境，对胚胎干细胞分化有很大的影响。

微环境中独特的细胞外基质成分、三维空间结构均影响着干细胞未分化表型的维持，也决定着干细胞的诱导分化方向。

最常用的传统人胚胎干细胞培养方法是将胚胎干细胞培养于成纤维细胞滋养层上或含成纤维细胞的条件培养基上[3]，并且加入碱性成纤维生长因子( FGF)[1]。

3.2 外源性生长因子诱导导入外源性基因也可使胚胎干细胞发生定向分化。

若把在特定发育阶段中起决定作用的基因导入胚胎干细胞基因组中，将会使细胞准确地分化为某一特定类型的细胞。

体外培养的胚胎干细胞对细胞因子具有依赖性。

在培养过程中添加或者撤除某些细胞因子可促进胚胎干细胞的增值或者分化。

在发育学方面研究比较深入的诱导因子主要有视黄酸( retinoic acid，RA )、骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic proteins，BMPs )、成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factors，FGFs )等。

3.3 特异性转录因子异位表达法将细胞系特异性表达基因转入胚胎干细胞，并使其表达产生特异性转录因子，诱导胚胎干细胞分化为某一类型细胞。

3.4选择性标记基因筛选目的细胞利用基因工程技术将带有选择性标记的基因转入胚胎干细胞，在体外培养胚胎干细胞，利用选择性标记基因（例如，抗生素基因、绿色荧光蛋白基因等）筛选出某一分化细胞，达到定向得到某一类型分化细胞的目的[1]。

4 胚胎干细胞定向分化的细胞胚胎干细胞可以体外诱导分化为多种细胞类型，目前，胚胎干细胞体外诱导分化的细胞包括造血系细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰岛素分泌细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝脏细胞、成骨细胞、表皮样细胞等[1]。

5 胚胎干细胞的应用前景由于胚胎干细胞和其他培养的细胞的生物特征上的区别，使得它成为生物学家的关注焦点和研究的载体。

在开展胚胎干细胞建系和定向分化研究的同时，以胚胎干细胞为材料，在核移植、嵌和体、转基因动物等方面也有广泛的尝试，在加快良种家畜繁育、生产转基因动物、加快组织工程发展、临床医学克隆治疗、建立人类疾病模型等方面有广阔的应用前景。

5.1 在发育生物学中的应用由于胚胎干细胞具有体外诱导分化为多种体细胞的能力，因此，小鼠胚胎干细胞和人类胚胎干细胞系的建立为发育生物学研究提供了一种新的实验材料和很好的实验模型。

而且，胚胎干细胞还可以用来研究基因表达和调控，探索细胞分化和细胞修复的机制，为细胞、组织和器官的修复和一直提供了足够的来源[6,13,14,15]。

5.2 在发育毒理学中的应用小鼠的胚胎干细胞和人类胚胎干细胞系的建立为毒理学研究提供了一种新的实验材料。

人类ES细胞系的建立为在体外开展基于人类ES细胞的发育毒理学研究提供了可能，可以更接近真实情况地研究药物或者其他因子对人体的毒理作用[6]。

5.3 在组织工程中的研究应用目前，组织工程种子细胞主要有两种来源，成体组织细胞和干细胞。

用胚胎干细胞定向分化作为种子细胞，较已往用人或动物的组织细胞作种子细胞好，数量大、生长快，取材容易[6]。

5.4 疾病治疗胚胎干细胞的诱导分化给疾病的治疗提供了全新的医疗手段，具体应用主要表现在两个方面：用细胞替代和移植治疗及基因治疗。

5.5 新药的研制与开发理论上, ES 细胞可提供任何组织类型的正常细胞, 为开发新药提供大量标本,如应用人胚胎干细胞培养成大量心肌细胞, 将有助于心脏病药物的开发等[5,11,12]。

6 胚胎干细胞研究存在的问题研究和利用胚胎干细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。

但是从目前及将来的发展前景看来,胚胎干细胞(特别是人胚胎干细胞) 的研究与应用面临着巨大的挑战，并在这一些问题。

6.1 来源限制由于需要胚胎作为胚胎干细胞分离的材料，因此人类胚胎干细胞研究存在来源限制问题。

6.2 体外培养困难由于胚胎干细胞在体外会自发分化，而且机制还不清楚，控制胚胎干细胞分化的抑制技术还有待完善。

6.3 安全性胚胎干细胞和多能成体干细胞的自发分化方向是多向的，干细胞移植后的成瘤性风险比较大。

6.4 伦理道德问题获取认得胚胎干细胞、体外培养的胚囊是否具有生命使人类胚胎干细胞研究面临伦理道德问题[1]。

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