微生物的生长与控制

微生物的生长与控制：
细菌的细胞周期：
细菌无性繁殖的方式：二分裂：同形分裂；异形分裂；多次分裂；劈裂；芽殖；孢子
大肠杆菌同形二分裂：首先新的细胞物质合成，细胞逐渐延伸，DNA开始复制，然后染色体向细胞的两端分离，在细胞中部开始形成隔板，最后隔板完全形成，将母细胞分割为大小一样的两个子细胞。

新月柄杆菌异形分裂：新月柄杆菌幼龄细胞的一端有鞭毛，而老龄细胞有柄，在繁殖过程中，有柄的细胞合成新的细胞组分，细胞延长，在无柄的一端长出鞭毛，然后以收缢的方式进行二分裂，产生一个有柄的细胞，和一个有鞭毛的游动细胞，游动细胞可以固着在新的基物上，最后鞭毛消失，在鞭毛消失处形成新的柄，进入下一轮生长和复制。

蛭弧菌多次分裂：首先，蛭弧菌侵入革兰氏阴性菌的周质空间形成蛭弧体，在寄主细胞中蛭弧菌可以产生水解酶，水解寄主细胞的细胞周质，以满足自己的营养需求以及生产，随着生长蛭弧菌细胞逐渐伸长形成丝状细胞，然后丝状细胞在多个部位分裂，形成多个子代细胞，每一个子代细胞又会形成新的鞭毛，最后寄主细胞裂解，子代蛭弧菌被释放到环境中。

节杆菌劈裂：节杆菌通过劈裂进行繁殖，节杆菌是革兰氏阳性菌，具有内外两层细胞壁，在细胞延长进行分裂的过程中，只有内层细胞壁参与横隔壁的形成，这样就形成了两个子细胞，共同被外层细胞壁包裹的状态，最后外层细胞壁在一侧断裂，形成V字形排列的两个子细胞。

细菌芽殖：生丝微菌的母细胞附着在固体基物上，然后长出丝状物，丝状物末端形成芽体，芽体逐渐膨大，长出1根鞭毛形成子细胞，有鞭毛的子细胞脱离母细胞后，母细胞继续以出芽的形式生成子细胞，子细胞最后也会失去鞭毛成长为母细胞。

生活周期：从一个新的子细胞的产生开始，到子细胞经过生长、繁殖产生下一代子细胞的阶段。

可分为三个阶段：
第一个阶段：细胞生长期：细胞合成一些新的细胞物质,相当于真核生物细胞周期的G1期。

第二个阶段：染色体复制和分离期：相当于真核生物的S期和M期中的有丝分裂期，而没有G2期。

（复制和分离同时进行）
第三个阶段：胞质分裂：细菌的隔板形成，细胞分裂产生两个子细胞。

FtsZ以环状形式定位在细胞中间，并募集多种其他的细胞分裂蛋白，确定细胞横隔板形成位置。

MinCDE确保FtsZ在细胞中间形成Z环；核酸位阻( nucleoid occlusion)确保只有在染色体分离后才能在细胞中间形成Z环。

微生物的群体生长：
分批培养(batch culture)：在固定体积的培养基中-次接种进行培养。

在培养过程中，即不添加新的培养基，也不移走老的培养物。

在不移去老的培养物也不添加新的培养基，即保持培养基液体体积不变的情况下：
根据不同培养时间细菌数量的变化，可以做出一条
反应细菌在整个培养期间反应菌数变化规律的曲
线。

就是细菌纯培养的生长曲线。

1.延缓期(lag phase)
迟缓期也可以称为延滞期、调整期或适应期，指少量细菌接种到新鲜培养基后，细菌并不马上分裂，细菌的数量基本维持恒定。

（生长速率常数为0，但细胞并不处于静止状态）细胞处于延缓期的原因：1、种子老化，细胞缺乏足够的能量和必需的生长因子来迅速生长繁殖。

2、前后培养基组分的差异，细胞需要合成新的酶来利用新的营养物质。

3、细胞损伤
缩短延缓期的措施：①利用对数生长期的细胞作为“种子；②接种前后使用的培养基组成相近；③适当扩大接种量；④改变菌种的遗传特性
2、对数期(exponential phase)
对数期又称为指数生长期细菌以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。

对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。

代时(generation time) ：指在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，也称为倍增时间(doubling time)。

3、稳定期
细菌进入对数期后，大量细胞迅速生长繁殖，由于营养物质被消耗、代谢产物大量积累和pH变化等原因，环境逐步不再适应于细菌生长，细菌净生长速率开始逐渐降低到0，新产生的细胞数量等于死亡的细胞数量，从而结束对数生长期进入稳定生长期即最高生长期。

细胞开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物。

芽孢杆菌开始形成芽孢。

开始合成抗生素等次生代谢产物。

菌体和代谢产物的最佳收获期。

对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定的最佳时期。

4、衰亡期
微生物群体到达稳定期后，继续培养，细胞代谢继续进行，营养物质耗尽，有毒代谢物质大量积累，细胞死亡速率逐步增加，活菌数逐渐减少，标志着进入衰亡期。

细胞代谢活性降低，细胞衰老并出现自溶。

细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊。

有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应。

二次生长：
培养液中同时存在两种均能被微生物所利用的主要营养物质时，微生物会进行二次生长，首先利用其中较容易利用，或者微生物偏爱的营养物质进行生长。

当这种营养物质被消耗完，进入稳定期后，微生物经过短暂的适应，开始利用第二种营养物质，再次开始新的对数生长，并进入新的稳定期，表现为二阶式的双峰生长曲线，称为二次生长曲线。

连续培养：
连续培养:是在细菌进入对数期时，以一定速度不断地添加新鲜培养液，同时以同样的速度移去培养物(包括菌体和代谢产物)使细菌能延长对数生长期的-种培养方法。

导致微生物生长停止的主要原因：营养物质的消耗和代谢产物的积累。

实现微生物连续培养的根本原则：在微生物的培养过程中不断地补充营养物质和以同样的速率移出培养物。

连续培养类型：恒浊连续培养、恒化连续培养
恒浊连续培养(Turbidostatic cult-ure)：利用光电系统来检测培养器内微生物的密度，并根据微生物的密度来控制培养液的流速，以此获取菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞。

恒浊连续培养的特点：所有的营养物质均过量，菌体以最高速率生长，适用于工业生产，获得大量菌体或代谢产物。

恒化连续培养：在整个培养过程中以恒定的流速来保持培养基中某种重要的营养物质的浓度不变，以此保持细菌的比生长速率恒定。

生长速率的控制因子一般氮源、碳源或者是无机盐，生长因子等物质。

恒化连续培养特点：培养基的流速恒定，营养物质中有限制因子，因此生长速率较恒浊连续培养低，适用于科学研究。

微生物生长的测定：
微生物生长测定的方法主要有3类：细胞数量测定法、测生物量法、测生理指标法
细胞数量测定法：
1、测定总菌数(即总的细胞数量) ：使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下测定出一定体积中的细菌或酵母菌的数量，再通过换算，求出待测样品中微生物的细胞总数。

通常，血球计数板用来测较大的微生物细胞，如酵母菌和霉菌孢子的数量，细菌计数板用来测量细菌的数量。

这两种计数板的构造相似，但细菌计数板的深度仅为血球计数板的1/ 5。

计数板直接计数法的优点：简单、快捷；缺点：不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2、活菌数测定：通常，通过稀释平板计数法来测定活细菌的数量。

所以活菌计数法往往又被称为平板计数法或菌落计数法。

其原理是:在高度稀释的条件下，微生物细胞充分分散，成单个细胞存在。

每个活的细胞在适宜的培养基和良好的生长条件下，可以通过生长形成一个单菌落，即菌落形成单位(colony formingunits, CFU)，通过统计长出的菌落数就可以推算出待测样品中的活菌数。

平板培养：涂布平板法是将0.1ml的样品加到平板上，然后用无菌涂棒将菌液涂布在整个平板表面，最后进行培养。

微生物在培养基的表面生长，形成菌落。

倾注平板法：是将1.0ml的样品放入无菌培养皿，再倒入适量已熔化，并冷却至45°C左右的培养基，将菌液与培养基混匀，冷却凝固后培养。

微生物在培养基的表面和内部生长，形成菌落。

优点：可以检测低浓度样品，获得纯培养；缺点：误差大，只能计数活菌，培养条件不能满足不同微生物的需求
测生长量法：重量法(湿重法、干重法)；含氮量测定法；比浊法
重量法：包括湿重法和干重法。

取一定体积的培养物，用离心过滤的方法将菌体从培养基中分离出来，洗净，然后称重，干重法就烘干后称重。

最后求出单位体积中细胞物质的重量，以此作为生长量的指标。

含氮量测定法:微生物细胞中蛋白质的含量是比较稳定的，通常是测出微生物细胞中的含N量后再换算出蛋白质的含量。

蛋白质的含量=含氮量X6.25；细胞总量=蛋白质总量/ (50%~
80% (或65%) )
比浊法：是一种快捷、有效的测定细菌生长量的方法。

比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，利用分光光度计测定时所吸收的光线越多(即透过的光线少)。

注意：细胞密度过高的样品需稀释后检测，只能检测均一的样品。

生理指标测定法：微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。

影响微生物生长的环境因素：
影响微生物生长的环境因素：温度；pH值；氧；水活度；渗透压
1、温度：是影响微生物生长繁殖的最重要因素之一
微生物生长的温度3个重要的指标：
最低生长温度是微生物能够维持生长、代谢的最低温度，低于这个温度则微生物的活动会受限制。

最适生长温度是微生物分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。

最高生长温度是生长、代谢能够进行的最高温度，如果温度稍稍超过最高生长温度，则生长停止。

但如果温度继续升高远远超过这个温度酶和核酸将永久的变性失活，微生物细胞会死亡。

根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为：嗜冷、兼性嗜冷、中温、嗜热和极端嗜热。

嗜冷微生物的嗜冷机制主要有以下几点：含有在低温下正常发挥功能的酶，这些酶在中温下也会变性失活；细胞膜中含有更多的不饱和脂肪酸和短链脂肪酸，在低温下维持细胞膜的半液态，以执行正常的生物学功能；有的嗜冷微生物在温度高于20℃时细胞膜会受损，细胞物质外泄；有的嗜冷微生物会产生一些物质降低细胞质的凝固点
中温型微生物不能在低于10°C的条件下生长。

因为低于10°C时蛋白质的合成过程不能启动，而且10°C以下的低温使很多酶对反馈抑制变得异常敏感。

高温微生物的耐热机制：含有热稳定酶和在高温下能够正常工作的蛋白合成系统；有一些能够稳定DNA的蛋白；膜脂饱和度更高，有更多的分支，而且分子量也更大，具有更好的热稳定性。

高温对微生物的影响：高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构(溶菌)，菌体死亡。

不同微生物对高温的耐受程度：
多数细菌，酵母，霉菌的营养细胞和病毒：50-65°C，10分钟致死。

放线菌，霉菌的孢子比较耐热：76- 80°C，10分钟致死。

细菌的芽孢有抗热性，致死温度和时间视菌而定
低温对微生物的影响：在低温下，微生物的代谢活动降低，接近于停止状态，但微生物的原生质结构并未破坏，不会很快造成死亡，并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复
正常的生命活动。

当温度过低造成微生物细胞冻结时，由于细胞内的水转变为冰晶，造成细胞的机械损伤和脱水，就会导致了微生物的死亡。

2、pH
pH对微生物的作用：
影响细胞膜表面电荷及膜的通透性，进而影响对物质的吸收。

改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径。

影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收或有毒物质的毒性。

微生物的生长pH值范围：细菌：6.5-7.5；放线菌:：7.5-8.0；真菌：5.0-6.0
微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。

3、氧
氧的危害：
超氧阴离子(O2-)、H2O2和羟自由基(OH-)，超氧阴离子和羟自由基是强氧化剂，能氧化细胞内的大分子物质和有机化合物，对细胞造成损伤，H2O2也会损害一些细胞组分。

好氧菌(Aerobes)：必须在有分子氧的条件下才能
生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受
体，细胞含有超氧物歧化酶和过氧化氢酶。

微好氧菌(Microaerophiles) ：有限的有氧呼吸能
力，或含有对氧敏感的分子，在较低的氧分压下
才能正常生长。

兼性厌氧菌(Facultative anaerobes)：在有氧或无氧
条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在
有氧时靠有氧呼吸产能，无氧时靠发酵或无氧呼
吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。

耐氧厌氧菌(aerotolerant anaerobe)：可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。

生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。

不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。

细胞内缺乏SOD。

专性厌氧菌(obligate anaerobes)：分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；只有无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；通过发酵或无氧呼吸产能；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。

4、水分活度
每种微生物生长都有最适的a w,高于或低于所要求的值，都会通过影响培养基的渗透压变化而影响微生物的生长速率。

微生物: 0.63 - 0.99
一般来说，细菌>酵母菌>丝状真菌>耐盐细菌和耐旱真菌
5、渗透压
一般的微生物生长所适应的渗透压在3-6个大气压之间。

等渗溶液：微生物在等渗溶液中生长时，维持细胞形态不变(0.5-0. 9%NaCI溶液为等渗溶液)
高渗溶液：微生物在高渗溶液中生长时，会出现质壁分离现象，严重时会引起细胞死亡。

低渗溶液：微生物在低渗溶液中生长时，细胞会吸水膨胀，乃至破裂引起微生物死亡。

微生物生长的控制：
1)灭菌(sterilization)：完全去除或杀死包括芽孢、孢子在内的所有微生物。

2)消毒(disinfection)：杀死或去除物质或物体中所有的病原微生物。

3)防腐(antisepsis): 在某些化学物质的作用下，杀死或抑制活组织表面的微生物。

3)化学治疗(Chemotherapy) :在用化学物质杀死或抑制宿主组织内的微生物。

控制微生物生长常用的物理因素：高温；辐射作用；过滤；超声波
高温：
致死温度：在一定时间内(通常是10分钟)杀死某种微生物所需要的最低温度。

衡量杀菌效果的指标：1)十倍致死时间(decimalreduc-tiontime):即在一定的温度条件下微生物数量十倍减少所需要的时间。

2)热致死时间(thennaldeathtime):即在一定温度下杀死所有细胞所需要的最短时间。

①焚烧灭菌：常用于接种工具、污染物品以及实验动物尸体等废弃物的处理。

②干热灭菌：烘箱内热空气灭菌；温度: 160-170°C；时间: 1-2h；金属器械、玻璃器皿等
高压蒸汽灭菌：湿热灭菌法中最常用的方法
③湿热灭菌法高压蒸汽灭菌：通常为121°C (1.05kg/ cm 2 ), 15-30分钟。

或115 °C，20分钟。

④间隙灭菌法：常压下100°C处理15-30min，以杀死其中的营养细胞。

冷却后，置于一定温度(28~37°C)保温过夜，使其中可能残存的芽孢萌发为营养细胞。

以同样方法加热处理。

如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。

⑤煮沸消毒：在水中煮沸15min或更长时间。

⑥巴氏消毒法：杀死了致病菌；降低了其它非致病菌的数量；延缓了食品的腐败变质；很好地保留了食品的风味。

低温维持法: 62-65°C维持30min；高温瞬时法: 72-75°C维持15s
辐照灭菌：
辐照灭菌(Radiation Steriliza-tion)：利用辐射线处理物品，达到抑制微生物或杀死微生物的目的。

非电离辐射灭菌、电离辐射灭菌
➊非电离辐射灭菌：紫外线照射( UItraviolet light irradiation)：最常使用的非电离辐射灭菌法。

紫外线照射杀菌原理:紫外线作用于DNA,使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，阻碍正常的碱基配对，从而抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物。

另外紫外线可以使O2变成O3(臭氧) ,O3也有杀菌作用。

紫外线照射杀菌只适用于物体表面，以及空气和水的消毒，在医疗卫生和无菌操作中广泛应用。

②电离辐射灭菌：X和γ射线是两种主要的电离辐射。

原理:使水和其他物质在吸收能量后电离，产生游离基，破坏DNA和改变生物大分子的结构，造成细胞损伤或死亡。

特点：穿透力强，非专一性,，用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。

y射线的电离辐射被用于：抗生素和激素等不能进行加热处理的物质的灭菌；肉类等食品的灭菌或消毒
食品辐照(Food irradiation)：使用一定剂量的电离辐射处理食品的过程。

过滤除菌：适合不耐热的液体的灭菌。

例如:对热不稳定的药品和蛋白溶液。

超声波：
超声波作用于液体会产生高压、强大的冲击波及数千度的高温，对微生物会产生粉碎和杀灭作用。

（食品杀菌、食具的消毒和灭菌）
控制微生物生长的物理因素：高温、辐射、超声波
最低抑制浓度(Minimum inhibitory concentration)：指
抑制某种微生物生长的最低药物浓度，是测量药物
抗菌活性的一个重要指标。

抑菌圈法(扩散法)：利用待测药物在琼脂平板中散，抑制周围的细菌生长而形成透明圈，即抑菌圈，根据抑菌圈的大小来判定待测药物抑菌能力的一种方法。

醇类是大家非常熟悉，并被广泛使用的一种消毒剂和杀菌剂。

二甲苯酚和邻苯二酚也是常用的消毒剂。

汞、银、铜、锌和砷等重金属作为杀菌剂使用已经有多年的历史。

卤素化合物中，氯和碘的化合物也是非常重要的抗微生物试剂。

氯在水体消毒和食品行业中被广泛使用，其常用的形式是氯气、次氯酸钠或者次氯酸钙。

化学治疗剂：通过直接干扰病原微生物的生长繁殖，而达到治疗疾病目的化学物质。

(1)干扰细胞代谢：有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，并能以竞争的方式取代它，从而干扰病原菌正常的代谢活动，这些物质被称为抗代谢物(Antimetabolite)。

(2)破坏细胞膜的结构和功能：多粘菌素(Polymyxin) :一种多肽类的抗生素，通过和革兰氏阴性细菌的脂多糖结合，破坏细胞的内、外膜，引起细菌细胞膜损伤，细胞质外漏，最后导致菌体死亡。

(3) 抑制细胞壁合成：青霉素(Penicillin) :具有B-内酰胺结构，与D-丙氨酰-D-丙氨酸竞争结合转肽酶，抑制细胞壁的合成，导致细胞渗透裂解。

(4)干扰核酸合成：喹诺酮类、新生霉素：抑制DNA解旋酶；利福平、曲线链丝菌素:抑制
依赖于DNA的RNA聚合酶；放射菌素:抑制RNA的延伸
(5)阻碍蛋白质合成：与50S核糖体结合，抑制蛋白质的合成：红霉素、氯霉素、克林霉素、林可霉素；与30S核糖体结合，抑制蛋白质的合成：四环素类、壮观霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、硝基呋喃类药；抑制tRNA的合成或功能：莫匹罗星、嘌呤霉素
超级细菌(superbugs)：也称为多重耐药性细菌，泛指对多种抗生素具有耐药性的细菌。

细菌产生抗生素抗性的机制：使抗生素分解或失活；药物作用标靶改变；改变代谢途径；降低胞内药物水品(限制进入或被外排)
控制微生物的生物因素：捕食菌：例如，蛭弧菌；病毒：例如，噬菌体；毒素：例如，细菌素细菌素(bacteriocins)：是某些细菌产生的一种能杀死有近缘关系的细菌的蛋白质或多肽。