不同品种猪HSL基因cDNA序列的克隆、测序与序列分析

不同品种猪HSL基因cDNA序列的克隆、测序与序列分析
雷明刚1 , 吴珍芳2 , 邓昌彦1 , 戴丽荷1 , 张振波1 , 熊远著1①
（1.华中农业大学农业部猪遗传育种重点开放实验室, 武汉430070; 2.华南农业大学动物科学系, 广州510640）
摘要：激素敏感脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）是负责分解脂肪组织中甘油三酯释放游离脂肪酸的关键和限速酶，也是影响动物脂肪沉积的关键酶。

本文将HSL基因作为影响猪脂肪代谢和沉积相关性状的候选基因，对不同品种猪HSL基因cDNA全长序列进行了克隆、测序与序列比较分析，并对不同物种HSL基因cDNA序列进行了进化关系分析。

研究结果表明：不同品种HSL基因cDNA序列存在20处碱基变异；猪与人、鼠等其它物种亲缘关系较远，而不同品种猪之间，外来品种之间亲缘关系较近，而与地方品种亲缘关系较远。

关键词：激素敏感脂肪酶；猪；克隆测序
激素敏感脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）是负责分解脂肪组织中甘油三酯释放游离脂肪酸的关键酶和限速酶，是调控脂肪组织分解的最关键因素，也是影响动物脂肪沉积的关键酶之一[1,2]。

哺乳动物将体内的脂肪酸以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞内，激素敏感脂肪酶能水解甘油三酯成甘油和脂肪酸以满足动物体的需要。

HSL基因主要在脂肪组织、肾上腺、卵巢、睾丸、胎盘、巨噬细胞、心脏、骨骼肌和平滑肌中表达[1]。

HSL基因的cDNA相继从大鼠、小鼠、人脂肪组织和猪中获得[3,4]。

猪HSL基因全长10~11 kb，包括9个外显子，编码171个氨基酸[4]，定位于6p1.1－q1.2[5, 6]，与定位于猪6号染色体上磷酸已糖异构酶位点、血清后白蛋白-2位点、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶位点、氟烷基因邻近或连锁[6, 7]。

现已证明这些基因与猪背膘厚度、瘦肉率和脂肪含量等性状相关。

由于HSL在脂肪代谢中发挥着重要作用和在染色体上所处的位置，许多研究者认为HSL基因是脂肪沉积和代谢相关性状的重要候选基因[8~11]。

本文将HSL基因作为影响猪脂肪代谢和沉积相关性状的候选基因，着眼于发现猪HSL基因的遗传变异和多态性，对不同品种猪HSL基因cDNA序列进行了克隆测序，并进行序列比较分析和物种间进化关系研究，以寻找猪背膘厚和瘦肉率性状的有效分子遗传标记提供依据。

１　材料和方法　
１．１　材　料　
大白猪、长白猪、杜洛克猪、梅山猪取样于华中农业大学试验种猪场和国家家畜工程技术研究中心精品种猪场；通城猪组织样取自湖北通城种猪场；清平猪组织样取自湖北省当阳畜牧局种猪场。

每一品种猪均采集3个无血源关系样本。

脂肪组织样采取部位为腹部胸颊处。

脂肪组织样分割成8-10g的小块，用锡箔纸包裹，迅速液氮冷冻，-70℃保存或立即进行RNA的提取。

克隆用载体和菌株分别是pMD18-T Vector和大肠杆菌DH5α。

１．２　引物设计　
参照文献[4]，应用Primer 5.0软件设计测序5对引物P1-P5（表1、图1）。

表1 引物P1~P5序列及退火温度
Table 1 cDNA sequences of primers of P1~P5 and annealing temperature
序 号 No. 退火温度(℃) Annealing temp.
引物序列 Primers
5ˊ-端（5ˊ-end ） 3ˊ-端（3ˊ-end ） P1 P2 P3 P4 P5
60℃ 56℃ 58℃ 55℃ 56℃
CCTGCCTTAATGTGCCTC AGGGCTGCTTCTACGG GTGAAGGACAGGACAGTGA CCTATGGAGTGCGGGT CGGCTGTCAACTTCTTATTT
TTGTAATGCTCCCCGAAG GTAAGGCTCGTGGGATTT CGGAGGTCTCGGAAGA GCCCTCACACTGTAGACTTT CTACCCCGCCCCTTTT
１．３　方法　
采用GIBCO 公司的Trizol Reagent ，按操作说明书分离总RNA ，Promega 公司反转录试剂盒合成cDNA 。

RT-PCR 产物经回收纯化，克隆到pMD18-T Vector 载体，转化大肠杆菌DH5α，对PCR 方法鉴定正确的阳性克隆进行序列测定[12,13]，应用clustalx 软件进行序列比较分析（/clustalw/ index.html ）进行。

２　结果　
２．１不同品种猪ＨＳＬ基因编码序列测定结果及序列比较
通过克隆测序，分别获得了大白猪（序列未登录）、清平猪、梅山猪（序列未登录）、杜洛克猪、通城猪5个品种猪HSL 基因全长cDNA 序列。

部分序列的GenBank 登录序列号为AY556478、AY556479、AY559451。

不同品种猪序列比较发现：不同品种猪HSL 基因cDNA 序列（ATG 为1-3bp ，TGA 为2293-2295bp ）存在20处碱基变异。

推导编码氨基酸序列分析发现第387、442、887、985、1869、1930、2113~2118、2164~2166bp 位置碱基变异引起了编码氨基酸改变（表2）。

表2 不同品种猪LPL 基因cDNA 碱基变异
图1 猪HSL 基因分段克隆示意图
Figure 1 the strategy for the Cloning ofporcineHSL Gene Reading Frame
２．２ 序列进化分析结果　
为了解不同品种猪间以及猪与其它相关物种间在进化上的关系，在生物学数据库（ ）找到人、大鼠、小鼠、鸡等一些动物的该基因的cDNA 序列，对不同物种的序列进行进化上的分析，分析结果如图2。

从图2可知，猪与人、鼠等其它物种亲源关系较远，而不同品种猪之间，外来品种之间亲缘关系较近，而与本地品种亲缘关系较远。

３　讨　论　
Harbitz 等[5]（1999）对猪HSL 基因的序列和结构研究发现，在猪HSL 基因5ˊ非翻译区有多个调控元件，包括脂肪酸特异结合位点（Fat acid special element, FSE -2）、糖皮质激素应答元件等，是重要的调控区。

在我们的相关研究和报道中，发现杜洛克、梅山猪、大白猪、清平猪4品种猪HSL 基因5ˊ-UTR 序列与Harbitz （1999）测定的长白猪序列在-13~-12 bp 位置存在碱基变异，并导致了限制性酶切位点（Mlu Ⅰ酶切位点）的改变。

但DNA 多态性分析并没有发现不同品种间存在Mlu Ⅰ酶的PCR-RFLP 多态性[15]。

吴珍芳等（2000）对不同品种猪HSL 基因5ˊ端非翻译区进行了PCR-SSCP 分析，没有发现多态性[16]。

这说明猪HSL 基因靠近起始密码子的5ˊ端非翻译区序列可能是比较保守的。

对于Exon1（1~516bp ）中442bp 位置有A →G 碱基间的变异，Knoll 等（1998）报道了该位点基于Bsa H Ⅰ酶的PCR-RFLP 分析结果[14]，发现梅山猪含有等位基因A 、G ，杜洛克猪（n=11，无亲缘关系）
图2 不同物种HSLcDNA 序列的进化关系
Fig. 2 Cladogram tree of the differential species on HSL gene
存在AG和GG基因型（频率：A-0.23; G-0.77）。

这与我们的序列分析结果一致。

进一步的研究发现脂肪型通城猪和清平猪有更多的等位基因A，而瘦肉型大白、长白只有等位基因G，杜洛克猪则存在AG基因型，资源家系多态性与背膘厚、肌内脂肪等性状间关系分析发现AG基因型和GG基因型在眼肌面积上存在显著差异，AG基因型对应的眼肌面积值最大，AA基因型次之，GG基因型校正眼肌面积最小[15]。

Harbitz等[4]（1999）报道了Exon8（1640~2058bp）中1869bp位置碱基变异及其PCR-SSCP多态性。

从本研究的cDNA测序结果看，Exon8中1869bp位置T¡úG变异似乎有品种特异性。

为了验证这一点，我们对4品种（3样本/品种）共12样本的猪HSL基因Exon8进行DNA序列测定，结果发现梅山猪和通城猪（中国地方猪种）6个个体全部为T，大白猪和长白猪（外来猪种）6个个体全部为G，确实具有明显的品种特性。

此位点变异是否与猪重要经济性状相关，值得深入研究和分析。

参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：　
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15. 雷明刚，熊远著等不同品种猪HSL基因 5 ¡ä- UTR和外显子Ⅰ片段的克隆测序及多态性分析，遗传学报，
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16. 吴珍芳，熊远著，I. Harbitz，邓昌彦，蒋思文，猪HSL基因PCR-RFLP多态性研究，遗传学报，2000，27: 686-690
Cloning，Sequencing and Analysis of porcine Hormone-Sensitive Lipase（HSL）Gene LEI Ming-Gang1 , WU Zheng-Fang2 , DENG Chang-Yan1 , DAI Li-He1 , ZHANG zhen-Bo1 , XIONG Yuanzhu1,①（1. College of Animal Science, Huazhong Agriculture University, Wuhan 430070, China; 2. College of Animal Science,
Huanan Agriculture University, Guangdong 510640, China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Hormone-sensitive lipase (HSL) is the key enzyme responsible for the mobilization of free acids from adipose tissue, and it is also the most important enzyme that affect fat deposition. In this paper, in order to detect new single nucleotide mutation of HSL gene among different pig breeds, the porcine hormone-sensitive lipase gene of Meishan pig, Largewhite, Tongcheng pig, Duroc and Qingping pig were cloned and sequenced. Sequence analysis indicated that there exist 20 nucleotide mutations among these breeds.
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　hormone-sensitive lipase ( HSL); porcine; cloning and sequencing。