细菌的生物化学试验
微生物检验学之细菌的生物化学试验
细菌的生物化学试验●考点碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验复合生化试验不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。
这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。
在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。
一、碳水化合物的代谢试验原理：细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。
据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。
1.糖（醇、苷）类发酵试验原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。
培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。
培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
方法：接种，培养。
结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。
产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。
不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。
应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
2.氧化-发酵试验（O/F试验）（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。
氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。
细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖而分解蛋白胨的细菌称为产碱型。
利用此试验可区分细菌的代谢类型。
（2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。
（3）方法：将待检菌同时穿刺接种于两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液状石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
细菌的生化试验名词解释
细菌的生化试验名词解释细菌是一类微生物，广泛存在于自然界中。
它们是单细胞生物，无真正的细胞核，但却能够执行一系列生化反应。
研究细菌的生化试验是了解细菌的基本生物学特性和进行抗菌药物研发的重要手段。
以下是一些常见的细菌生化试验名词的解释。
1. 嗜热菌试验嗜热菌试验用于检测细菌是否具有耐热能力。
这个试验基于嗜热菌能够在高温环境下生长的特性。
通过将细菌接种在含有特定营养物质的培养基中，并在高温下孵育，观察细菌的生长情况，可以判断其是否为嗜热菌。
2. 酸酶试验酸酶试验用于检测细菌是否能够产生特定的酸酶。
这些酸酶可以将特定的底物分解为酸性产物，从而改变培养基的酸碱度。
通过观察培养基颜色的变化或使用酸碱指示剂，可以判断细菌的酸酶活性。
3. 氧化还原试验氧化还原试验用于检测细菌是否能够对底物进行氧化或还原反应。
这些反应可以生成或消耗氧分子，并产生可见的颜色变化。
通过添加特定的底物和指示剂，可以观察培养基的颜色变化，从而判断细菌的氧化还原能力。
4. 胶原酶试验胶原酶试验用于检测细菌是否能够分解胶原蛋白，一种存在于动物组织中的重要蛋白质。
这个试验基于胶原酶可以将胶原蛋白分解为小分子肽或氨基酸的特性。
通过观察培养基的透明圈或使用特定染料的变化，可以判断细菌是否具有胶原酶活性。
5. 大理石气试验大理石气试验是检测细菌是否具有尿素酶活性的方法。
尿素酶可以将尿素分解为氨和二氧化碳。
这个试验基于细菌产生的氨可与酚红指示剂反应，使培养基呈现鲜艳的红色。
通过观察培养基的颜色变化，可以判断细菌是否具有尿素酶活性。
这些生化试验名词只是细菌研究中的一小部分，不同的试验可以提供不同的信息，从而深入了解细菌的特性。
在细菌学的研究中，这些试验通常与其他分析方法结合使用，以全面了解细菌的生化特性、代谢途径和致病机制，为抗菌药物研发和靶向治疗提供有力的依据。
通过深入研究细菌的生化特性，我们可以更好地理解它们的生存机制，并为人类健康和环境保护提供支持。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
细菌的生物化学鉴定技术
链球菌属
葡萄球菌属 微球菌属
五、其他生化或鉴定细菌常用试验
1．凝固酶试验
（1）原理： 玻片法 纤维蛋白原 结合凝固酶
纤维蛋白
试管法 游离凝固酶血浆协同因子 凝血酶样物质
（2）试剂：兔血浆。
纤维蛋白原
纤维蛋白
（3）应用：作为鉴卵磷脂酶试验
（2）培养基：10％去氧胆酸钠或纯牛胆汁。 （3）应用：主要用于肺炎链球菌和a链球菌的鉴别。前者阳
性，后者阴性。
五、其他生化或鉴定细菌常用试验
5．CAMP试验 （christie Atkins & Munch–Peterson Test，CAMP）
（1）原理：B群链球菌（无乳链球菌）产生一种CAMP因子， 能促进葡萄球菌的β–溶素的溶血活性，在B群链球菌和葡 萄球菌生长线交界处溶血力增加，出现箭头型透明溶血区。
（2）培养基：0.2％ DNA琼脂平板。 （3）应用：在阳性球菌中金黄色葡萄球菌产生DNA酶，
在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌可产生DNA酶。
五、其他生化或鉴定细菌常用试验
4．胆汁溶菌试验
（1）原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能由于胆汁 或去氧胆酸钠降低了细菌细胞膜上的表面张力，或者是由 于胆汁或去氧胆酸钠激活了细菌体内的自溶酶，使细菌的 细胞膜破损或使菌体裂解，发生自溶。
鉴别。
五、其他生化或鉴定细菌常用试验
7．杆菌肽试验
（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎100％敏感
其他群链球菌绝大多数对杆菌肽耐药
（2）培养基：血琼脂平板
（3）应用：鉴别A群链球菌与其他链球菌
8．奥普托欣（Optochin）试验
杆菌肽试验 A群链球菌
（1）原理：
肺炎链球菌的叶酸的生物合成受干扰
常用细菌生化反应试验
不发酵的V-P试验
总结词
详细描述
不发酵的V-P试验表示细菌不能发酵葡萄糖， 不产生乙酰甲基甲醇，在试验中表现为无色。
有些细菌不能发酵葡萄糖，因此不产生乙酰 甲基甲醇属、不动杆菌 属等。不发酵的V-P试验有助于鉴别非发酵 菌与肠杆菌科细菌。
临床意义
非发酵菌为医院感染的重要病原菌，可引起 呼吸道、泌尿道、伤口等感染。
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检测细菌对酸性环境的 适应能力，用于鉴别肠
道菌属。
试验原理
糖发酵试验
氧化酶试验
不同细菌含有不同的酶系，能够分解糖类 产生酸性或碱性产物，通过指示剂变色反 应判断细菌对糖类的代谢能力。
氧化酶催化过氧化氢分解为水和氧气，过 氧化氢在铁离子存在下形成棕色沉淀，通 过观察沉淀判断氧化酶活性。
触酶试验
甲基红试验
V-P试验阴性
总结词
V-P试验阴性表示细菌不能利用葡萄糖，不产生乙酰甲基甲醇，在试验中表现为无色。
详细描述
当细菌不能利用葡萄糖或不产生乙酰甲基甲醇时，V-P试验呈阴性。这通常表明该细菌 不属于肠杆菌科，因为肠杆菌科细菌通常能够发酵葡萄糖并产生乙酰甲基甲醇。V-P试
验阴性有助于排除某些肠道细菌感染的可能性。
过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧 气，氧气在硫酸中形成白色沉淀，通过观 察沉淀判断过氧化氢酶活性。
肠道菌属能够代谢糖类产生酸性产物，使 培养基pH降低，加入甲基红指示剂后呈红 色，通过观察颜色变化判断肠道菌属。
02 糖发酵试验
葡萄糖发酵试验
总结词
葡萄糖发酵试验是细菌生化反应试验中的一种，用于鉴别细菌对葡萄糖的代谢 能力。
04 Voges-Proskauer试验
微生物学检验细菌的生物化学实验
检测对象：特异性抗原
方法：直接凝集试验（玻片法）、荚膜肿
胀伤寒试杆验菌诊断血清 + 待检测细菌
（含抗伤寒杆菌抗体）
细菌凝集
玻片凝集试验：阳性
报告：检出伤寒杆菌
血清学诊断
试剂：含已知抗原 应用：检测待检者血清中有无相应的抗 体以及抗体的效价
球菌
种类: 革兰阳性 葡萄球菌属、链球菌属（链球菌、肺炎 链球菌）、肠球菌属、微球菌属等 革兰阴性 奈瑟菌属、布兰汉菌属
四种革兰阳性菌的比较
葡萄球菌属 微球属 链球菌属 气球菌属
排列方式 葡萄串状、 四联或成对 链状 成双或四联
触酶试验
+
+
-
弱+
氧化/发 酵
厌氧生长
发酵 +氧化 源自生长发酵 +发酵 弱
葡萄球菌属
最常见的化脓性球菌 医务人员的葡萄球菌带菌率高 革兰阳性、葡萄串状排列 产生不同的脂溶性色素 触酶试验阳性 发酵葡萄糖 金黄色葡萄球菌是主要致病菌
培养基不变色： － 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验， 主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
伏－普试验（V-P试验）
原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮 酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙 酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白 胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化 合物。
培养基：葡萄糖蛋白胨水
结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： －
应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
葡萄糖
甲基红试验
丙酮酸 大量混合酸
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红
葡萄糖
V－P试验
细菌的分离纯化生化试验以及保种
观察。
2、染色观察
• 固定的目的：
• 杀死细菌并使菌体粘附于坡片上。 • 增加细菌对染料的亲和力。
• 常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种。
染色观察
简单染色法 正染色 鉴别染色法 死菌 细菌染色法 革兰氏染色法 抗酸性染色法 芽孢染色法 姬姆萨染色法
负染色：荚膜染色法等 活菌: 用美蓝或TTC（氯化三苯基四氮唑）等 作活菌染色
项目总览
1、细菌的分离 2、生化试验 3、药敏试验 4、保存
制作: 宋云杰 指导: 薛永康
原理：在固体平板培养基上，用划线的方法或 用稀释涂布的方法将混杂菌群的微生物各个分 开，通过挑选单菌落而分离微生物。
特点： 快速、方便。 分区划线： 适用于浓度 较大的样品； 连续划线： 适用于浓度 较小的样品；
药敏片的制作
取定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸 片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中， 瓶口以单层牛皮纸包扎。经15-20分钟高压消毒后， 放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。 抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素 瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片 充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同 时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜， 干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮， 置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。 药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的 使用治疗量的比例配制药液。
生化试验指导方案
生化试验结果记录
• • • •
1、注意无菌操作 2、防止杂菌的污染 3、配试剂时要准确精准 4、注意留取空白对照
通过药敏试验可以得到所检测细菌敏感 的药物，用于疾病的准确治疗。在选择 合适的药物后，还要注意轮换用药，减 少同一种药物使用的频率，从而减少细 菌耐药性产生的机率。 注意事项： 1.药敏纸片的制作。 2.《药敏试验的操作执行标准》美国临 床试验协会。2008年版
实验细菌的生化鉴定
目 录
• 引言 • 实验细菌的种类和特性 • 生化鉴定方法 • 实验操作流程 • 生化鉴定结果分析 • 实验注意事项与安全防护
01
引言
目的和背景
目的
通过实验细菌的生化鉴定，了解细菌 的代谢特性、营养需求和生化反应， 为细菌分类、鉴定和疾病诊断提供依 据。
背景
细菌种类繁多，形态、染色、培养特 性各异，生化鉴定是鉴别细菌种类的 常用方法之一，对于细菌性疾病的诊 断、治疗和预防具有重要意义。
沙门氏菌等。
柠檬酸盐利用试验
总结词
柠檬酸盐利用试验是鉴定细菌对柠檬酸盐的利用能力的一种方法，通过观察细菌在含有 柠檬酸盐的培养基上的生长情况来判断其生化特性。
详细描述
柠檬酸盐利用试验是通过检测细菌在含有柠檬酸盐的培养基上的生长情况来判断其是否 具有利用柠檬酸盐的能力。试验中通常将细菌接种在含有柠檬酸盐的培养基上，观察其 是否能够正常生长，并产生相应的代谢产物。柠檬酸盐利用试验在细菌鉴定中常用于区
吲哚试验
甲基红试验
部分细菌能分解色氨酸产生吲哚，与试剂 反应后呈现红色，如变形杆菌。
大肠杆菌在葡萄糖代谢中产生甲酸，使培 养基pH值下降，可用甲基红染色加以鉴别 。
生化鉴定结果的可靠性分析
重复实验
为确保结果的准确性，应进行重复实 验以验证结果的可靠性。
对照实验
设置阳性对照和阴性对照，以评估实 验条件的可靠性。
04
实验操作流程
菌种接种与培养
菌种选择
选择待鉴定的菌种，确保其具有代表性。
接种
将待鉴定菌种接种至培养基中，设定适宜的 温度和湿度条件，进行培养。
培养基制备
根据实验要求，选择适宜的培养基，并进行 灭菌处理。
细菌生物化学试验
细菌生物化学试验（一）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科的细菌的鉴定尤为重要。
致病菌一般不分解乳糖，非致病菌多数分解乳糖。
2.氧化-发酵试验（O/F试验）主要用于肠杆菌科细菌（发酵型）与非发酵菌（氧化型）的鉴别。
两支培养基均无变化为产碱型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。
3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。
4.七叶苷水解试验主要用于D群链球菌（试验阳性）与其他链球菌的鉴别，也可用于革兰阴性菌及。
5.甲基红试验主要用于鉴别大肠埃希菌（试验阳性）与产气肠杆菌。
此外沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性。
试剂呈现红色为阳性，黄色为阴性。
6.V-P试验出现红色为阳性，无红色出现为阴性。
V-P试验阳性的细菌，甲基红试验通常为阴性。
（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验培养基呈液化状态为阳性。
沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶。
2.吲哚（靛基质）试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
测定靛基质用的蛋白胨含有大量的色氨酸。
两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
3.硫化氢（H2S）试验主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。
沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌绝大多数H2S阳性。
培养基变黑为阳性，不变为阴性。
4.尿素分解试验培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。
主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。
奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。
5.苯丙氨酸脱氨酶试验出现绿色为阳性。
主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。
6.氨基酸脱羧酶试验对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，呈黄色为阴性。
细菌生化实验的原理
细菌生化实验的原理
细菌生化实验是一种常见的研究细菌代谢途径和生物化学反应的实验方法。
它通常包括三个主要步骤：选取适宜的细菌菌种、培养细菌、并分析其代谢产物。
在细菌选择方面，考虑到细菌生物化学反应复杂的特性，需要根据实验需求选择目标菌株，例如肠道杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或者链球菌等常见菌株。
同时，不同菌株对不同的培养条件和适应性也存在较大差异，因此需要在实验设计时结合不同菌株的生长要求和代谢途径进行选择。
在菌株选择完成后，需进行细菌培养。
培养细菌的前提是提供足够的营养物质和一定的生长环境。
其中，菌株的生长速度和代谢途径的研究一般基于培养基和菌落两种形态进行。
培养基通常是由营养物质和生长环境组成的液体或固体培养基。
根据实验的具体目的，可以选择不同的培养基并进行改良，以达到优化细菌生长的效果。
菌落形态则通常是通过在无菌平板上点滴菌液，或通过接种环把菌液在无菌培养基上擦抹而形成的。
菌落的变化与菌株的性质、菌落反应的变化、菌落形态、菌株的特殊代谢等与菌种代谢相关的因素有关。
最后，通过检测菌株代谢产物来进行代谢分析。
这通常涉及使用各种质谱、色谱、电泳等方法来鉴定和定量化细菌代谢产物，以了解细菌生长和代谢途径的基本特
征。
综上所述，细菌生化实验的设计和执行需要涉及基础的生物化学知识和实验技能。
其电影目的是为了深入了解不同菌株之间的代谢差异，进而为生物工程、食品安全和医学研究等方面的应用提供更充分的科学依据。
细菌的生化试验—苯丙氨酸脱氨酶实验(微生物检验课件)
多用于肠杆菌科的鉴定。
苯丙氨酸脱氨酶试验结果
绿色阳性 黄色阴性
+ -
说出糖发酵试验的原理及应用。 说出VP试验原理及应用。 说出硝酸盐试验原理及应用。 说出触酶试验原理及应用。 说出氧化酶试验原理及应用。 归纳细菌生化试验的类型。
苯丙氨酸脱氨酶试验
原理：
有苯丙氨酸脱氨酶的细菌，可以使苯丙氨酸脱氨形成苯丙 酮酸，苯丙铜酸与三氯化铁作用形成绿色化合物。
苯丙氨酸脱氨酶试验方法
方法：
➢ 琼脂斜面法：将待检细菌接种到苯丙氨酸琼脂斜面上， 35℃培养24～h，取出，将三氯化铁试剂4～5滴滴于斜面 上，观察结果。
➢ 快速纸片法：将待检菌涂于苯丙氨酸纸片上，孵育15min， 取出，滴加三氯化铁试剂，立即观察结果。
细菌的生化鉴定
试验三细菌的生化鉴定试验目的：掌握常用细菌生化鉴定方法和结果判定熟悉细菌生化反应的临床意义，试验仪器：电热恒温培养箱、电冰箱、蒸汽高压灭菌器、超净工作台、电子天平、普通光学显微镜、鼓风电干燥箱、电磁炉、微波炉、生物安全柜等试验材料：菌种：大肠埃希菌培养基：EMB、KIA、葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖试剂：革兰染液试验步骤：1、分离培养：EMB平板制备，并分离划线；2、形态学观察：①菌落形态观察;观察比较三种细菌在EMB琼脂培养基上的菌落有何区别，并加以描述。
②菌体形态观察；革兰染色，将三种细菌涂在一张载玻片上，镜下观察细菌形态3、生化鉴定：穿刺接种五糖管、双糖铁4、血清学鉴定：伤寒沙门菌、志贺菌5、结果报告①菌落形态特征描述；②菌体镜下形态画图③生化鉴定结果；以列表形式给出，KIA用 -/-或+/-或-/+表示④血清学鉴定结果6、讨论：针对试验出现问题加以讨论。
讲解：1、细菌鉴定的基本步骤：①分离培养观察菌落形态特征：大小、湿润度、边缘、特征等。
②革兰染色：观察镜下菌体形态特征及染色性。
③生化鉴定：不同系均具有各自独立的酶系统，因而对底物的分解力各不相同，其代谢的产物也各异。
这些代谢产物又个具有不同的生物化学特征，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。
在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种的鉴定无论是应用手工鉴定还是自动化仪器鉴定，都需要通过这些生物化学试验来实现，可见掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。
因此依托前两项（特性观察和染色性）的结果，选择特征性的生化试验，是细菌鉴定的必要步骤。
④血清学鉴定：在以上结果符合所检定的目的菌时，选择相应的鉴定血清做进一步鉴定菌种。
2、培养基成分及原理、接种方法及用途：①伊红---美兰培养基（EMB）：该培基中含有4%伊红和6.5%美兰两种指示剂及0.5%的乳糖和0.5%蔗糖，若被检菌能分解乳糖产酸，使培基的pH下降，则促使伊红与美兰结合成紫红色或紫黑色复合物，并附着于菌落的表面，且使菌落表面带有金属光泽；而碱性环境中二者不结合。
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各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
1.碳水化合物的代谢试验1.1糖（醇、苷）类发酵试验1.1.1原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
1.1.2方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
1.1.3 结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
1.1.4 应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表 1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖 ; 五碳糖：核糖、核酮糖、木糖、阿拉伯糖; 六碳糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）、乳糖（葡萄糖＋半乳糖）、麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）、淀粉醇类侧金盏花醇、卫茅醇、甘露醇、山梨醇非糖类肌醇1.2．葡萄糖代谢类型鉴别试验1.2.1 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。
本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
1.2.2 方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。
置35℃孵箱孵育48h以上。
1.2.3 结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
1.2.4 应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。
肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。
也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。
1.3．甲基红（MR）试验1.3.1 原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。
如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在 5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。
1. 3.2 方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h 后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。
1.3.3 结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。
1.3.4 应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。
肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
1.4．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）1.4.1 原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。
有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。
用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。
1. 4.2 方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。
1.4.3 结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。
1.4.4 应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。
埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。
1.5．VP试验1.5.1 原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。
某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。
在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。
即V-P试验阳性。
1.5.2 方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml 400g/L KOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。
1.5.3 结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。
1.5.4 应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。
本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。
但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和MR试验常同为阳性。
1.6．胆汁七叶苷水解试验1.6.1原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。
七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。
1.6.2 方法：将被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃孵育18~24h后，观察结果。
1.6.3 结果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。
1.6.4 应用：主要用于鉴别D群链球菌与其它链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。
D群链球菌本试验为阳性。
1.7．淀粉水解试验1.7.1 原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培养基上滴加碘液时，可在菌落周围出现透明区。
1.7.2 方法：将被检菌划线接种于淀粉琼脂平板或试管中，35℃孵育18~24h，加入革兰碘液数滴，立即观察结果。
1.7.3 结果：阳性反应，菌落周围有无色透明区，其它地方蓝色；阴性反应，培养基全部为蓝色。
1.7.4 应用：用于白喉棒状杆菌生物型的分型，重型淀粉水解试验阳性，轻、中型阴性；芽胞杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。
1.8．甘油复红试验8.1原理：甘油可被细菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脱去羧基为乙醛，乙醛与无色的复红生成醌式化合物，呈深紫红色。
1.8.2方法：取被检菌接种于甘油复红肉汤培养基中，于35℃孵育，观察2~8d。
应同时做阴性对照。
1.8.3结果：紫红色为阳性，与对照管颜色相同为阴性。
1.8.4应用：主要用于沙门菌属内各菌种间的鉴别。
伤寒沙门菌、甲（丙）型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、孔道夫沙门菌和仙台沙门菌本试验为阴性，乙型副伤寒沙门菌结果不定，其它不常见沙门菌多数为阳性。
1.9．葡萄糖酸氧化试验1.9.1原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成α-酮基葡萄糖酸。
α-酮基葡萄糖酸是一种还原性物质，可与班氏试剂起反应，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
1.9.2方法：将待检菌接种于葡萄糖酸盐培养基中(1ml)，置35℃孵育48h,加入班氏试剂1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷却，观察结果。
1.9.3结果：出现黄到砖红色沉淀为阳性。
不变或仍为蓝色为阴性。
1.9.4应用：主要用于假单胞菌的鉴定和肠杆菌科菌分群。
2.氨基酸和蛋白质的代谢试验2.1硫化氢试验2.1.1原理：某些细菌能分解含硫氨基酸生成硫化氢，与亚铁离子或铅离子结合形成黑色沉淀物。
2.1.2方法：将待检菌接种于含硫化物及亚铁离子的培养基或克氏双糖铁琼脂（KIA）中，35℃孵育18~24h，观察有无黑色沉淀出现。
或用醋酸铅纸条，悬挂于KIA管中（白色滤纸，根据试管大小裁剪适当，在热的50g/L醋酸铅饱和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘干，121℃15min高压灭菌备用）。
醋酸铅是最敏感的方法。
2.1.3结果：有黑色沉淀物为阳性。
1.4应用：主要用于鉴别肠杆菌科细菌，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。
但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。
2.2．明胶液化试验2.2.1原理：细菌分泌的胞外蛋白水解酶（明胶酶）能分解明胶，使明胶失去凝固能力而液化。
2.2方法：将待检菌接种于明胶培养基中，35℃孵育24h到7d或更长时间，每24h取出放入4℃冰箱约2h后，观察有无凝固。
2.2.3结果：如无凝固，则表示明胶已被水解，液化试验阳性。
如凝固，则继续培养。
2.2.4应用：奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。
有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。
另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化。
2.3．吲哚试验（靛基质试验）2.3.1原理：某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚与对二甲氨基苯甲醛形成红色的玫瑰吲哚。
2.3.2方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育24~48h，加入靛基质试剂，观察结果。
2.3.3结果：红色为阳性，无色为阴性。
2.3.4应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的鉴别。
2.4．苯丙氨酸脱氨酶试验2.4.1原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。
细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。
若延长时间，会引起退色。
2.4.2方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化铁试剂4~5滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。
2.4.3结果：有绿色出现为阳性。
2.4.4应用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。
2.5．氨基酸脱羧酶试验2.5.1原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。