第十三章分子诊断

正常探针 异常探针
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Leber 病患者 PCR/SSCP分析 分析
﹣
+
正常人
纯合突变
杂合突变
PCR/单链构象多态性分析（SSCP） PCR/单链构象多态性分析（SSCP） 单链构象多态性分析 原理
将经扩增的DNA片段变性形成单链，由于序列不同， 将经扩增的DNA片段变性形成单链，由于序列不同，单 DNA片段变性形成单链 链构象就有差异， 链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率 不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。 不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。
三、分子诊断常用技术
核酸分子杂交技术 等位基因特异寡核苷酸探针(allele 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO) DNA限制性长度多态性(restriction DNA限制性长度多态性(restriction 限制性长度多态性 fragment length polymorphism, RLFP)分析 RLFP)分析 PCRPCR-SSCP DNA测序 DNA测序 DNA芯片技术 DNA芯片技术
DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类： DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3 分析中常用的遗传性多态性标记有
RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 重复序列多态性（VNTR） STR其重复次数在人群中存在 2）重复序列多态性（VNTR）：如STR其重复次数在人群中存在 变异， 为第二代多态性标记； 变异，形成多态即 VNTR ，为第二代多态性标记； 单碱基多态性（SNP） 3）单碱基多态性（SNP）：发生在基因组中的单个核苷酸的替 为第三代多态性标记。 代，为第三代多态性标记。
DNA测序 DNA测序
DNA自动测序结果举例
DNA芯片技术 DNA芯片技术
四、分子诊断的应用及举例
遗传疾病 肿瘤 感染性疾病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、 法医学中个体识别、亲子鉴定
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG) Ⅱ酶切位点
等位基因特异寡核苷酸探针（ASO） 等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）
引物1 引物 5’ 3’
点突变（C to T） 点突变（ ）
引物2 引物 探针1 探针 3’
G
5’
探针2 探针
3’
5’
A
限制性片段长度多态性分析（RFLP） 限制性片段长度多态性分析（RFLP） 原理 DNA序列上发生一个变异后获得或丢失了一 指DNA序列上发生一个变异后获得或丢失了一 限制性识别位点，使DNA限制性片段长度发生 限制性识别位点， DNA限制性片段长度发生 变化， 变化，在人群中形成两种或两种以上的限制性 类型 利用特定限制性识别位点进行基因分析
4
二、分子诊断策略
DNA多态（ Polymorphism） DNA多态（DNA Polymorphism） 多态
群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段） 群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种 DNA区域中等位基因 或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。 多态。 或两种以上的形式，对基因功能没有影响， DNA多态
优点
• • 检测基因变异，具有操作简便、快速特点， 检测基因变异，具有操作简便、快速特点，不需特殊设 己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变， 己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变， 备，适用于大样本筛选。 适用于大样本筛选。 基因的多态性分析等。 基因的多态性分析等。
PCR-SSCP） （ PCR-SSCP）示意图
基因突变类型—缺失、点突变、重复、 基因突变类型—缺失、点突变、重复、插入等 ——应用DNA多态性为遗传标记进行连锁分析 应用DNA多态性为遗传标记进行连锁分析， 间接诊断——应用DNA多态性为遗传标记进行连锁分析， 确定待测者是否得到带有致病的染色体， 确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出 诊断 DNA多态——RFLP、VNTR、 DNA多态——RFLP、VNTR、SNP 多态——RFLP
一、分子诊断的概念和特点
特点
特异性强 灵敏度高 早期诊断性 已明确疾病表型与基因型的关系 适应性强 检测致病基因突变；分析与疾病连锁的遗传标志； 检测致病基因突变；分析与疾病连锁的遗传标志；建立 多基因疾病表型克隆； 多基因疾病表型克隆；定量分析致病基因的表达水平
分子诊断的前提
二、分子诊断策略
直接诊断——直接检测致病基因的突变 直接诊断——直接检测致病基因的突变 ——
GAG → GTG ↓ Aa→ 谷Aa→缬Aa 5´ ´ 1.15k´ ´
突变基因
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 1.35kb 1.15kb
﹣
0.2kb
+
正常人 突变携带着 患者
镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交 镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交 ASO
Probe—— ——与正常 Normal βΑGene Probe——与正常 Probe βΑ杂交稳定 Probe—— ——与异常 Mutation βS Gene Probe——与异常 βS杂交 稳定
镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交 镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交 ASO 斑点杂交结果： 斑点杂交结果： βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS
第十二章 分 子 诊 断
一、分子诊断的概念和特点
概念： 概念：
利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法， 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法， 通过检测基因结构或其表达水平是否正常，从而对人 通过检测基因结构或其表达水平是否正常， 体健康状态和疾病作出诊断的方法。 体健康状态和疾病作出诊断的方法。 传统的诊断：表现型→ 传统的诊断：表现型→基因型 基因型→ 基 因 诊 断：基因型→表现型 逆向诊断） （ 逆向诊断）
RLFP分析法 分析法
RFLP分析 RFLP分析
优点 • 分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观 分辩率高，无需标记,重复性好， • 主要用于核酸变异分析比较, 微生物的分群分型， 主要用于核酸变异分析比较, 微生物的分群分型， 癌基因分析，遗传病的诊断等。 癌基因分析，遗传病的诊断等。 局限 只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选， 只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选，检测 效率低。 效率低。