凝胶电泳及其应用
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（polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置图
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳确定蛋白质分子量
操作过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净 的小烧杯 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好
配胶
分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml)
凝胶电泳原理图
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。
凝胶电泳装置图
垂直式电泳装置
水平泳速度的因素：
❖ 样品本身：带电量，分子大小，形状 ❖ 电场强度：电压 ❖缓冲液：成分， pH ，离子强度 ❖ 支持介质：电渗作用，吸附作用 ❖ 温度
凝胶电泳应用
ddH2O 30%Acr Buffer
10%SDS
4.05ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µl
6.8ml
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
100µl
10%Ap
50µl
100µl
TEMED
10µl
10µl
3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯 倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置至胶凝
凝胶电泳原理
❖ 当一种分子被放置在电场当中时 , 它们就会以一定的速度 移向适当的电极 , 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 , 叫做电泳的迁移率。
❖ 它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。 也就是说 ,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量 越多 ,其迁移的速度也就越快 , 反之则较慢。由于在电泳 中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质 , 如琼脂糖凝 胶和聚丙烯酰胺凝胶等 , 从而降低了对流运动 , 故电泳的 迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是 分子的大小、极性及介质粘度的函数 , 因此根据分子大小 的不同、构成或形状的差异 , 以及所带的净电荷的多少 , 便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分 彼此分离开来。
4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置 到胶凝。
5.拔出样梳后, 在槽中加入缓冲液 6.上样：（微量注射器） （1）marker 5µl （2）样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共20µl
7.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳。 8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色1小时左右。 9.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰。 10.实验结果分析
❖ 分类：自由电泳（无支持体）
区带电泳（有支持体）
Tise-leas式微量电泳、显微电 泳、等电聚焦电泳、等速电泳 及密度梯度电泳。
滤纸电泳（常压及高压）、薄 层电泳（薄膜及薄板）、醋酸 纤维薄膜电泳、非凝胶性支持 体区带电泳（支持体有：淀粉， 纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)、 凝胶支持体区带电泳（琼脂、 琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺 凝胶）等
❖ 凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在 采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克 隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子。
❖ 凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学。 ❖ 大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳（agarose
gel electrophoresis）分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝 胶电泳（PAGE）。 ❖ 蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰 胺凝胶中进行（SDS-PAGE），现以其为例进行实验说明。
按下式计算相对迁移率：
蛋白样品距加样端迁移距离 cm 相对迁移率 =
溴酚蓝区带中心距加样端距离 cm
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得 标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量， 这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测 定才具有可靠性。
聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽链分子量
聚丙烯酰胺凝胶电泳
❖ 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N， N-甲叉双丙烯酰胺(methylenebisacrylamide,简称Bis)在加速剂（四甲基乙二胺TEMED） 和催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下聚合并联成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳。
主要内容
1
凝胶电泳相关概念
2
凝胶电泳的原理
3
凝胶电泳的应用
4
聚丙烯酰胺凝胶电泳
1
凝胶电泳相关概念
❖ 凝胶：凝胶是胶体体系的一种存在形式，它是由胶体体系中分散相颗 粒相互联结，搭成具有三维结构的骨架后形成的，具有空间网状结构 体系，胶体体系中原有的分散介质（液体）充填在网状结构的空隙之 中。
❖ 电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为 电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达 到分离的技术称为电泳技术。
谢谢！
影响凝胶电泳的因素
影响电泳速度的因素：
❖ 样品本身：带电量，分子大小，形状 ❖ 电场强度：电压 ❖缓冲液：成分， pH ，离子强度 ❖ 支持介质：电渗作用，吸附作用 ❖ 温度
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置图
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳确定蛋白质分子量
操作过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净 的小烧杯 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好
配胶
分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml)
凝胶电泳原理图
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。
凝胶电泳装置图
垂直式电泳装置
水平泳速度的因素：
❖ 样品本身：带电量，分子大小，形状 ❖ 电场强度：电压 ❖缓冲液：成分， pH ，离子强度 ❖ 支持介质：电渗作用，吸附作用 ❖ 温度
凝胶电泳应用
ddH2O 30%Acr Buffer
10%SDS
4.05ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µl
6.8ml
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
100µl
10%Ap
50µl
100µl
TEMED
10µl
10µl
3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯 倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置至胶凝
凝胶电泳原理
❖ 当一种分子被放置在电场当中时 , 它们就会以一定的速度 移向适当的电极 , 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 , 叫做电泳的迁移率。
❖ 它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。 也就是说 ,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量 越多 ,其迁移的速度也就越快 , 反之则较慢。由于在电泳 中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质 , 如琼脂糖凝 胶和聚丙烯酰胺凝胶等 , 从而降低了对流运动 , 故电泳的 迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是 分子的大小、极性及介质粘度的函数 , 因此根据分子大小 的不同、构成或形状的差异 , 以及所带的净电荷的多少 , 便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分 彼此分离开来。
4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置 到胶凝。
5.拔出样梳后, 在槽中加入缓冲液 6.上样：（微量注射器） （1）marker 5µl （2）样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共20µl
7.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳。 8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色1小时左右。 9.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰。 10.实验结果分析
❖ 分类：自由电泳（无支持体）
区带电泳（有支持体）
Tise-leas式微量电泳、显微电 泳、等电聚焦电泳、等速电泳 及密度梯度电泳。
滤纸电泳（常压及高压）、薄 层电泳（薄膜及薄板）、醋酸 纤维薄膜电泳、非凝胶性支持 体区带电泳（支持体有：淀粉， 纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)、 凝胶支持体区带电泳（琼脂、 琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺 凝胶）等
❖ 凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在 采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克 隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子。
❖ 凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学。 ❖ 大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳（agarose
gel electrophoresis）分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝 胶电泳（PAGE）。 ❖ 蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰 胺凝胶中进行（SDS-PAGE），现以其为例进行实验说明。
按下式计算相对迁移率：
蛋白样品距加样端迁移距离 cm 相对迁移率 =
溴酚蓝区带中心距加样端距离 cm
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得 标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量， 这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测 定才具有可靠性。
聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽链分子量
聚丙烯酰胺凝胶电泳
❖ 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N， N-甲叉双丙烯酰胺(methylenebisacrylamide,简称Bis)在加速剂（四甲基乙二胺TEMED） 和催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下聚合并联成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳。
主要内容
1
凝胶电泳相关概念
2
凝胶电泳的原理
3
凝胶电泳的应用
4
聚丙烯酰胺凝胶电泳
1
凝胶电泳相关概念
❖ 凝胶：凝胶是胶体体系的一种存在形式，它是由胶体体系中分散相颗 粒相互联结，搭成具有三维结构的骨架后形成的，具有空间网状结构 体系，胶体体系中原有的分散介质（液体）充填在网状结构的空隙之 中。
❖ 电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为 电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达 到分离的技术称为电泳技术。
谢谢！
影响凝胶电泳的因素
影响电泳速度的因素：
❖ 样品本身：带电量，分子大小，形状 ❖ 电场强度：电压 ❖缓冲液：成分， pH ，离子强度 ❖ 支持介质：电渗作用，吸附作用 ❖ 温度