薄层等电聚焦电泳法检测动物源食品加热终点温度[1]
SDS_PAGE电泳法检测鱼肉热处理终点温度
国内外科研工作者根据肉类加热过程中颜 色、 肌浆蛋白和酶活性的变化开发出多种多样的 EPT 检测方法。 其中，蛋白凝聚法、酶活测定法、免 疫学检测方法等是 EPT 检测的经典方法，并被某 些国家和地区用作行业标准[3-9]。 颜色判别法、差示 扫 描 量 热 法 （DSC）与 红 外 色 谱 法 （NIR）等 方 法 也 取得了一定成果[2]。 酶联免疫法（ELISA）被认为是 最有发展前景的 EPT 检测方法，其受加工方式、贮 藏方式、添加剂的影响较小[10]。 以乳酸脱氢酶为指
2） 肉制品的个体差异也是 EPT 判定的难点 之一。 肉制品个体的特性受到很多内在和外在条 件的影响，例如种属、产地、年龄、饲养条件、加工 方式、添加剂、包装贮藏条件等。 Tatjana Savkovic 等的研究表明， 饲料中的添加剂可对 174 ℃烘烤 和 72 ℃蒸煮处理的鸡 肉 的 持 水 力 以 及 感 官 品 质 产生较大影响[4]。 其它种属、饲养条件和加工条件 对热处理肉制品的影响鲜有报道， 是动物源性食 品 EPT 研究的盲点，也是影响各种 EPT 检验方法 通用性的原因。 颜色判别法、蛋白凝聚法等经典方 法无法摆脱个体差异带来的影响，DSC 与 NIR 也 有局限性。 针对这一难题，设计了将鱼肉样品进行 同 EPT 重复加热，与加热 1 次的样品进行比对的 试验方法。 由于日本鲭和大马哈鱼同温度重复加 热条带不发生变化，因此在实际样品检测中，可将
等电聚焦电泳的两种方法
等电聚焦电泳的两种方法等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
实验动物 热原试验操作标准
实验动物热原试验操作标准
实验动物热原试验的操作标准主要包括以下步骤：
1. 试验用的注射器、针头及一切与供试液接触的器皿，洗净后应经250℃至少30分钟或180℃至少2小时干烤灭热原质。
2. 测温探头的精确度应为±℃。
每只家兔注射前、后应使用同一支测温探头。
实验室温度保持在15～25℃。
试验的全过程中室温变化不得大于3℃，并
应保持安静，避免强光照射和噪音干扰。
空气中氨含量应低于20ppm。
3. 试验前家兔应禁食2小时以上再开始测量正常体温，共测两次，间隔30～60分钟，两次温差大得大于℃，以此两次体温的平均值为该兔的正常
体温，同组兔间正常体温之差不得大于℃。
4. 测家兔正常体温后15分钟内，按规定剂量自耳边静脉缓缓注入预热至38℃的供试品，每隔30分钟测量体温1次，连测6次。
5. 若第6次较第5次升温超过℃并超过正常体温时，应连续测量，直至与
前一次相比升温不超过℃。
6. 结果判断：降温值≥℃需重试。
此外，如果遇到异常情况或发生严重错误时，需重新开始整个实验流程。
如果同一动物的重复测定值与预期值偏差超过±1℃，则需要重新实验。
在整
个过程中应遵守相应的安全准则，保证动物福利，遵守相应的法律法规和伦理准则。
以上信息仅供参考，具体操作标准可能因实验需求和实验室条件而有所不同，建议查阅相关文献资料或咨询专业人士获取更准确的信息。
实验室食品质量检测的方法
实验室食品质量检测的方法概述：食品质量检测是确保食品安全和合规性的重要环节。
实验室食品质量检测方法主要包括物理检测、化学分析和微生物检测。
下面将对这些方法进行详细介绍。
一、物理检测：1.外观检测：包括观察食品的颜色、气味、外形、质地等以判断食品的新鲜程度和品质。
2.纹理检测：通过仪器测试食品的硬度、脆度、粘性等物理性质，例如用质谱仪测试面包的膨胀性。
3.稳定性和耐热性检测：用来评估食品在贮存和加热过程中的性质，例如通过测定蛋白质的凝胶化温度来判断其耐热性。
4.水分含量测定：使用烘干法、卤素酸化法等方法来确定食品中的水分含量，以评估食品的质量和保质期。
二、化学分析：1.营养成分分析：包括测定食品中的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素等成分的含量，常用的方法有光谱法、显微镜法、高效液相色谱法等。
2.有害物质检测：包括重金属、农药残留、添加剂等的检测，常用的方法有原子吸收光谱法、气相色谱法、液相色谱法等。
3.品质指标分析：包括酸值、过氧化值、凡尔赛碱值等指标的测定，以评估油脂等食品的新鲜度和质量。
三、微生物检测：1.总菌落计数：通过培养基培养和菌落计数来确定食品中的总菌落数，常用的方法有平板计数法、滑板计数法等。
2.致病菌检测：主要包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等常见致病菌的检测，常用的方法有PCR法、荧光法、免疫法等。
3.真菌检测：主要包括霉菌、酵母菌等的检测，常用的方法有培养法、显微镜法等。
四、其他检测方法：1.放射性物质检测：主要针对辐射食品的检测，常用的方法有γ射线计数法、核素测定法等。
2.基因工程食品检测：针对转基因食品的检测，常用的方法有PCR法、芯片法、酶联免疫法等。
总结：实验室食品质量检测的方法包括物理检测、化学分析和微生物检测。
物理检测主要针对食品的外观、纹理、稳定性和水分含量等进行评估和测定。
化学分析主要用于测定食品的营养成分、有害物质和品质指标等。
微生物检测主要用于测定食品的菌落数、致病菌和真菌等微生物的存在与否。
食品重金属检测常用的4种方法
食品重金属检测常用的4种方法第一篇：食品重金属检测常用的4种方法上海千测认证网提供食品重金属检测常用的4种方法食品中重金属元素限量的检测方法有比色法、比浊法、色谱法、光谱法、电化学分析法、中子活化分析等。
有关国家标准均详细规定了食品中重金属元素的含量测定方法。
以下列出的是食品中的铅、镉、汞和砷的国家标准检测方法。
1.食品中铅的常用检测方法石墨炉原子吸收光谱法，它的原子化器为石墨炉原子化器，是将试样放置在石墨管壁、石墨平台、碳棒盛样小孔或石墨坩埚内用电加热至高温从而实现原子化，其检出限为Sug/kg。
火焰原子吸收光谱法，该法采用火焰原子化器，火焰原子化器由喷雾器、预混合室、燃烧器三部分组成，检出限为0.Img/kg。
单扫描极谱法，它是一种控制电位的极谱法，电极电位是时间的线性函数，因用示波器观察电流．电位曲线，故又称线性变位示波极谱法，该法检出限为0.085mg/kg。
二硫腙比色法，该法用二硫腙做显色剂，通过比较或测量溶液颜色深度来确定待测组分含量，检出限为0.25mg/kg。
氢化物原子荧光光谱法，原子荧光光谱法是介于原子发射光谱法和原子吸收光谱法之间的光谱分析技术，它的基本原理就是：基态原子（一般为蒸气状态）吸收合适的特定频率的辐射而被激发至高能态，而后，激发态原子在去激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光，因为氢化物可以在氩氢焰中得到很好的原子化，而氩氢焰本身又具有很高的荧光效率以及较低的背景，这些因素的结合使得采用简单的仪器装置即可得到很好的检出限，其检出限为Sug/kg。
2.食品中镉的常用检测方法石墨炉原子吸收光谱法，其检出限为O.lug/kg;火焰原子吸收光谱法，检出限为Sug/kg;比色法，检出限为50ug/kg;原子荧光法，检出限为1.2ug/kg。
3.食品中总汞的常用检测方法原子荧光光谱分析法，检出限为o．15ug/kg；二硫腙比色法，检出限为25ug/kg。
甲基汞的分析常常先用酸提取巯基棉吸附分离，然后用气相色谱法或冷原子吸收光谱法进行测定。
PCR技术在畜产品安全检测中的应用
PCR技术在畜产品安全检测中的应用马艳荣【期刊名称】《中国畜禽种业》【年(卷),期】2015(000)007【总页数】2页(P21-21,22)【作者】马艳荣【作者单位】新疆维吾尔自治区阿克苏地区动物疫病控制诊断中心 843000【正文语种】中文随着世界经济全球化、贸易自由化和农产品国际贸易的迅速发展，畜产品安全已成为事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题，及时、安全、准确地检测出农产品中的病原微生物是农产品安全检测的重要内容。
随着畜产品分析物质的不断微量和痕量化，畜产品基质的不断复杂化，仅使用传统分析技术已难以解决所有的问题。
加强畜禽肉和水产品的检验检疫，保证其食用安全，是预防食源性疾病暴发的重要途径。
PCR技术有快速、特异、敏感等特点，因而该技术在肉食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力。
部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。
大量研究表明，PCR技术在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度，而多数情况下则表现出更高的灵敏度，而且检测周期大为缩短。
建立荧光PCR方法、实时PCR方法、多重PCR等方法可简便、快速、灵敏地实现对肠出血性大肠杆菌，单增李氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的细菌学诊断快速、简便、经济，有较大的应用价值。
随着分子生物学技术的不断发展，多重PCR、标记PCR、不对称PCR等多种不同的PCR方法都被应用于畜产品检测中，它们的应用使PCR技术拥有了更高的灵敏度和更短的周期。
随着社会经济的快速发展，消费者对食品质量与安全性的要求也越来越高，席卷欧洲“马肉风波”、疯牛病、禽流感等疾病的出现以及宗教、经济健康原因和市场监管，都急需一种快速、准确的检测方法以对肉制品、宠物食品和肉骨粉等所含肉的成分进行种属鉴定。
当前，对研究者、消费者、食品工业和政策制定者等各个方面来说，食品的真伪都是一个热点问题，尤其是肉类工业。
PCR技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点，在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值。
等电聚焦实验报告
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
《中国药典》2020版—等电聚焦电泳法国家药品标准公示稿
0541电泳法第六法等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法适用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂(1)水(电阻率不低于18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶液 4ml，加水至 20ml。
加 0.1%甲基红溶液20μl。
(5)pI 标准商品化试剂，所选用的pI 标准的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
(6)固定液称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g, 加水溶解并稀释至300ml。
(7)脱色液(平衡液) 取 95%乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至2000ml。
(8)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300ml，在60〜70℃水浴中加热，使溶解。
(9)保存液取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(10)正极液(0.01mol/L 磷酸溶液) 取磷酸1ml，加水至1800ml。
(11)负极液(0.01mol/L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。
3.测定法(1)制胶装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入 60% 甘油 1ml。
取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4.0ml、两性电解质(pH3〜10)溶液( 或其他两性电解质 )1.0ml, 混匀，脱气，再加 B 液 72 μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。
等点聚焦电泳
等点聚焦电泳等点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）是一种基于蛋白质等电点差异的分离技术。
它能够将样品中的蛋白质按照等电点的大小进行分离，从而实现蛋白质的高分辨率分离。
本文将介绍等点聚焦电泳的原理、操作步骤及其在生物学研究中的应用。
一、原理等点聚焦电泳是基于蛋白质在带电条件下在电场中的迁移速率与其等电点相关的原理。
蛋白质在特定pH值下，带有正、负电荷，而其等电点则是蛋白质在该pH值下带电量为零的点。
在等点聚焦电泳中，样品被置于pH梯度胶体中，然后通过电场作用，蛋白质会向其等电点迁移，直到在等电点处停止迁移。
二、操作步骤1. 准备样品：将待分离的蛋白质样品进行预处理，如去除杂质、浓缩等。
2. 准备等电聚焦胶：在胶板上形成pH梯度，通常使用聚丙烯酰胺胶。
可以通过添加缓冲剂或聚电解质来形成pH梯度。
3. 样品加载：将预处理的样品加载到胶上特定位置。
4. 等电聚焦：通过施加电场，使蛋白质在pH梯度中迁移，直到达到其等电点处停止迁移。
5. 胶固定：固化胶，使蛋白质分布固定在胶中。
6. 显色与成像：使用染色剂对蛋白质进行染色，然后使用成像设备进行成像分析。
三、应用领域等点聚焦电泳在生物学研究中具有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：1. 蛋白质分析：等点聚焦电泳能够实现对复杂蛋白质混合物的高分辨率分离，为后续的质谱分析、蛋白质鉴定等提供了重要的前处理步骤。
2. 蛋白质组学研究：通过等点聚焦电泳可以对不同细胞、组织或生理状态下的蛋白质进行分离，从而揭示蛋白质组的差异，进一步研究蛋白质功能和调控机制。
3. 生物医学研究：等点聚焦电泳可以用于检测蛋白质的变异或突变，从而为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
4. 药物研发：等点聚焦电泳可以用于筛选药物靶点、评估药物对蛋白质的作用，为药物研发提供重要的分析手段。
5. 环境监测：等点聚焦电泳可以用于分析环境中的污染物对生物体内蛋白质的影响，从而评估环境污染的程度和影响。
种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分
164㊀2021Vol.47No.3(Total 423)DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.024477引用格式:张媛媛,孟镇,仇凯,等.种属特异性PCR 法鉴别罐头食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭源性成分[J].食品与发酵工业,2021,47(3):164-169.ZHANG Yuanyuan,MENG Zhen,QIU Kai,et al.Species-specific PCR method to identify animal-derived in-gredients of pork,beef,mutton,chicken and duck in canned food [J].Food and Fermentation Industries,2021,47(3):164-169.种属特异性PCR 法鉴别罐头食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭源性成分张媛媛1,2,孟镇1,2∗,仇凯1,2∗,东思源1,2,武竹英1,2,郭新光1,2,钟其顶1,21(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)2(全国食品发酵标准化中心,北京,100015)摘㊀要㊀建立适用于肉类罐头等长时间高温加工食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源成分种属特异性PCR 鉴别方法㊂通过使用猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭的种属特异性引物,对5种动物的总DNA 模板进行PCR 扩增,得到分别为212㊁147㊁202㊁131㊁201bp 的扩增产物,将测序结果在美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotech-nology Information ,NCBI )进行BLAST 比对确认实验的准确性,并对市售罐头样品进行检测㊂该方法5种动物引物种属特异性良好,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%㊂在对市售肉类罐头样品的检测中,6.6%样品与标签标注结果不符㊂该方法操作简便,成本低,结果准确可靠,可广泛用于肉类罐头食品和长时间高温加工食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源成分的鉴别,具有十分广泛的实际应用价值㊂关键词㊀肉类罐头;肉类掺假;线粒体;动物源性成分;食品真实性;种属特异性PCR第一作者:硕士研究生(孟镇高级工程师和仇凯高级工程师为共同通讯作者,E-mail:syaufood@;ufoqk@)㊀㊀基金项目:国家重点研发计划(2019YFC1605202,2018YFC1603203)收稿日期:2020-05-18,改回日期:2020-08-06㊀㊀随着食品供应链的全球化和复杂化,市场竞争日益激烈,食品欺诈问题日渐突出,其中肉制品掺假现象层出不穷㊂一些不法商贩在利益驱使下,为了获得不法利润,利用掺假等恶劣手段,将低价格肉类掺杂到高价肉中,以假乱真㊁以次充好扰乱市场秩序,侵犯消费者权益,甚至涉及到宗教信仰问题㊂这些现象在国内外常有发生[1-6]㊂肉类罐头食品因其品种繁多㊁口味较好㊁便携㊁储存时间长等特点而深受广大消费者的喜爱,但由于经过了斩拌㊁调味㊁高温加工等处理[7-9],普通消费者难以通过感官分辨掺假肉,执法部门在取证过程中同样缺乏简便有效的鉴别手段㊂目前我国对于生鲜肉类食品及一般热加工肉类食品的检测方法及标准趋于完善,但对于罐头食品这种深度热加工食品的动物源成分鉴别研究很少,因此建立一种快速㊁准确鉴定肉类罐头食品中动物源性成分的方法非常有必要[10-11]㊂目前,常见的肉制品掺假鉴别方法主要有蛋白质鉴别酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)㊁等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)㊁高效液相色谱(HPLC)和核酸检测法[12-17]㊂不同物种间核酸极强的特异性,使得核酸检测方法具有特异性强㊁灵敏度高㊁结果准确的特点㊂种属特异性PCR 技术则是应用核酸在不同物种间具有极强的特异性这一特点,根据扩增的目的基因设计高特异性引物,扩增出物种特有的目的片段,此技术被广泛地应用于生鲜肉及加工肉制品[18-21]的动物源性成分掺假的鉴别㊂本研究在国内首次以肉类罐头食品为研究对象,建立了适用于长时间高温加工食品中主要的5种动物源成分鉴别方法㊂针对肉类罐头食品经过长时间高温加工导致DNA 片段化严重的实际情况,从线粒体DNA 入手,根据不同物种之间线粒体DNA 的差异,从数据库中筛选出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种常用肉类的特异性扩增引物,建立一种快速㊁准确的鉴别肉类罐头及其他经过长时间高温处理的食品中动物源成分的方法,并对我国市售肉类罐头产品进行了检测,初步调查了我国肉类罐头产品的动物源真实性情况,为其在动物源性食品真实性鉴别的标准化中的应用奠定了坚实的基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀实验材料新鲜猪肉㊁牛肉㊁羊肉㊁鸡肉㊁鸭肉,北京市超市和农贸市场;20个不同种类㊁不同加工工艺和不同源性成分的罐头样品,市售样品㊂1.2㊀试剂dNTP㊁10ˑPCR缓冲液㊁Taq DNA聚合酶㊁100 bp ladder DNA marker等,北京全式金生物技术有限公司;异硫氰酸胍法裂解液[5mol/L GuSCN㊁0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)㊁体积分数1.3%Triton-X 100,0.02mol/L EDTA(pH8.0)]㊁V(氯仿)ʒV(异戊醇)=24ʒ1㊁TE缓冲液(0.01mol/L Tris㊁0.001mol/L EDTA,pH8.0)㊁异丙醇㊁无水乙醇,上海生物工程有限公司㊂1.3㊀主要仪器冷冻离心机,美国Sigma公司;Tgradient PCR扩增仪,德国Biometra公司;DYY-8C型高压电泳仪,北京六一仪器厂;CV-1000型凝胶成像系统,法国VIBER LOURMAT公司;pHSJ-4A型实验pH计,上海科学仪器有限公司;TMS1500恒温混匀仪,北京莱普特科学仪器有限公司㊂1.4㊀实验方法1.4.1㊀引物根据文献筛选猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭线粒体DNA种属特异性引物,交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,各引物终浓度均为10mol/L,引物序列见表1㊂表1㊀种属特异性引物Table1㊀Species-specific primers物种引物序列(5ᶄ-3ᶄ)片段大小/bp退火温度/ħ参考文献猪F:GCCTAAATCTCCCCTCAATGCTA21256[22]R:ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG牛F:CACAATCCAGAACTGACAC14756[23]R:GATGGCTTGGGAATAGTACGA羊F:CCTCCAACAGTGAATACTT20256[23]R:TCCTCCTCATAAAGGAATGGCC鸡F:CTATAATCGATAATCCACGATTCA13163[24]R:CTTGACCTGTCTTATTAGCGAGG鸭F:CATCTATCCTGCTAGCCGCC20158[25]R:TTGAGTGGAAGAATGCC1.4.2㊀高温加工肉类模拟样品的制备为确保检测方法对深加工食品检测的可行性,将鲜猪肉㊁鲜牛肉㊁鲜羊肉㊁鲜鸡肉㊁鲜鸭肉分别在灭菌锅中121ħ高温处理30min,模拟肉类高温加工过程㊂1.4.3㊀DNA模板的提取根据前期实验室对于肉类罐头食品中总DNA提取方法的研究,DNA模板选用异硫氰酸胍法进行提取[26]㊂1.4.4㊀PCR扩增PCR反应采用25μL体系:10ˑPCR buffer2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,20pmol/μL引物各1μL,模板DNA1μL,Taq DNA聚合酶0.3μL (1.5U),MgSO4(50mmol/L)1μL,双蒸水补足体积㊂扩增条件为:94ħ3min,94ħ30s,57ħ30s, 72ħ30s,35个循环,72ħ5min㊂扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测㊂1.4.5㊀引物特异性试验分别以高温加工的猪肉㊁牛肉㊁羊肉㊁鸡肉㊁鸭肉5种高温加工肉类样品总DNA为扩增模板,使用种属特异性引物对上述各种DNA进行PCR扩增反应,同时设立以H2O为模板的空白对照,评价方法的特异性㊂1.4.6㊀灵敏性试验为了验证该方法的灵敏性,分别将高温加工的各种动物样品用高温加工的鸡肉进行混合稀释,分别制备出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭肉成分占5%㊁2.5%㊁1%(质量分数)的样品㊂将上述样品充分混匀,提取DNA,进行动物源性成分灵敏性检测㊂1.4.7㊀市售罐头样品检测将20个市售肉类罐头样品进行PCR扩增,扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,并将检测合格的PCR纯化产物送往上海生工生物科技有限公司进行测序,然后通过Chromas软件对其峰值图进行查看㊂1.4.8㊀数据处理运用美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information,NCBI)的BLAST 程序,把样品的PCR产物测序结果与GenBank数据库中所收录的基因片段进行比对,从而保证PCR扩增的正确性㊂2㊀结果与分析2.1㊀特异性试验结果分别使用5种动物源性成分特异性引物对,以制备的猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种高温加工肉类样品总DNA 为模板,进行PCR扩增反应,琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示㊂5种动物源性成分猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭出现相符的目标条带,而其他动物基因组DNA及空白对照均无条带出现,也无非特异性条带,说明此方法具有较好的特异性㊂2.2㊀引物灵敏性试验结果分别以猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭肉占比为5%㊁2.5%㊁1%的样品提取的总DNA为扩增模板,使用种属特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示㊂不同成分含量为1%的样品对应泳道仍有明显条带,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达2021年第47卷第3期(总第423期)165㊀166㊀2021Vol.47No.3(Total 423)1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%㊂说明5种动物源性成分检测灵敏度可达到1%㊂在实际市场中,1%廉价肉的掺杂对于商贩来说毫无利润,因此检测限足够低,完全满足检测要求㊂a-猪引物的特异性;b-牛引物的特异性;c-羊引物的特异性;d-鸡引物的特异性;e-鸭引物的特异性M-marker;1-猪肉(121ħ30min);2-牛肉(121ħ30min);3-羊肉(121ħ30min);4-鸡肉(121ħ30min);5-鸭肉(121ħ30min);6-空白对照图1㊀特异性试验琼脂糖凝胶电泳图Fig.1㊀Specific electrophoresis agarose gel electrophoresisa-猪源性成分;b-牛源性成分;c-羊源性成分;d-鸡源性成分;e-鸭源性成分M-marker;1-5%肉模拟罐头;2-2.5%肉模拟罐头;3-1%肉模拟罐头;4-空白对照(双蒸水)图2㊀灵敏性试验琼脂糖凝胶电泳图Fig.2㊀Agar gel electrophoresis of sensitivity test2021年第47卷第3期(总第423期)167㊀2.3㊀市售罐头样品检测结果以市售的罐头试样为检测对象,使用种属特异性引物对其DNA 模板进行PCR 扩增,PCR 扩增结果如图3所示㊂所有样品均扩增出特异性条带,且条带清晰整齐,亮度较大,空白对照为阴性㊂将上述PCR 产物进行测序,测序结果在NCBI 上进行BLAST 比对,比对结果见表2㊂通过对20个市售肉类罐头样品进行检测,发现除15#和16#猪肝午餐肉罐头和午餐肉罐头外,所有样品检测结果均与标签标注相一致,6.6%的样品标签标注成分与检测结果不符㊂15#和16#除检测出标签标注成分外,还检测出鸡源性成分,使用其他方法对其进行检测,均检测出鸡源性成分,考虑可能是由于生产过程中的污染或食品中添加鸡精等导致㊂本方法适用于肉类罐头中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源性成分的检测,且结果准确可靠,具有实际应用价值㊂a-猪源性成分的检测;b-牛源性成分的检测;c-羊源性成分的检测;d-鸡源性成分的检测e-鸭源性成分的检测M-marker;1-阳性对照;2-空白对照;3-红烧猪肉罐头;4-清蒸猪肉罐头;5-午餐肉罐头(清淡味);6-干崩羊肉罐头;7-咸牛肉罐头;8-五香肉丁罐头;9-火腿猪肉罐头;10-午餐肉;11-午餐肉罐头;12-回锅肉罐头;13-红烧猪肉罐头;14-火锅午餐肉罐头;15-普云午;16-高金午餐肉;17-猪肝午餐肉罐头;18-午餐肉罐头;19-精品红烧猪肉罐头;20-粉蒸肉罐头;21-火腿午餐肉罐头;22-云腿大片罐头图3㊀市售肉类罐头样品琼脂糖凝胶电泳图Fig.3㊀Agarose gel electrophoresis of canned meat samples表2㊀肉类罐头样品中动物源性成分检测结果Table 2㊀Test results of animal derived components in canned meat samples编号商品名称相似序列相似度/%鉴别结果标称原料检测结果1红烧猪肉罐头KJ746663.183Sus scrofa 猪猪2清蒸猪肉罐头KY964306.185Sus scrofa 猪猪3午餐肉罐头(清淡味)KJ746663.179Sus scrofa猪猪4干崩羊肉罐头LS992617.189Capra aegagrus 山羊肉山羊5咸牛肉罐头MK058749.1MK028749.18996Bos taurus Gallus牛肉㊁鸡骨泥牛㊁鸡168㊀2021Vol.47No.3(Total 423)续表2编号商品名称相似序列相似度/%鉴别结果标称原料检测结果6五香肉丁罐头KY964306.193Sus scrofa 猪猪7火腿猪肉罐头MF183224.181Sus scrofa 猪猪8午餐肉MF183224.180Sus scrofa 猪猪9午餐肉罐头KY964306.181Sus scrofa 猪猪10回锅肉罐头MF183224.191Sus scrofa 猪猪11红烧猪肉KY964306.187Susscrofa猪猪12火锅午餐肉罐头KJ746663.1MH879470.18698Sus scrofa Gallus 猪㊁鸡猪㊁鸡13午餐肉罐头MF183224.180Sus scrofa 猪猪14高金午餐肉KF971862.1MH879470.18999Sus scrofa Gallus 猪㊁鸡猪㊁鸡15猪肝午餐肉罐头KF971862.1MH879470.18999Sus scrofa Gallus 猪猪㊁鸡16午餐肉罐头KJ746663.1MH879470.19098Sus scrofa Gallus 猪猪㊁鸡17精品红烧猪肉罐头KJ746663.192Sus scrofa 猪猪18粉蒸肉罐头KJ746663.195Sus scrofa 猪猪19火腿午餐肉罐头KJ746663.187Sus scrofa 猪猪20云腿大片罐头KJ746663.192Susscrofa猪猪3㊀结论本研究根据不同物种之间线粒体DNA 的差异,从数据库中筛选出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种常用肉类的特异性扩增引物,建立了种属特异性PCR 鉴别肉类罐头中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭成分的方法㊂结果表明,该方法使用的5种引物种属特异性良好,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%,完全满足实际市场掺入量1%的要求,并成功应用于市售肉类罐头样品的掺假检测㊂该方法操作简便,检测成本低,结果准确可靠,具有实际应用价值,适用于高温高压加工的肉类罐头样品的掺假鉴别,可以作为肉类罐头市场监督和检验鉴别的可行性办法,为实现深加工肉类产品消费市场健康发展,维护消费者权益提供了科学的依据㊂参考文献[1]㊀BALLIN N Z,VOGENSEN F K,KARLSSON A H.Species determi-nation-can we detect and quantify meat adulteration?[J].Meat Sci-ence,2009,83(2):165-174.[2]㊀WANG R F,MYERS M J,CAMPBELL W,et 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Moreover,the sequencing results were verified by using the BLAST comparison on NCBI to confirm the accuracy of the experiment,and the commercially available canned samples were also been tested.In this method,the five animal introduced species have good specifici-ty,the detection sensitivity for derived components of pork,beef,mutton and duck could reach1%,and the detection sensitivity for chicken-derived components was2.5%.After testing the commercially available samples,it was clear that in6.6%of the samples,the actual composition did not match the label.This method was easy to operate,low in cost,accurate,reliable,which could be widely used in the identification of five animal-derived components of pigs,cattle,sheep,chickens and ducks in canned meat and long-term high-tem-perature processed foods.Above all,it had extensive value in applications.Key words㊀canned meat;adulterated meat;mitochondria;animal-derived ingredient;food authenticity;species-specific PCR2021年第47卷第3期(总第423期)169㊀。
基于超薄等电聚焦电泳技术的大白菜品种鉴定
基于超薄等电聚焦电泳技术的大白菜品种鉴定摘要：利用超薄等电聚焦电泳技术对8个不同的大白菜品种种子蛋白质进行分析。
结果表明，大白菜种子盐溶蛋白具有较高的多态性，在所测试的8个品种中共发现9条蛋白质多态性条带，依这9条蛋白质多态性条带可将8个品种区别开来，与大田种植鉴定结果一致。
因此，种子蛋白质超薄等电聚焦电泳技术可应用于大白菜品种鉴定。
关键词：大白菜；盐溶蛋白；超薄等电聚焦电泳；品种鉴定大白菜（BraicacampetriL.p.pekineni）适应范围广，栽培面积大，是我国第一大蔬菜作物[1]。
品种改良是实现生产可持续发展的关键因素，随着生产力的发展和人民生活水平的不断提高，大白菜育种日益受到国内外学者的重视。
为了在较短时间内培育出高产稳产品系，部分品种采用了共同的亲本或自交系，客观上缩小了品种间的遗传差异性。
近年来，大白菜品种日渐增多，同时，在生产上假冒伪劣种子事件时常发生。
因此，鉴定品种真实性对大白菜新品种登记和品种知识产权保护等显得极为重要。
目前，大白菜品种鉴定以大田种植鉴定为主[2]。
尽管大田种植鉴定的结果最准确，但其所需时间比较长（通常需要一个生长季节），且要消耗大量的人力和物力，而且很多性状受栽培措施及环境因素的影响[3]。
为此，迫切需要一种准确、快速的大白菜品种鉴定方法。
电泳技术在种子真实性检测中被广泛应用，根据电泳对象的不同可分为同功酶电泳和蛋白质电泳。
同功酶电泳技术曾被应用于大白菜品种鉴定[4～7]。
利用同工酶鉴别品种及种子纯度存在的问题是：同工酶存在时期特异性和器官特异性，多数作物种子需发芽，由于种子发芽速度不同造成个体间差异，容易引起误差，并且同工酶的提取、电泳等多数需要在低温下进行，增加了电泳操作和电泳技术推广的难度。
由于同工酶分析存在上述不利因素，在应用中受到限制[7]。
普通聚丙烯酰胺凝胶电泳也应用于品种鉴定，结果表明蛋白质多样性位点的变化不足以区分所有的品种[5，8]。
通过单克隆抗体技术处理加热过的肌肉蛋白质来识别肉的种类以及加热肉品终点温度的确定
68.3℃。别的制品 PH 值 为7 ，加热温度 为71.7℃。鲜猪肉加热时内部温度应达到 76.7℃，而且杀死旋毛虫温度应至 少 比 此温 度再高17℃。然而，一旦肉品中搀 杂了别的不知名肉类，由 于 不 知名肉类 的存在对于特定种类的最低内部加热温 度也就失效了。 为了阻止肉类的搀杂和减少由于 不足 够加热过程引起的食物传染疾 病 的 危害， 对于管 理 监 督 部 门来讲,采用 可 靠分 析方法来执行肉类管理程序是十分必要 的。
在本章中也对这种领域内的现行方法进行了大概的评价2搀杂肉品种类的确认21非免疫学方法在过去的二十年中许多用于确认肉品种类的非免疫方法例如电泳和色谱层析已经有了很大的发展对于蛋白质的分离电泳技术是十分有效的不同的肌肉蛋白质的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳sdspage经常产生相同的蛋白类型以在肉种类确认方面它的可信度十分的小
• 基因组DNA水平上 的相互交叉反应。通
过混合未标记DNA修饰DNA 杂交可以减 少交叉反应， 从而可以从交叉杂交种类 中区分绵羊和山羊，大约有 10﹪的区 别 限度。绵羊和山羊 肉类的区分是使用直 接连续技术来对比 核苷酸的次序而实现 的， 同时也分析了限制核苷酸内切酶聚 合酶链反应的产物， 由于费用高和操作 的复杂性，这些基于DNA 水平的技术未 被常规分析方法所采纳。
• 肉的种类进行免疫分析时，应保证连续
供应统一的免疫试剂，也应减少标准分 析程序。
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2.4 抗原的选择
•
大多数对于原料肉种类的免疫检测方 法都采用多克隆方法来处理整个血 清或 血清蛋白。因为血清蛋白的存在可能是 必须的，肌肉组织中残余的血浆成分会 发生变化，那么便意味着肌肉组织的存 在，进而可以得出结论：用这些多克隆 技术来定量的估计搀杂物的量是不可靠 的。肌肉蛋白质的存在是显著的,预示了 鸡肉
近红外光谱法检测鸡、鱼肉加热终点温度
近红外光谱法检测鸡、鱼肉加热终点温度刘功明;孙京新;李鹏;徐幸莲;张万刚;黄明;周光宏【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2016(049)001【摘要】[目的]在肉制品生产中,加热终点温度(endpoint temperature,EPT)是控制食源性疾病的关键因素.现有的EPT检测方法诸多,如酶活性测定法,凝血试验和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)法等,但普遍存在耗时、样品处理繁杂等不足.采用近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIR)结合偏最小二乘法(partial least squares,PLS)检测鸡、鱼肉加热终点温度,为研究近红外光谱法检测肉类EPT 的可行性提供参考.[方法]分别将肉样以1℃·min-1的升温速率进行9个不同温度的加热处理(50、55、60、65、70、75、80、85和90℃),当达到终点温度时,迅速取出,冰水冷却到4℃.冷却后的肉样和释放的肉汁同时放到均质机中,均质1 min,绞碎成肉糜状.均质后的肉样存放于4℃的冰箱中,共制得144个样品(鸡、鱼肉样品数分别为77和67).在近红外光谱仪上,采用硫化铅(PbS)检测器和旋转样品池,每个样品连续采集光谱3次,在11 000-4 000 cm-1波数范围内,以8 cm-1的分辨率扫描64次.将所采集的鸡、鱼肉的光谱数据分别随机分为校正集(样品总数108,其中鸡肉样58,鱼肉样50)和检验集(样品总数36,其中鸡肉样19,鱼肉样1 7),校正集用于校正模型的建立,检验集用于检验模型的预测能力.在建立模型时,采用标准正则变换、一阶微分和Norris Derivative 滤波平滑(N-D)3种方法结合对原始光谱进行处理,采用内部交叉验证均方差(cross-validation mean square error,RMSECV)确定主成分数,利用模型对检验集样品的预测均方差(prediction mean square error,RMSEP)、预测值与实测值间的相关系数r及预测标准差σ考察模型的预测性能.[结果]采用校正集的内部交叉验证均方差(RMSECV)确定鸡肉、鱼肉的主成分数分别为9和11,此时校正集的RMSECV值最小,分别为1.59％和0.96％;所得校正模型的预测温度与实际加热温度之间的相关系数分别为0.9844和0.9936;由所建模型对检验集样品的检验结果可看出,实际加热温度与近红外模型预测的加热温度具有很高的相关性,预测值的相关系数r分别为0.9966和0.9832;预测均方差RMSEP分别为3.02％和2.94％;预测标准差σ为0.97和1.63.[结论]本研究所建模型具有很好的预测性能,近红外光谱用于肉制品EPT检测具有很大潜力.【总页数】8页(P155-162)【作者】刘功明;孙京新;李鹏;徐幸莲;张万刚;黄明;周光宏【作者单位】青岛农业大学食品科学与工程学院/山东省肉类食品质量控制工程技术研究中心,山东青岛266109;青岛农业大学食品科学与工程学院/山东省肉类食品质量控制工程技术研究中心,山东青岛266109;青岛农业大学食品科学与工程学院/山东省肉类食品质量控制工程技术研究中心,山东青岛266109;南京农业大学食品科技学院/农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室,南京210095;南京农业大学食品科技学院/农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室,南京210095;南京农业大学食品科技学院/农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室,南京210095;南京农业大学食品科技学院/农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室,南京210095【正文语种】中文【相关文献】1.肉类加热终点温度检测方法的研究进展 [J], 贺艳;郑文杰;刘煊;赵卫东2.猪、牛肉加热终点温度检测方法的研究 [J], 刘伟;贾晓川;赵良娟;贺艳;张宏伟;郑文杰3.猪牛肉加热终点温度酶联免疫检测方法的建立 [J], 贺艳;郑文杰;邓为民;何晨光;刘烜;赵卫东4.差示扫描量热法检测猪、牛、羊肉加热终点温度 [J], 刘功明;孙京新;徐幸莲;黄明;李鹏5.肉类及肉制品加热终点温度检测方法的研究 [J], 贺艳;郑文杰;刘烜;赵卫东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。
等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。
本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。
经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。
关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。
它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。
[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。
[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。
[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。
现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。
我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。
目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。
[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。
凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。
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由图 1 可知，去 皮鸡肉各 样 品 EPT 分 别 在 65、67、69、71、73、75℃。可以看到电泳条带 的浓度随温度梯度是渐变性减少，并没有明显 分界点。这可能与可溶性蛋白的降解和变性造 成的等电点迁移有关。其中 pI 6.05 处的条带随 温度梯度变化的浓度渐变性最为明显，可成为 较 理 想 的 检 测 参 考 条 带 。 pI 6.05 处 的 条 带 在 EPT 达到 71 ℃时基本淡到难以识别 ，EPT 达到 75 ℃时基本消失。美国 农 业 部 食 品 安 全 检 验 署 (USDA-FSIS)于 1998年文件要求肉类食品热加工 的终点温度(EPT)必须达到 71 ℃。而日本欧盟等 国家则明确要求肉类食品热加工终点温度为 70～ 75 ℃ 1 min(K.Thyholt,1998)[1]。参考以上文件并 联系实验结果可将 71 ～75 ℃ 作为 鸡肉热变性 完 全的 EPT 范围。 2．2 同一温度下重复加热后 蛋白热变性 的薄层等 电聚焦电泳结果
2 实验结果
2．1 鸡肉连续温度梯度薄层等电聚焦电泳结果
M12 3 4 5 6 M
pI 8.15— pI 7.35— pI 6.55— pI 5.85—
pI 5.20— pI 4.55— pI 3.50—
注：1：65 ℃水浴加热；2：67 ℃水浴加热；3：69 ℃水浴加热；4： 71 ℃水浴加热；5：73 ℃水浴加热；6：75 ℃水浴加热；M：标准蛋白分 子量。
MAO Mao1, GAO Hong-wei2, LIANG Cheng-zhu1,2*, WANG Dong-feng1
(1.College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003; 2. Shandong Technical Center for Inspection and Quarantine, Qingdao 266002)
收稿日期： 2008-05-27
* 通讯作者
基金项目： 国家质检总局科研项目(2006IK012)。
作者简介： 毛毛(1982—)，女，山东烟台人，硕士研究生，研究方向为食品安全与食品功能。
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染色液与固色液(SeePico CBB Stain Kit)：韩 国；蛋白标准等电点 [Isoelectric Focusing Calibra tion Kit Broad pI(pH3~10)]，Amersham，UK，TrisHCl(0.04 mol/L，pH6.8)；预制胶(GE Healthcare Phast－ Gel, Uppsala)：瑞士；三氯醋酸；乙酸；甲醇。 1．3 实验方法 1．3．1 连续温度梯度的样品 称取去皮肌肉组织， 切成 2 cm×2 cm×2 cm，质量约 8 g 的肉块，分别 置于 50 mL 离心管中，在与目的 EPT 相同温度的 恒温水浴中加热，每样品几何中心插入温度探测 器，显示样品中心温度达到目的温度(EPT)时开始 计时，满 1 min 后停止加热，4 ℃冷却过夜。每管 加入 4 ℃预冷的 0.04 mol/L Tris-Hcl(pH6.8)缓冲液 20 mL，匀浆 10 s，直至成均匀浆状，取 1 mL 处 理好的 样品 ， 8000 r/min 离 心 20 min， 吸 取 100 μL 离心后的上清液，即为供试样品。使用预制胶 电泳，每孔点 1 μL 蛋白样品或 Marker，将梳子置 于胶上开始电泳。电泳至 410 Vm Ah 停止电泳将 胶取出。电泳结束后立即将胶片置于培养皿中， 加入 12%三氯醋酸，震荡 30 min 后将三氯醋酸倒 掉并将胶片用蒸馏水冲净。加入刚好将胶片淹没 的量的固色液，摇床震荡 30 min 后再加入与固色 液等量的染色液(注意固色液不要倒掉)。摇床震动 1 h 后倒掉染色液和固色液，加入脱色液，摇床震 荡 20 min 后倒掉脱色液。 1．3．2 同一温度下重复加热后蛋白热变性的特性
[6] Bovell -Benjamin A C. Sweet potato:a review of its past, present, and future role in human nutrition[J]. Advances in Food and Nutrition Research,2007,52:1-59
2009 年 第 34 卷 第 1 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
食品安全与检测
薄层等电聚焦电泳法检测动物源 食品加热终点温度
毛 毛 1， 高宏伟 2， 梁成珠 1,2*， 汪东风 1 (1.中国海洋大学食品学院，青岛 266003；2.山东出入境检验检疫局，青岛 266002)
[7] McClelland J W, Allen J C, Zakir S. Bio-medicinal effect of sweet potato in people with diabetes [ J ] . Journal of the American Dietetic Association,2007,107:104
to genotypes with varying flesh colours[J]. Food Chemistry, 2007,103:829-838 [5] Siebert B D, Kruk Z A. β-Carotene and oxidative desatu－ ration of fatty acids: a plausible explanation of the conflict－ ing responses of coronary heart disease to β-carotene?[J]. Medical Hypotheses,2004,62:950-953
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食品安全与检测
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
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has not changed. In this study, a detection method of the thermal denatured protein in meat was developed by repeating heat in the same temperature and doing TLC isoelectric electrophoresis.
聚焦电泳图谱没有变化。确立以同一温度下肉类重复加热后进行薄层等电聚焦电泳来检测肉类是
否热变性的方法。
关键词： 薄层等电聚焦电泳；热变性蛋白；鸡肉；检测；加热终点温度
中图分类号： TS 251.7 文献标志码： A
文章编号： 1005-9989(2009)01-0239-04
Detection heating endpoint temperature of animal derived food by TLC isoelectric electrophoresis
国内外科研工作者根据肉类加热过程中颜色、 肌纤维和酶活性的变化开发出了多种多样的检测 方法。其中包括颜色判断法、红外反射光谱检测 方法，蛋白凝聚法，酶活测定法，免疫学检测方 法等[2-6]。但是由于无法摆脱种属、部位、加工方 式等客观因素，在实际应用中，还没有一种通用 性比较好的检测方法。
针对这种情况，本研究巧妙设计利用样品 “自己与自己比”，从而排除了样品个体差异对检
取去皮肌肉组织，切成 2 cm×2 cm×2 cm，质 量约 8 g 的肉块两份，分别置于 50 mL 离心管中， 在与目的 EPT 相同温度的恒温水浴中加热，样品 几何中心放置温度探测器，待样品中心温度达到 相应温度时开始计时，满 1 min 后停止加热，同时 取出两份肉样，置-20 ℃冷冻保藏。24 h 后，取出 其中一份重新加热，待样品中心温度达到相应温 度时开始计时，满 1min 后停止加热。加热一次的 样品为 H1，加热两次的样品为 H2。将两样品各 加入 4 ℃预冷的 0.04mol/L Tris-Hcl(pH6.8)缓冲液 20 mL。匀浆 10 s，8000 r/min 离心 20 min。各取 100 μL 上清液放入 4 ℃等待上样。电泳与染色过 程同 2.1.1。
Abstract: Both the temperature range of heated thermal denatured proteins on chicken and the TLC isoelectric
feature of repeated heating thermal denatured proteins in the same temperature were studied by the TLC isoelectric electrophoresis method. The results showed that temperature ranges of denatured proteins were from 71 ℃ to 75 ℃, and the differences in temperature ranges were gradually changed and influenced by processing methods. The TLC isoelectric patterns of thermal denatured proteins repeated heating in the same temperature
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