一氧化氮参与水稻低磷低氮调控的根系生长的机制研究

一氧化氮参与水稻低磷低氮调控的根系生
长的机制研究
摘要：植物根系对养分缺乏的反应的机制研究是发展可持续农业的关键。

一氧化氮被认为是调节根部生长的关键性因子，但在氮磷胁迫条件下一氧化氮调控水稻根系生长发育的生理作用及分子机制并不清楚。

本实验通过研究在低氮低磷条件下水稻根部表型以及细胞遗传分析探讨一氧化氮在低氮、低磷条件下调节根系生长的作用，表明低氮和低磷条件下水稻根尖一氧化氮水平显著提高。

进一步研究表明L-精氨酸途径参与到低氮和低磷诱导一氧化氮的增加，而NR 途径只参与低氮诱导一氧化氮的增加，且一氧化氮参与到低氮、低磷诱导水稻根系伸长的过程。

30121
毕业论文关键词：氮；一氧化氮；磷酸盐；水稻；根；
Nitric oxide is involved in seminal root elongation in rice in response to nitrogen and phosphate deficiency
Abstract：The response of the root system architecture to nutrient deficiencies is critical for sustainable agriculture. Nitric oxide (NO) is considered a key regulator of root growth, although the mechanisms remain unknown. Phenotypic, cellular, and
genetic analyses were undertaken in rice to explore the role of NO in regulating root growth under nitrogen- and phosphate-deficient conditions (LN and LP). Compared with control treatment, low-nitrogen and -phosphorus conditions significantly increased seminal root elongation and the level of nitric oxide in rice root. Further research shows that synthetic pathway of NO in response to LN and LP includes L- arginine pathway, while the NR pathway is only involved in NO generation induced by LN condition.. is involved in increasing the low nitrogen induced nitric oxide, nitric oxide and process involved in low nitrogen, low phosphorus induced root elongation in rice.
Key words：Nitrogen；nitric oxide；phosphate；rice；root
目录
摘要： 1
关键词： 1
Abstract： 1
Key words： 1
1材料和方法 2
1.1植物材料 2
1.2生长条件 2
1.3根系形态测量 2
1.4根尖NO的测量方式 2
1.5硝酸还原酶的测量方式 2
1.6水稻总RNA提取与qRT-PCR反应 2
1.7数据分析 3
2结果与分析 3
2.1NO参与水稻根的伸长 3
2.2低氮、低磷条件下水稻根尖一氧化氮合成途径 6
2.3低氮、低磷条件下NIA2突变体的响应 7
3讨论 9
致谢 10
参考文献 10
附录 12
引言：氮（N）和磷（P）是植物生长发育所必需的主要养分，这两种元素在植物的生命周期中出现不足会严重影响植物的生长发育以及作物的产量[1]。

在氮磷胁迫的条件下，根系结构对养分的响应是植物能否生长和维持生产力的重要机制[2]。

环境和内在因素（如植物激素）均会影响植物根系的生长。

研究表明，作为信号分子的一氧化氮（NO）在植物根系生长发育过程中起着举足轻重的作用[3-5]。

Gouvea等首次
发现，施加外源NO能够诱导玉米根系的伸长[6]。

进一步的研究表明，NO特异性清除剂（cPTIO）能够抑制植物根系的伸长[5, 7]。

许多研究表明，在养分胁迫条件下，一氧化氮调节植物根系的生长。

例如，在氮胁迫条件下，根尖较高浓度的一氧化氮能够促进玉米主根的伸长[5]。

在磷胁迫条件下，较高的内源一氧化氮浓度能够增加白羽扇豆的排根和柠檬酸的分泌[3, 4]。

因此，从这些结果中不难推测，在氮、磷胁迫条件下，一氧化氮可能作为信号物质参与到低氮和低磷调控水稻根系的生长发育, 但其中的调控机理目前还并不清楚。

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本实验主要通过分析不同氮、磷处理条件下水稻根尖一氧化氮水平、施加一氧化氮供体和清除剂后观察水稻种子根长度变化，以及使用Osnia2突变体来研究一氧化氮在不同氮、磷营养调控水稻种子根伸长过程中的作用。

1材料和方法
1.1植物材料
本实验采的野生型水稻为shiokari（由日本东北大学生命科学研究科提供）与Dongjin（购自韩国浦项市）。

突变体为T-DNA插入突变体Osnia2两个株系（nia2-1和nia2-2），属于Dongjin背景。

1.2生长条件
发苗处理
种子经30 % H2O2消毒30 min，在清水中育苗7天。

转移处理
选择地上部及根系大小形态均一致的幼苗，去种子后一次在1/4、1/3和1/2的营养液中培养7天，然后移栽至pH 5.5的国际水稻所（IRRI）修正营养液培养14天。

国际水稻所（IRRI）修正营养液成分
（mM）0.35 K2SO4，1.0 CaCl2，1.0 MgSO4•7H2O，0.5 Na2SiO3和（µM）20.0 Fe-EDTA，9.0 MnCl2，0.39 (NH4)6Mo7O24，20.0 H3BO3，0.77 ZnSO4，0.32 CuSO4，其中低氮处理为0.01 mM NH4NO3；低磷处理为2µM KH2PO4；对照处理为1.25 mM NH4NO3和300 µM KH2PO4。

外源一氧化氮供体（SNP）、一氧化氮清除剂（cPTIO）、NOS清除剂（L-NAME）、NR清除剂（Tungstate）处理水稻移栽后，分别在营养液中施加外源一氧化氮SNP （0-20 μM），一氧化氮清除剂cPTIO（80 μM），NOS清除剂L-NAME（100 μM），NR清除剂Tungstate（25 μM）。

1.3根系形态测量
在设置的试验条件下，种子根的长度显著长于不定根。

预实验的结果显示，种子根和不定根对低氮、低磷的处理的反应是相似的。

因此，选择种子根作为指标来进行低氮和低磷对水稻根系影响的研究，种子根长度主要是通过刻度尺进行测量。

1.4根尖NO的测量方式
使用一氧化氮特异性染料DAF-FMDA对水稻根尖染色，然后在荧光显微镜下观察。

水稻根尖浸泡在20 mM HEPES-NaOH缓冲液（包含10 µMDAF-FMDA）（pH 7.5）中，处于黑暗条件下30分钟，根尖用新鲜的缓冲液清洗三次，使用立体显微镜进行观察，采用彩色CCD摄影机，激发光波长为488 nm，发射光波长为495-575 nm（OLYMPUS MVX10）。

绿色荧光信号水平主要通过Photoshop软件进行量化。

源自
1.5硝酸还原酶的测量方式
采用离体法测定根系的NR活性[8]。

采集水稻根系，迅速置于液氮中，剪碎根系后加5 mL提取缓冲液（5 mmol L-1 EDTA和5 mmol L-1），半胱氨酸溶于0.025 mol L-l磷酸缓冲液（pH 8.7）中，电子供体为（2 mg mL-1 NADH）和少量石英砂于研钵中，冰浴研磨至匀浆后，将其转移至10 ml 离心管中，4000 r min-1离心15 min，上清液即为酶粗提液。

另取一离心管加入1 mL KNO3、0.6 mL NADH和0.4 mL 酶粗提液，混匀后25 ℃反应30 min，立即加入0.5 mL a-磺胺中和过量的NADH，终止反应。

反应结束后加入0.5 mL 萘胺，XX r min-1离心15 min，使用酶标仪测定其在540 nm 处的吸光值。

以0.1 mol L-1磷酸缓冲液（pH7.4）代替NADH 为对照。

根据回归方程计算出反应液中产生的NO2--N的总
量。

在提取液及分析液中均含有5 mmol L-1EDTA条件下测定NR活性。

1.6水稻总RNA提取与qRT-PCR反应
植物总RNA提取使用TRizol试剂（Invitrogen），并严格按照其操作指南进行。

逆转录及cDNA合成参照附录一。

qRT-PCR检测参照附录二。

1.7数据分析
数据采用SPSS软件进行ANVOA方差分析和多重比较，文中的数据表示为平均值±SE，不同字母代表处理间在5 %水平上的差异显著。

所有的统计评估进行SPSS（版本11）统计软件。

2结果与分析
2.1NO参与水稻根的伸长
低氮、低磷条件下野生型水稻（Shiokari）种子根长度以及根尖一氧化氮的积累如图2-1所示。

图中，水稻苗分别在正常营养条件（正常氮，2.5 mM；正常磷，300 µM）和低氮、低磷处理（低氮，0.02 mM；低磷，2 µM）下水培14天。

A，低氮、低磷条件下水稻植株表型；B，连续时间段水稻种子根长度；C，根尖一氧化氮的水平；D，一氧化氮水平的量化。

与正常营养条件相比，低氮和低磷条件下的野生型水稻shiokari种子根的长度显著增加（图2-1A）。

为了进一步
确定缺氮、缺磷对水稻种子根长度的影响，研究了16天内水稻种子根的长度变化。

结果表明，与正常营养条件相比，低氮和低磷处理下的水稻根长度从第六天开始明显增加。

在第10天的时候，低氮和低磷分别诱导水稻种子根长度增加了18%和24%，在第16天的时候分别增加了25%和34%（图2-1B）。

通过测定水稻根尖一氧化氮的水平发现，与正常营养条件相比，在低氮和低磷处理1天时，水稻根尖一氧化氮的量显著增加（图2-1C，D）。

一氧化氮的量化结果表明，与正常营养条件相比，在低氮和低磷处理1天时，水稻根尖一氧化氮的量分别增加了71%和107%，处理14天时分别增加了114%和135%。