实验十PEG法诱导鸡血细胞融合ppt实用版

作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
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KCl 4.
观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五 个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿 孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞 连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或 多个核的圆形细胞。
6．计算细胞融合率
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合 的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已 融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示， 而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为 准确。
细胞融合过程在形态上的变化
五、实验结果
六、注意事项
1.高压灭菌过的PEG 冷却至50-60℃时就加入 预热至50℃的GKN 液，勿让其凝固。
2.严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞1 －2min。
3.终止PEG的作用时，缓慢加入5ml Hanks 液， 轻轻吹打，以免融合的细胞分离或破裂。
（6）Hanks液：Hanks原液100 ml，加重蒸水896 ml，
加0.5%酚红 4 ml。配好的Hanks液，分装包扎好 贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
（7）詹纳斯绿染液。
四、方法与步骤
（一）鸡血细胞的体外融合
1.鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，
注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制 成抗凝全血。 2.鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85%NaCl溶液，制 成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
• 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细 胞
接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此 的表面张力作用，使细胞发生融合。
• 细胞融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合
细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免 疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的 助融剂的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞 融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二 醇（polyethyleneglycol ,PEG）;电场诱导的细胞 融合；激光诱导的细胞融合。
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吸取悬液1mL放入离心管中，加入4mLHanks液混匀， 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。 入入110000mmll瓶瓶1中中0，，0高高0压压r灭灭/m菌菌22i00nmmii离nn。。 心5min，弃上清液，再加入适量GKN液，使 成10%的悬液。 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
37℃水浴中静置5---10min。 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于
细胞融合过程在形态上的变化
5、染色和镜检 5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置5---10min。
两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此
KCl,1.77
g
Na2HPO4·2H2O，
聚乙二醇分子能0改.变6各9类g细胞N的a膜H结构2，P使O两4细·胞H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于
1000ml重蒸水中。 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此
5ml的GKN液进行稀释。
用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。
（一）鸡血细胞的体外融合
4、PEG诱导细胞融合 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。
吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞融合情况。
的85表%面Na张C力l溶吸作液用，取，制使成0细红.胞5细发m胞生储l融备3合液7。，℃置于的4℃冰5箱0内%可供P一E周G内使溶用。液，慢慢沿着离心管壁逐滴 加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞融合情况。
5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置5---10min。
37℃备用。 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
4、PEG诱导细胞融合
细胞融合过程在形态上的变化
（4） Hanks原液(10×)： NaCl 80.0g；Na HPO ·12H O1.2g； 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，速加入肝素（100U肝素/5ml全血）混合，制成抗凝全血。
3、鸡血细胞悬液的制备 取细胞悬液1mL，加4mL0.85%NaCl溶液混匀，1200r/min离
心5min，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl溶液按上述条件 离心两次（5分钟，10分钟）。最后，弃去上清液，加入 10ml的GKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml鸡血细胞 悬液，加入4.5ml的GKN液进行稀释。
实验十PEG法诱导鸡 血细胞融合
一、实验目的
了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合 的基本原理。
通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 初步掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理
细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指 用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核 体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩 溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含 有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。
两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此
2Hale Waihona Puke 42（4） Hanks原液K(10C×)l：4N.a0Cgl ；80. KH2PO4 0.6g；MgSO4·7H2O 2.0g；
葡萄糖 10.0g；CaCl2 1.4g。
称取1.4g的CaCl2，融于30-50ml的重蒸水中。取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧 杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前 一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完 全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至 1000ml。
荧光标记的细胞融合
三．实验仪器、材料和试剂
仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心 机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微 镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、 酒精灯等。