青花椒提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用研究

青花椒提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用研究
张文艳1，李茂东2，黄 堃1，赵仲霞1，阮苏梦1，师　睿1*（1.昭通学院 化学化工学院，云南昭通 657000；2.云南三鑫职业技术学院 医药健康学院，云南文山 663000）
摘 要：将青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌，测定最小抑菌浓度、最小杀菌浓度、生长抑制曲线、培养液中钾离子和内容物的含量。

结果表明，金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为70 mg·mL-1，最小杀菌浓度为80 mg·mL-1；金黄色葡萄球菌在最小抑菌浓度下生长缓慢，甚至停止生长，钾离子和内容物泄露情况明显。

关键词：青花椒提取物；抑制作用；金黄色葡萄球菌
Inhibitory Effect of Zanthoxylum schinifolium Extract on
Staphylococcus aureus
ZHANG Wenyan1, LI Maodong2, HUANG Kun1, ZHAO Zhongxia1, RUAN Sumeng1, SHI Rui1*
(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Zhaotong University, Zhaotong 657000, China; 2.School of
Medicine and Health, Yunnan Sanxin V ocational and Technical College, Wenshan 663000, China) Abstract: The extracts of Zanthoxylum schinifolium were treated with Staphylococcus aureus, and the minimal inhibitory concentration, minimal bactericidal concentration, growth inhibition curve, contents and potassium ion contents in the culture medium were determined. The results showed that the minimum inhibitory concentration of S. aureus was 70 mg·mL-1 and the minimum bactericidal concentration was 80 mg·mL-1. The growth of S. aureus was slow or even stopped at the minimum inhibitory concentration,and the leakage of potassium ions and contents in cells was obvious.
Keywords:Zanthoxylum schinifolium; antibacterial effect; Staphylococcus aureus
花椒是药食两用的植物性原料，研究花椒的抑菌活性意义重大[1]。

本研究从天然抑菌产物角度出发，研究青花椒提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用，深化昭通农副产品的精深加工[2]。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
青花椒，昭通市永善县；营养肉汤培养基、营养琼脂，广东环凯微生物科技有限公司；钾离子检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；96孔板，NEST；移液枪，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；PT-3502 C全波长酶标分析，北京普天新桥技术有限公司。

1.2 实验方法
1.2.1 青花椒提取物的制备
粉碎后过60目筛的青花椒与75%酒精按照料液比1∶15（m∶v）混合，浸泡过夜，50 ℃超声提取50 min，滤液浓缩至浸膏，配制成母液，过滤除菌，-80 ℃保存备用。

1.2.2 滤纸片的准备
用6 mm打孔器对滤纸打孔，121 ℃灭菌15 min，烘干备用，灭菌后的滤纸不能久放，否则会影响实验结果的可靠性[3]。

1.2.3 菌悬液的制备与测定
菌悬液浓度为107 CFU·mL-1，避光培养温度为37 ℃，于600 nm处测定吸光值。

基金项目：云南省大学生创新创业训练项目“玉荷花（紫荆花）成分探究及产品研发”（202210683022）；南省大学生创新创业训练项目“昭通苹果精深加工及功能活性研究”（202210683023）；云南省教育厅科学研究基金“金江花椒生物碱提取及抑菌活性研究”（2021J04753）。

作者简介：张文艳（1995—），女，云南楚雄人，硕士，助教。

研究方向：食品功能活性研究。

通信作者：师睿（1987—），男，云南昭通人，硕士，讲师。

研究方向：天然产物提取研究。

E-mail:****************。

1.2.4 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用
研究
（1）抑菌圈的测定。

在培养基凝固后，每皿加入1 mL 菌悬液进行平板涂布，而后沿同一方向等距
离贴上滤纸片，滤纸片所加青花椒提取物为10 μL ，无菌水为对照组，设置4个实验组，将青花椒提取物稀释成30 mg·mL -1、60 mg·mL -1、120 mg·mL -1和 240 mg·mL -1，培养24 h 后十字交叉法测量抑菌圈大 小，每组3个平行。

（2）青花椒提取物最小抑菌浓度的测定。

最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration ，MIC ）测定方法参考ABREU 等
[4]
和BEEVI 等
[5]
的方
法，以空白培养基为对照组，设置4个实验组，以 107 CFU·mL -1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制 成40 mg·mL -1、50 mg·mL -1、60 mg·mL -1和70 mg·mL -1，每组3个平行。

分别取稀释后不同浓度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96孔板，培养24 h 后 600 nm 处测定吸光值[6]。

MIC 计算公式为
OD OD MIC OD OD
− × 1−=−
空白组实验组空白组阳性组100%（3）青花椒提取物最小杀菌浓度的测定。

最小杀
菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration ，MBC ）测定方法参考李静慧
[7]
和郭雪梅
[8]
的方法，即青
花椒提取物抑制99.9%的金黄色葡萄球菌生长所需的浓度[9]。

以空白培养基为对照组，设置4个实验组，以107 CFU·mL -1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制成60 mg·mL -1、70 mg·mL -1、80 mg·mL -1和90 mg·mL -1
，每组3个平行。

分别取稀释后不同浓度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96孔板，培养24 h 后检测600 nm 处的吸光值。

同时每孔取 50 μL 培养液加入营养肉汤琼脂培养基进行平板涂布，37 ℃避光培养24 h ，计数菌落，最终选择抑菌率≥99.9%，且平板涂布培养后菌落数≤5 CFU 所对应的青花椒提取物浓度为该供试菌的MBC 值[10]。

MBC 计算公式为
OD OD
MBC OD OD
− ×−1= −
空白组实验组
空白组阳性组100%（4）生长抑制曲线的测定。

参考陈屹[11]、张雅静[12]
和李冬冬[13]的方法，以菌悬液为对照组，设置3个实验组，以107
CFU·mL -1
菌液作为稀释液，将青花
椒提取物配制成50 mg ·mL -1、70 mg ·mL -1、80 mg ·mL -1，每组3个平行。

分别取稀释后不同浓度的青花椒提
取物，以每孔200 μL 加入96孔板，每2 h 检测一次600 nm 处的吸光值，测定金黄色葡萄球菌的生长 情况[14]。

（5）青花椒提取物对金黄色葡萄球菌膜通透性的影响。

以菌悬液为对照组，设置4个实验组，以 107 CFU·mL -1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制 成50 mg·mL -1、60 mg·mL -1、70 mg·mL -1和80 mg·mL -1， 于80 r·min -1避光培养6 h ，5 000 r·min -1离心5 min ， 收集细胞上清液，按照钾离子检测盒说明书测定金黄色葡萄球菌细胞上清液中钾离子的含量。

（6）青花椒提取物对金黄色葡萄球菌内容物的影响。

菌悬液为对照组，设置2个实验组，以 107 CFU·mL -1菌液作为稀释液，将青花椒提取物配制成50 mg ·mL -1、70 mg ·mL -1，于100 r ·min -1避光培养，每2 h 取一次样，培养结束后5 000 r·min -1离心
5 min ，收集上清，260 nm 处检测吸光值。

2 结果与分析
2.1 抑菌圈的测定结果
由表1可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，均能产生一定大小的抑菌圈。

表1 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果的测定青花椒提取物浓度/（
mg·mL -1）抑菌圈大小/mm 30
60120240
11.16±0.1914.98±0.2115.37±0.1116.22±0.24
2.2 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度
由图1可知，当青花椒提取物浓度为60 mg·mL -1
时，抑菌率为79.45%；当青花椒提取物浓度为 70 mg·mL -1时，抑菌率为97.59%，大于90%。

因此，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后MIC 值为 70 mg·mL -1。

20406080100抑菌率/%
浓度/（mg ·mL -1）
图1 不同浓度青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度
2.3 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度
由图2、表2可知，当青花椒提取物浓度为 80 mg·mL -1时，抑菌率≥99.9%，且平板涂布培养后菌落数≤5 CFU 。

因此，青花椒提取物作用于金黄色
葡萄球菌后MBC 值为80 mg·mL -1。

2040
6080100抑菌率/% 浓度/（mg·mL -1）
图2 不同浓度青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌的 
最小杀菌浓度
表2 不同浓度青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌的 
菌落计数
青花椒提取物浓度/（
mg·mL -1）每皿菌落数/CFU
602170280090
2.4 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线
由图3可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后对其生长均有抑制作用。

吸光值浓度/（mg ·mL -1）
图3 
青花椒提取物对金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线
2.5 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响情况
青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，检测细胞上清液中钾离子含量，以此反映青花椒提取物
作用下金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性。

根据试剂盒说明书，绘制钾离子标准曲线，
y =1.483 8x -0.023 7，R 2=0.998 9，如图4所示。

由图5可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，80 mg·mL -1对金黄色葡萄球菌膜的通透性影响最大，表明K +泄漏到胞外
培养液中，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，
增加了细胞膜的通透性。

吸光值
浓度/（mg ·mL -1）
图4 钾离子标准曲线
0.00
0.050.100.150.200.250.300.35
50
70
80
吸光值60浓度/（mg·mL -1
）
图5 金黄色葡萄球菌膜通透性情况
2.6 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌内容物泄露量的影响
检测260 nm 处的吸光值，判断青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后内容物的泄露量。

由图6可知，青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后，70 mg·mL -1时内容物泄露最多，其次是50 mg·mL -1，表明青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌后破坏了细胞膜的
完整性，导致胞内物质发生泄露。

0.00
0.020.040.060.080.100.120.14
吸光值
时间/h
图6 青花椒提取物对金黄色葡萄球菌内容物泄露量的影响
3 结论
本研究将青花椒提取物作用于金黄色葡萄球菌，
探究青花椒提取物的抑菌活性，结果显示，菌体缓慢生长，MIC 为70 mg·mL -1，MBC 为80 mg·mL -1，钾离子、内容物发生不同程度的泄露，表明青花椒提取物对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

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