基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

分析检测基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立
郭　瑞1,2，赵林萍1,2，韩小改1,2，郭　毅3，任宝红1,2*
（1.国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术），河南郑州 450003；
2.郑州中道生物技术有限公司，河南郑州 450001；
3.河南省食品和盐业检验技术研究院，河南郑州 450000）
摘　要：目的：建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增（Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification，RAA）技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。

方法：针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针，通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸，评价其灵敏度；通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸，评价其特异性。

结果：所建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内完成样本核酸的检测。

采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测，质粒最低检出限为1 copy/μL，菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL-1，且与其他菌株核酸无交叉反应。

结论：成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法，该方法具有特异性强和快速的特点，可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。

关键词：单增李斯特菌；重组酶介导等温核酸扩增；hlyA；核酸检测Establishment of a Rapid Detection Method for Foodborne Listeria monocytogenes Using Fluorescence Probe Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Amplification Technology GUO Rui1,2, ZHAO Linping1,2, HAN Xiaogai1,2, GUO Yi3, REN Baohong1,2*
(1.State Key Laboratory of Market Regulation (Food Safety Rapid Testing and Smart Supervision Technology), Zhengzhou 450003, China; 2.Zhengzhou Zhongdao Biotechnology Co., Ltd., Zhengzhou 450001, China; 3.Henan Institute of Food and Salt Industry Inspection Technology, Zhengzhou 450000, China) Abstract: Objective: To establish a rapid detection method for foodborne Listeria monocytogenes based on fluorescence probe recombinant enzyme mediated isothermal nucleic acid amplification (RAA) technology. Method: Specific primers and probes were designed for the conserved sequence of the hlyA gene of Listeria monocytogenes. The sensitivity was evaluated by constructing recombinant plasmids containing hlyA target gene fragments and different concentrations of Listeria monocytogenes nucleic acid; evaluate the specificity of E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus and other bacterial fluids by detecting their nucleic acid levels. Result: The fluorescence RAA method established can complete the detection of sample nucleic acid within 39 ℃and 20 minutes. The established method is used to detect plasmids and nucleic acids, with a minimum detection limit of 1 copy/μL. The minimum detection limit for bacterial nucleic acid is 103 CFU·mL-1, and there is no cross reaction with other strains. Conclusion: A fluorescence RAA based nucleic acid detection method for Listeria monocytogenes has been successfully established. This method has strong specificity and is fast, and can be used for rapid detection of food suspected to be contaminated with Listeria monocytogenes.
基金项目：国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术）科研项目（ZDSYS202305）。

作者简介：郭瑞（1985—），女，河南周口人，硕士，兽医师。

研究方向：动物疫病诊断技术的开发与应用。

通信作者：任宝红（1984—），男，河南辉县人，硕士，工程师。

研究方向：体外诊断试剂的研发和应用。

E-mail:373541064@ 。

分析检测
Keywords:Listeria monocytogenes; recombinant enzyme mediated isothermal nucleic acid amplification; hlyA; nucleic acid testing
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌，是一种重要的食源性病原菌，寄生于细胞内，属于革兰氏阳性杆菌，兼性厌氧，不形成孢子，宽约0.5 μm，长1～1.5 μm，产生毒素β-溶血素，能引起人类和畜禽共同患病[1]。

单增李斯特菌具有顽强的生命力，能在室温、冷藏条件下生长。

单增李斯特菌污染程度是冷藏食品安全性的关键因素，污染浓度为102 CFU·g-1时即可感染新生儿、孕妇和免疫缺陷者等高危险人群，引起多种类型疾病，具有很高的致死率（20%～30%）[2]。

因此，食源性单增李斯特菌的快速、准确诊断方法及产品的研究，对于该致病菌的防控具有重要意义，可为公众健康安全保障提供重要的技术支撑。

迄今为止，有很多方法用于鉴别单增李斯特菌，如传统培养法、免疫学法、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）法和等温核酸扩增法等[3]。

传统培养法是金标准，但需要2～3 d的时间进行细菌培养和鉴定，十分耗时[4]。

PCR法具有检测时间短、灵敏度高的特点，同时需要烦琐的热控制设备，并且容易造成气溶胶污染。

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种快速、高通量的方法，但缺乏足够的灵敏度。

近年来，等温核酸扩增方法因极大地简化了即时检测设备的信号扩增程序而成为替代PCR的潜在选择。

重组酶介导的等温核酸扩增（Recombinant E n z y m e M e d i a t e d I s o t h e r m a l N u c l e i c A c i d Amplification，RAA）是一种新型的核酸扩增技术，它利用特定的酶和蛋白，在37～42 ℃恒温条件下即可实现核酸的快速扩增，其反应速度快，一般可在15～30 min实现目标分析物的快速检测，操作简便，不需要特别复杂的仪器。

目前，这项技术在病原体、食品安全等各个领域均有应用[5-6]。

本研究基于RAA反应原理成功建立了一种快速、方便的检测方法，可用于食源性单增李斯特菌的鉴定。

1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌株
实验用的菌株采购自广东环凯微生物科技有限公司，涉及5种，分别是单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌。

1.1.2　仪器与试剂
等温荧光检测仪MA-1610（苏州雅睿）；Gentier 48E实时荧光定量PCR检测系统（西安天隆）；ABI7500 Real Time PCR Systerm（Applied Biosystems 公司）；UV5 Nano核酸微量检测仪（梅特勒-托利多国际有限公司）。

核酸柱式提取试剂盒（郑州中道生物）；RAA荧光型核酸扩增试剂（安普未来）；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、脑心浸液培养基（海博生物）。

1.2　方法
1.2.1　核酸提取
参照核酸柱式提取试剂盒说明书步骤，对待测样品进行核酸提取。

纯化后的核酸溶液，测定浓度后，在-20 ℃条件下保存备用。

1.2.2　引物和探针设计
利用NCBI数据库，检索单增李斯特菌hlyA基因序列，结合DNAman软件对选择的基因序列进行同源性分析，筛选出特异性保守性兼顾的序列为靶序列。

根据RAA引物、探针设计原则设计多条特异性引物和探针，并发送华大基因进行序列合成。

1.2.3　质粒制备
选取单增李斯特菌hlyA（GenBank登录号：MG922920.1）的靶序列，由华大基因合成，以质粒形式作为阳性模板DNA。

用核酸微量检测仪测定质粒的浓度，并根据以下公式进行拷贝数计算：浓度（拷贝/μL）=[6.02×1023×质粒浓度（ng·μL-1）×10-9]/[质粒长度（bp）×660]，获得质粒标准品的拷贝数浓度。

1.2.4　反应体系
以1.2.2中构建的质粒作为模板，将设计的3条引物F、3条引物R、1条探针P交叉组合。

参照荧光RAA扩增试剂盒说明书操作步骤，将其与试剂盒中其他RAA扩增试剂混合成为50 μL的扩增体系。

同时选择无酶水为阴性质控。

将上述体系振荡混匀并离心，然后置于恒温核酸扩增检测仪中，扩增条件为39 ℃、20 min。

1.2.5　灵敏度评价
分别以单增李斯特菌合成质粒或菌液提取核酸为模板，对该方法的灵敏度进行分析。

将合成质粒
分析检测
10倍梯度稀释，稀释后浓度依次为106拷贝/μL 、105拷贝/μL 、104拷贝/μL 、103拷贝/μL 、102拷贝/μL 和10拷贝/μL ，用于质粒灵敏度的评价。

将初始浓度为108 CFU·mL -1的单增李斯特菌菌液10倍稀释至107 CFU·mL -1、106 CFU·mL -1、105 CFU·mL -1、 104 CFU·mL -1、103 CFU·mL -1和102 CFU·mL -1，将提取的基因组核酸进行RAA 扩增，评价菌液检测灵敏度。

1.2.6　特异性评价
分别以单增李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等菌液提取核酸为模板，用于特异性评价。

1.2.7　仪器适应性评价
以单增李斯特菌102～107 CFU·mL -1的菌液核酸作为模板，分别使用天隆荧光PCR 仪器和ABI7500仪器，进行仪器适应性评价。

2　结果与分析
2.1　引物和探针设计
以浓度为103～105 CFU·mL -1的菌液核酸为模板进行RAA 扩增，通过引物的筛选和评估，获得一组引物F/R 和探针P ，如表1所示。

扩增片段长度为150 bp 。

2.2　检测灵敏度
将含有hlyA 基因靶序列的合成质粒，测定、稀
释为确定拷贝数的梯度模板，经荧光RAA 扩增检验，均有显著的扩增曲线。

理论上拷贝数浓度与检测到的显著荧光信号的时长呈正相关关系。

结果分析显示，最低在1 copy/μL 时可以检出；同时，阴性质控显示为阴性（图1）。

选择107～102 CFU·mL -1不同浓度菌液提取的核酸为模板进行扩增检测。

结果显示，菌液核酸的最低检出浓度为103 CFU·mL -1；阴性对照和 102 CFU·mL -1核酸检测均无显著的扩增曲线（图2）。

2.3　检测特异性
选择单增李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液提取核酸为模板进行检测，仅添加单增李斯特菌核酸的反应孔在10 min 内检测到荧光信号明显增加，结果显示为阳性。

其他菌液核酸反应孔的荧光信号均未检测到，结果显示为阴性，无交叉反应（图3），说明该方法特异性较强。

2.4　仪器适应性评价
将天隆荧光PCR 仪器和ABI7500仪器的运行程序设为39 ℃，30 s ，共40个循环，以不同浓度菌液（107～102 CFU·mL -1）提取的核酸为模板进行恒温荧
光扩增，显示这两种仪器在40个循环内可检测到荧光信号，检出限仍达到103 CFU·mL -1；阴性对照和102 CFU·mL -1样品无荧光信号变化（图4），说明试剂仪器适应性良好。

表1　RAA 引物和探针序列
引物探针名称
引物、探针序列（5’-3’）
hlyA-F GAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATA hlyA -R TTTCTCCACAACGATATATTCATTTCCATCTTT
hlyA -P
CGGCACATTTGTCACTGCATCTCCGTGGTA(FAM -dT)[THF]C(BHQ -dT)AATACATTGTTT
00:00
05 000
10 000
15 00020 000
00:02
00:04
00:06
00:0700:10扩增时间
荧光信号强度
00:1200:1400:1600:181
5
32467
00:20
1～7代表质粒模板浓度依次为1.0×106
～1.0×100
 copies/μL。

图1　单增李斯特菌荧光RAA 质粒灵敏度试验
00:00
05 000
10 000
荧光信号强度
15 000
00:02
00:04
00:06
00:07
00:10扩增时间
00:1200:14
00:16
00:18
65
42
31
00:20
1～6代表菌液梯度浓度依次为1.0×107
～1.0× 102 CFU·mL -1。

图2　单增李斯特菌荧光RAA 菌液梯度灵敏度试验
2
100 000
-1 000
1
5
10
15
20循环数
天隆
25
30
35
40
1 000
2 000
1
2
3
4
5
6
7
3 000
4 000
5 000
6 000
200 000
300 000
荧光信号强度
荧光信号强度
400 000500 000600 000AB17500
1
2
3
4
5
6
7
700 000
4
6
8
10
121416
1820循环数
30 445.900 401
2224262830
3234
362840
1～7代表菌液梯度浓度依次为1.0×107～1.0×102 CFU·mL -1、阴性对照。

图4　单增李斯特菌荧光RAA 仪器适应性试验
3　结论与讨论
单核细胞增生李斯特菌是致命性疾病单增李斯特菌病的病原，对公众健康构成严重威胁。

单增李斯特菌对肉制品的污染是一个公共卫生问题，许多人类李斯特菌病的爆发都与受污染的肉制品有关[7]。

因此，建立快速检测单增李斯特菌的方法，可为食品安全保障提供技术支撑。

hlyA 基因是单增李斯特菌的保守基因，也是重要的毒力基因，编码蛋白是溶血素O ，许多研究者用它作为检测单增李斯特菌的靶基因[8-10]，故本研究选择hlyA 基因保守序列设计特异性引物和探针，建立了快速检测单增李斯特菌的RAA 方法，此方法可在39 ℃、20 min 内完成样本核酸的检测，对质粒和核酸进行检测，质粒最低检出限为1 copy/μL ，菌液核酸最低检测限为103
CFU·mL -1
，且与其他菌株核
酸等无交叉反应，适用于不同类型的荧光PCR 仪。

本研究有效建立了一种可以用于单增李斯特菌核酸检测的荧光RAA 方法，且快速、特异性强、检测流程简单，不需要特别复杂的仪器，适用于防控
单增李斯特菌感染引发的各种食物中毒、疾病暴发、食品安全事故等场景的检测需求。

参考文献
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[5]魏莹,郭利川,张小平,等.重组酶介导扩增方法快速检测A 族乙型溶血性链球菌[J].中国国境卫生检疫杂
（下转第108页）
00:000
5 000
10 000
荧光信号强度
15 00000:0200:0400:0600:0700:10扩增时间
00:1200:1400:161
00:182~5
00:20
1～5分别代表单增李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌。

图3　单增李斯特菌荧光RAA 特异性试验
时，应用UEIEB-AFS测定了3批食用油中铅含量，并将结果与《食品安全国家标准食品中铅的测定》（GB 5009.12—2017）第一法中微波消解法比较，所得结果见表2，基于Student-t检验（95%置信水平），两种方法结果间（油2）无显著性差异[sig（双尾）=0.806，P＞0.05]，表明本文建立的方法结果可靠。

2.3　实际样品测定
应用UEIEB-AFS对九江市食品安全抽检中7种食用油（每种3批）进行测定。

由表3可知，21批食用油中铅平均含量为0～22.3 μg·kg-1，不同油中铅含量不同，其中花生油与芝麻油未检出，而山茶油铅含量最高[（22.3±0.5）μg·kg-1]，但均低于《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762—2022）中对铅的限量要求（80 μg·kg-1），这表明九江市售食用油中铅含量处于较安全的水平。

表3　食用油样品铅检测结果
种类含量/（μg·kg-1）
大豆油14.2±1.1
玉米油8.0±1.0
花生油未检出
芝麻油未检出
菜籽油 5.4±1.0
山茶油22.3±0.5
调和油0.6±0.1
3　结论
本文建立了UEIEB-AFS法测定食用油中铅，通过优化得到检测条件为载流1% HNO3，K3[Fe(CN)6]浓度1%，KBH4浓度1.5%。

与GB 5009.12—2017相比，本方法具有前处理简单、灵敏度高的优势，在不具备微波消解仪、ICP-MS等昂贵仪器的基层实验室应用前景广阔。

参考文献
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表2　两种方法结果比较
样品
铅含量/（μg·kg-1）
UEIEB-AFS法GB 5009.12—2017第一法
油1未检出未检出油222.4±1.122.0±2.4油3未检出未检出
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