抗菌肽IB-367的基因工程生产方法[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 1920019A
[43]公开日2007年2月28日
[21]申请号200510014832.X [22]申请日2005.08.24
[21]申请号200510014832.X
[71]申请人天津天士力制药股份有限公司
地址300402天津市北辰区新宜白大道辽河东路
1号
[72]发明人杨旭 吴全忠 高峰 姜燕 [51]Int.CI.C12N 15/09 (2006.01)C12N 15/11 (2006.01)C12P 21/02 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页
[54]发明名称
抗菌肽IB－367的基因工程生产方法
[57]摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及
抗菌肽IB－367的基因工程表达方法：包括合成编
码IB－367的DNA序列，连接到适合的表达载体进行
表达和纯化，其中编码IB－367的DNA序列，采用了
在大肠杆菌中的高丰度和使用规律高的密码子，密
码子整体序列和密码子之间重复少，减少了在复制
过程中的错配几率，T m 值适中，在原核细胞融合表
达系统中表达的IB－367，占菌体总蛋白的48～52％。

200510014832.X权 利 要 求 书第1/1页 1.一种IB-367的基因工程生产方法，包括合成编码IB-367的DNA序列，连接到适合的表
达载体进行表达和纯化，其中编码IB-367的DNA序列为序列表SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO.2
2.按照权利要求1的生产IB-367的方法，其中所用的表达载体是融合表达载体。

3.按照权利要求2的生产IB-367的方法，其中所用的表达载体是GST 载体。

200510014832.X说 明 书第1/5页
抗菌肽IB-367的基因工程生产方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及抗菌肽的基因工程表达方法。

背景技术
抗生素的发现使人们对病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策，对保护人类健康作出了巨大贡献。

但是，随着抗生素的广泛应用，导致病原菌株不断产生耐药性，一些过去抗生素非常有效得到控制的传染性疾病，近年来死灰复燃。

而且由于耐药性的不断增强和蔓延，现有抗生素已经显得无能为力。

此外抗生素的普遍滥用和药物残留，一些抗生素的过敏反应等诸多问题，已日趋严重和日益突出，迫切需要新一类的抗菌制剂加以解决。

面临细菌耐药性极大的挑战和目前形势的迫切性，研究者们全力探索与目前作用机制完全不同的新型抗菌药物。

抗菌肽广泛存在于多种生物体内，是生物体对外界病原物侵染而产生的一系列免疫反应的产物，其分子量小，性能稳定，具有较强的广谱抗菌能力。

这类抗菌肽作用于微生物膜(细胞膜、外膜)，破坏其屏障而达到杀伤细菌细胞的效果，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性：不会诱导抗药菌株的产生，有希望成为新一代抗菌剂。

IB367蛋白一级结构为：Arg-Gly-Gly-Lue-Gys-Tyr-Gys-Arg-Gly-Arg-Phe-Gys-Val-Gys-Val -Gly-Arg，分子量约为：1.9KDa，与另外一种抗菌肽Protegrin-1(NN2-Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys -Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Va-Gly-Arg-CONH2)是结构类似物，分离于猪的白细胞(Deb orah A.M.，et al.IB-367，a Protegrin Peptide with In Vitro and In Vivo Activities against the Microflora Associated with Oral Mucositis.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，20 00，44(7)：1803-1808.)。

其抗菌谱广泛，对于口腔中分离出的大部分细菌均有效，目前由资料显示，该抗菌肽已经在治疗口腔感染上取得了一定的进展。

值得一提的是，该类多肽在体外抑制HIV方面显示出了一定的效果。

(Yau，Y.H.，et al.High Therapeutic Index of Factor C Sushi Peptides：Potent Antimicrobials against Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob.Agent s Chemother.2001，45：2820-2825.)
目前公开报道的I B-367均为化学合成产品，化学合成法工艺复杂，成本高，其生产过程使用大量有机溶剂，污染环境。

发明内容
所要解决的技术问题
本发明旨在解决利用基因工程的方法高效表达抗菌肽IB367的问题。

技术方案
本发明提供了一种基因工程生产I B-367的方法。

该方法包括：合成I B-367的编码序列，连接到合适的载体，在宿主细胞中表达和纯化，其中编码I B-367的D N A序列采用了大肠杆菌偏好的密码子，具体序列见序列表S E Q I D N O.1和S E Q I D N O.2，表达载体可以是任何适合于大肠杆菌表达的载体，根据抗菌肽的分子量较小的特点，优选融合表达载体，如p B S、p T r x、p T r x F u s等，特别优选G S T融合表达载体，例如p G E X系统和p E T系统的载体(购自a m e r s h a m p h a r m a c i a b i o t e c h公司)，因为G S T融合蛋白易于小分子肽的融合表达，鉴于纯化需要目的肽和融合蛋白之间分子量有一定的差异，这样小肽更容易纯化彻底。

而且为更好的适合于目的肽的切割。

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2可采用常规方法用核酸自动合成仪合成。

基因工程表达的IB-367，对不同来源的5株金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus最小杀菌浓度(M I C)为0.1～3μg/m l，对不同来源的5株铜绿假单胞菌P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a(绿脓杆菌)最小杀菌浓度(M I C)0.04～6μg/m L。

对其它的如链球菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等都具有良好的杀菌作用。

有益效果
本发明提供的基因工程生产I B-367的方法，采用了在大肠杆菌中的高丰度和使用规律高的密码子，密码子整体序列和密码子之间重复少，减少了在复制过程中的错配几率，T m值适中，在原核细胞融合表达系统中表达的IB-367，占菌体总蛋白的48～52％。

附图说明
pET42a(+)IB-367重组表达质粒的构建示意图
具体实施方式
以下结合实施例，具体说明本法明。

本发明所用内切酶、连接酶、其他分子生物学试剂和菌株E.coli DH5α购自Promega公司。

电泳、感受态细胞制备、转化等分子生物学方法采用《分子克隆实验指南》的方法进行(萨姆布鲁斯(S a m b r o o l，J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3版)，北京，科学出版社，2002，8)。

质粒提取，采用上海生工试剂盒K192，按照使用说明进行。

实施例1
IB-367的基因工程表达
表达载体的构建和转化子的获得
按常规方法分别将核酸SE Q I D N O.1、S E Q I D N O.2、SE Q I D N O.3、S E Q I D N O.4和SE Q I D N O.5合成在质粒p U C18载体上，依照说明书用S m a I(c c c/g g g)+E c o R I(g/a a t t c)对S E Q I D NO.1-pUC18酶切，低熔点琼脂糖法(《分子克隆》)回收小片断，用PhsAI
(g a c N N/N N g t c)+E c o R I(g/a a t t c)对载体p E T42a(+)进行酶切，低熔点琼脂糖法回收大片断，依照说明书用T4D N A连接酶连接回收产物，即可获得含编码I B-367的D N A序列的表达载体，将表达载体转化入新制备的大肠杆菌D H5α的感受态细胞，筛选并鉴定转化子，常规方法提取质粒，经序列测定序列无误。

诱导表达，检测鉴定
转化子对照p E T42a(+)B L21(D E3)p l y s S分别划线含卡那霉素30u g/m l的L B平板，37℃培养的单个菌落接种含卡那霉素30u g/m l的L B肉汤20m l；以及空白对照B L21(D E3) p l y s S菌落接种不含抗生素的L B肉汤20m l。

当O D值达0.6时，分别加I P T G至终浓度1m M，37℃诱导表达2～3小时。

5,000g离心5分钟，保留上清，用20mM TrisHCl(pH8.0)洗涤，5,000g 离心5分钟，上清和沉淀保存于-80℃用于电泳检测。

在28K D a.分子量附近有条带(分子量约27.9K D a)，即为融合蛋白，融合蛋白表达量分别是49％、52％、30％、42％和35％。

纯化
将GSTrap FF柱和HiTrap Benzamidine FF(high sub)(GE Healthcare-formerly Amersham Biosciences-Products)柱连接使用，使用AKTA Prime(amersham pharmacia biotech公司仪器)在线处理，样品切割和Factor Xa去除一步完成。

按GSTrap FF柱和HiTrap Benzamidine FF (h i g h s u b)说明书，配合使用P r i m e在线处理，浓缩得到I B-367，按照小肽分子的S D S-P A G E 方法(石继红等，应用S D S-P A G E显示小分子多肽技术的探讨，生物工程进展，2001，V o l21，N o.1，38～41)，S D S-P A G E电泳银染检测其分子量约为1.9K D a，序列测定与文献报道一致。

实施例2
抗菌效果检测
方法：通过抑菌圈和杀菌浓度测定
琼脂糖扩散抗菌鉴定(Agarose diffusion antimicrobial assay)(美国专利6,337,314，2002年1月8日)。

按照实施例1的方法得到基因工程表达的I B-367，对不同来源(标准菌株金黄色葡萄球菌S.a u r e u s，C M C C(B)26003和医院临床病例分离金黄色葡萄球菌菌株)的5株金黄色葡
萄球菌S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s最小杀菌浓度(M I C)为0.1～3μg/m l，对不同来源(标准菌株铜绿假单胞菌P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a M i g n l a，C M C C(B)10104和医院临床病例分离铜绿假单胞菌菌株)的5株P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)最小杀菌浓度(M I C) 0.04～6μg/mL。

核苷酸序列表
SEQ ID NO.1
cgaggtggtc tgtgttattg tcgtggtcgt ttctgcgtgt gtgtgggccg c 51 SEQ ID NO.2
cgaggcggcc tgtgttattg ccgtggtcgt ttctgcgtgt gcgtgggccg t 51 SEQ ID NO.3
cgaggcggcc tgtgttattg ccgtggtcgt ttctgcgtgt gcgtgggccg t 51 SEQ IDNO.4
cgaggagggc tgtgttattg ccggggtcgg ttctgcgtgt gcgtgggccg t 51 SEQ ID NO.5
cgaggtggcc tgtgctactg ccgcggccgc ttctgcgttt gcgtcggccg c 51
200510014832.X说 明 书 附 图第1/1页。