基因治疗的原理

2. 受体介导反义 RNA 技转移 术
借助受体介导 DNA 转移方法把 DNA 换成反义 RNA ， 就可以实现受体介导的反义 RNA 的转移。
基本原理：将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP） 与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复 合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA 复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所 识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA 进入肝细胞 后，可被逐渐释放出来发挥作用。
基因治疗的原理
内容提要
一、基因治疗的策略 二、基因转移技术 三、基因干预
一、基因治疗 的策略
（一）基因置换（gene replacement）
定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过 定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的 缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。
（二） 基因添加
基因添加或称基因增补（gene augmentation） : 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达 的基因。 类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因， 而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常 基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能。 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利 用其表达产物达到治疗疾病的目的。
（三）基因干预

基因干预（gene interference）: 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者 通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以 达到治疗疾病的目的。
（四）自杀基因治疗
自杀基因治疗 : 恶性肿瘤基因治疗的主 要方法之一。 原理 : 将“自杀”基因导入宿主细胞中， 这种基因编码的酶能使无毒性的药物前 体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞 产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤 细胞的目的。
（3）基因直接注射技术
不需要进行基因工程的繁琐操作，直 接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些 器官组织内。
三、基因干预
基因干预的种类：


1.反义RNA (antisense RNA)
2.干扰RNA (RNA interference)
（一）反义RNA
1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表 达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养 细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将 质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。
长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成 21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA （small interfering RNA，siRNA）。
（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合 体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNAinduced silencing complex, RISC)。
2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 4.靶向性差。
2.非病毒载体介导的基因转移系统
（1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、 成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与 DNA混合后，可以自动形成包埋外源 DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即 可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的 基因）转移至细胞内，并进行表达。
（二）干扰RNA
1.RNA干扰现象
RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因 沉默现象。在此过程中，与双链RNA有 同源序列的信使RNA（mRNA）被降解， 从而抑制该基因的表达。
2.RNA干扰的机制
RNA干扰过程主要有2个步骤： （1）小干扰性RNA（siRNA）
(1) 逆转录病毒载体
Βιβλιοθήκη Baidu转录病毒载体的特点
①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被 许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而 使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 ②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影 响其他部分的活性。 ③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于 外源基因在靶细胞中的永久表达。 ④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转 录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养 的上清液中，易于分离制备。
该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异 的位点将该mRNA切断。
3.RNA干扰的应用前景
RNA干扰研究目前已经在功能基因组 学研究、微生物学研究、基因治疗和信 号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进 展，使其在医学、生物学领域的应用有 着广阔的前景。
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（五）基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因 导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌 免疫反应。
二、基因转移 技术
基因转移(gene transfer)技术
1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。
1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高， 因此它也是使用最多的基因治疗载体。 据统计，有72%的临床实验计划和71% 的病例使用了病毒载体，其中用得最多 的是逆转录病毒载体。
逆转录病毒载体的主要缺点
随机整合，有插入突变、激活癌基因 的潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能容 纳7 kb以下的外源基因。
（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体
腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病 毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后 腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未 发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染 分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。
腺病毒载体的优点
1.基因导入效率高，对人类安全； 2.宿主范围广； 3.基因转导与细胞分裂无关； 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入 或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；
腺病毒载体的缺点
1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖 快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢 失的机会增多，表达时间相对较短。
（2）受体介导转移技术
将 DNA 与细胞或组织亲和性的配体偶联， 可使 DNA具有靶向性。这种偶联通常通过 多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多 聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷 相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA 包围，只留下配体暴露于表面。这样形成 的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞 饮，从而将外源DNA导入靶细胞。