淋巴细胞的分离和检测技术

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人外周血淋巴细胞分离液使用说明

人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。

下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。

- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。

- 为实验准备足够数量的外周血样本。

2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。

- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。

3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。

- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。

4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。

5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。

- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。

- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。

6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。

- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。

- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。

请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。

在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。

同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。

希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。

免疫学临床应用

（二）抗原或抗体的检测方法
凝集反应沉淀反应补体参与的抗原抗体反应免疫标记技术
（一）凝集反应（agglutination）
颗粒性抗原（红细胞、细菌、乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。
1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、试管凝集
2、间接凝集（indirect agglutination）可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。
3、细胞因子检测
可用于鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。IL-2、IL-2R、rIFN 、TNF等检测。
①免疫学方法：ELISA、RIA等。
②细胞生物学方法 ③分子生物学方法，如聚合酶链反应（PCR）法等
4、体内免疫细胞功能测定：皮肤试验
（1）迟发型超敏反应：旧结核菌素试验（ OT试验）皮试（+）——有一定的细胞免疫能力皮试（—）——细胞免疫功能缺损
免疫重建(immunoreconstitution)
将免疫功能正常个体的造血干细胞或淋巴细胞移植给患有免疫功能缺陷的个体，使后者的免疫功能全部或部分得到恢复。
一、免疫增强疗法和免疫抑制疗法
二、特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗
三、主动免疫治疗（active immunotherapy）和被动免疫治疗（passive immunotherapy）
（三）计划免疫
二、新型疫苗的发展三、疫苗的应用
1、抗感染 2、抗肿瘤 3、计划生育 4、防止免疫病理损伤
复习题
一、名词解释凝集反应、沉淀反应、ELISA、人工主动免疫、人工被动免疫、类毒素、LAK细胞、TIL细胞
二、问答题 1、简述抗原抗体反应的特点。 2、何谓免疫标记技术？简述三大免疫标记技术的原理和应用。 3、试比较人工主动免疫与人工被动免疫。

第一节淋巴细胞的功能检测一、T细胞功能检测二、B细胞功

7. NK细胞活性测定的方法学有哪些？
8. 中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。 9. 巨噬细胞功能检测方法学及相应原理。 10. 免疫细胞功能检测的临床应用有哪些？
小结
免疫细胞功能试验包括体内和体外试验。免疫细胞功
能体外试验主要根据免疫细胞的增殖活性、分泌活性和杀伤活性等特性而进行实验设计。
第十五章免疫细胞功能检测技术
第一节淋巴细胞的功能检测
Hale Waihona Puke 一、T细胞功能检测二、B细胞功能检测
三、NK细胞活性测定
第二节吞噬细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测
二、巨噬细胞功能检测
第三节免疫细胞功能检测的临床应用
思考题
小结
对淋巴细胞群，中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等功能测定可
以有效评价机体特异性和非特异性
用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其
对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤
P815的杀伤活性。
(五) 巨噬细胞促凝血活性测定
激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合
的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，
为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2
混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试
管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。
3．临床应用与评价
溶血空斑试验主要用于测定药物和
手术等因素对体液免疫功能的影响
评价免疫治疗或免疫重建后机体产
生抗体的能力。
(三 )
1.原理：
B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法
2．应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检
测抗体分泌量。
优点：
稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。

五年制免疫实验课小鼠脾脏单个核细胞分离-新

E花环分离法
（纯化T细胞）
T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体）
尼龙纤维分离法
B细胞和单核细胞具有易粘附特性，将淋巴细胞悬液加到尼龙纤维上， 37℃作用1－2小时后，洗脱的为非粘附性T细胞。
PBMC
B细胞单核细胞
尼龙纤维毛柱
T细胞
流式细胞术
（Flow Cytometry，FCM）
一、 T细胞增殖试验
1. 形态学检查
T细胞增殖试验原毒的行正理刺分常素激裂：）人后的T、转细能淋非化胞转巴率特体化为母异（外为细7性形0受体％胞有态特积左，丝学异较右以分示性大。此裂意抗、测原原图代定（物）谢T如质细旺P（胞盛HA的如、、功细且C能菌能on类进。A） 4P8H~A72刺小激时
NOTE：尽量少吸分层液；
6、每管加 PBS 到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。
7、计数：吸弃上清，用100ml PBS重悬细胞，取出20ml加入新的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到计数板内，显微镜下计数。
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
2.
3 H-TdR掺入法 T细胞增殖试验原激胞养腺DD淋素NN活巴经进理液嘧AAβ后入细：中中啶的，胞-S淋加，液核原期进对巴入根体苷，料入刺细据闪3H细(被（细激T胞同烁标胞d摄胞物3位仪被RH记合入)周的素检-有，的T成期应细掺测d丝则DDR进答入胞。N分N掺3H行水A细A，裂入合-明有平胞T原掺法成d显丝。的RC入）原分掺增量o新n作料加裂入则A合为或脱，的，可成合P当同在氧推H细位的培成测胸A

免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。

为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。

参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。

由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。

有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。

分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。

现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。

一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。

本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。

肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。

操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。

（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。

本法的细胞获得率比自然沉降法高。

二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。

B淋巴细胞分离技术

B淋巴细胞分离技术一、实验原理膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。

由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。

B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。

而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。

现将荧光标记SPA法介绍如下：二、实验材料1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。

2 pH值72 Hank s液，含5%小牛血清。

3 淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±00024吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片三、实验步骤1、取肝素抗凝血2ml，用Hank s液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500 r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。

2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。

用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。

3、再用经37℃预热的Hanks液(含5%小牛血清)洗涤离心4、取沉淀细胞滴加在载玻片上，覆以盖玻片，在荧光显微镜下观察。

四、结果观察凡淋巴细胞表面粘附5个以上菌体细胞为SmIg阳性。

一般先用暗视野计算荧光阳性细胞数，继用明视野计算同一视野中淋巴细胞总数。

T细胞增殖试验

二. 淋巴细胞的功能测定技术
（一）体外法 1．淋巴细胞增殖试验（1）T细胞增殖试验（T淋巴细胞转化试验） ① T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞转化染色计数转化细胞百分率 ② T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞转化 + 3H-TdR 测定cpm值 ③ T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞 + MTT 测定OD值
第二节淋巴细胞的检测技术
一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分离密度梯度离心法
(2000rpm,15min)
(密度为1.077)
(二）淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1.E花环分离法：
人T细胞(表达CD2，即E受体）＋绵羊红细胞(SRBC) 形成E花环密度梯度离心，花环细胞沉降于管底裂解 SRBC 获纯化T细胞
4.流式细胞术（flow cytometry, FCM）：荧光素标记抗体＋待检细胞单列经过 FACS分离（荧光素不同）的细胞 * FACS：荧光激活细胞分类仪(fluorescent activated cell sorter)
流式细胞仪
5.磁珠分离术： (1)直接法：免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞通过磁场分离磁珠结合细胞 +解离剂获纯化细胞 (2)间接法：免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细胞 + 抗体通过磁场分离磁珠结合细胞 +解离剂获纯化细胞
划痕法
② 乳酸脱氢酶(LDH)释放法靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞) LDH释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝) 形成甲基化合物(色) 测定OD570值

淋巴细胞分离实验报告

淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。

淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。

本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。

实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。

注意避免气泡的产生。

2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。

离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。

3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。

轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。

此步骤的目的是去除红细胞和血浆。

4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。

注意避免两种液体混合。

离心管中的液体应该形成明显的两层。

5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。

离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。

6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。

加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。

以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。

7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。

8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。

同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。

结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。

在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。

淋巴细胞分层液有两种

淋巴细胞分层液有两种（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。

应用时，用蒸馏水配制9％溶液。

泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。

含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。

应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。

1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：9％聚蔗糖液24份33.9％泛影葡胺液10份混合即可。

必要时，可测比重。

需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，4℃保存。

一般可保存3个月。

（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液10份60％右旋糖酐液12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。

分装于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。

一、淋巴细胞分离人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，根据不同试验有相对纯度，尽最大可能保持细胞应有活性。

分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。

本文介绍常用的密度梯度离心法的原理及方法。

人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为 1.074±0.001。

密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。

常用的分层液有Ficoll，Ficoll是一种合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集，常使用60g/L低浓度溶液（密度1.020）加入泛影葡胺（Hypague），应用浓度为340g/L（密度1.200），以泛影葡胺适当比例与Ficoll混合，可配制成比重合适的细胞分层液（密度1.077±0.001）。

免疫检验第十三讲免疫细胞分离与检测

➢优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。
（2）3H-TdR掺入法
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 ➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。
谢谢！
二、B细胞功能检测溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
(一) 溶血空斑试验
2. 方法学：
➢ 经典溶血空斑形成试验 ➢ 被动溶血空斑试验
➢溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响 ➢评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。
(二) 酶联免疫斑点法
应用与方法学评价：
Th2（IL-4、IL-5、IL-6或IL-10 CD3+CD4+CD30+）
细胞毒性T细胞
Tc1（CD3+CD8+CD30- ) Tc2（CD3+CD8+CD30+）
调节性T细胞
CD4+CD25+调节性T细胞 CD8+调节性T细胞
二、B细胞表面标志 ➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体都是B细胞的重要表面标志，其中以
1.原理：
(一) 趋化功能检测
琼脂糖平板法
1．显微镜检查法：(二)Leabharlann 噬和杀菌功能测定吞噬率 (%)
吞噬细菌的白细胞数 100
计数的白细胞数
杀菌率 (%)胞内含着染菌体数的细 10胞 0 计数的白细胞数
2. 溶菌法
杀菌 (% （ 1 率 )作 3、用 6 0或 0 9m 0菌 in 落） 10 数 0 0m菌 in 落数

T淋巴细胞分离技术

T淋巴细胞分离技术(免疫细胞的分离、纯化和鉴定)免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。

免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。

粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。

有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞＞树突状细胞=抗体产生细胞＞B淋巴细胞＞T淋巴细胞=红细胞。

粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。

葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。

E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。

尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。

一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。

Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。

目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。

ficoll-hypaque 混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。

免疫细胞的分离和检测

第一节中性粒细胞功能的检测 Assays for Polymorphonuclear Function
一、细胞运动功能的检测
（一）体内实验法（二）体外试验法二、吞噬和杀菌功能的检测（一）细胞内杀菌功能的检测
吞噬率 =
吞噬细菌的白细胞数
计数的白细胞数
吞噬细菌总数计数的白细胞数
X 100%
4. 吞噬细胞的功能检测
第一节免疫细胞的分离与纯化 Separation and Purification of Immunocyte
• 实验的目的；
• 所需细胞的种类、纯度和数量； • 方法简便可行，尽量保持活性、纯度和收获率。
一、白细胞的分离
（一）自然沉降法（二）聚合物加速沉降法
某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。
第三节
淋巴细胞功能检测技术
Assays for Lymphocyte
Function
一、T细胞功能检测
（一）T细胞增殖试验
T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，
细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白
质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细
胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁
明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试
密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）
密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）
Percoll (商品名）经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。高速离心后，形成连续密度梯度，可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋巴细胞纯度达98% ，单个核细胞纯度达 78% 。流程长、烦琐、费用高。

免疫细胞分离及检测技术

第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。

因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。

2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。

Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。

操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。

血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。

唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。

其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。

见下图。

图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。

图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。

淋巴细胞亚群流式

淋巴细胞亚群流式
淋巴细胞亚群流式是一种通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群的方法。

流式细胞术是一种用于分析细胞特性和功能的生物技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面和内部标记物进行定量和定性分析。

在淋巴细胞亚群流式中，通过使用特异性抗体标记不同的淋巴细胞亚群，如T细胞、B细胞、NK细胞等，然后利用流式细胞仪对标记后的细胞进行快速分析和计数。

这种方法可以获得淋巴细胞亚群的相对百分比和绝对值，从而评估机体的免疫状态。

淋巴细胞亚群流式在临床诊治中发挥了重要作用。

例如，在白血病诊断和治疗中，通过监测异常淋巴细胞亚群及绝对计数结果，可以为临床初步判断信息提供依据。

同时，在诊疗阶段，更为明确的白血病分型及MRD监测有助于为治疗方案选择、临床疗效分析、预后判断、复发监测等方面提供更加精准的医学决策支持。

此外，在免疫重建过程中，多参数流式细胞术结果对于及时评价患者的细胞免疫功能，指导免疫抑制剂等药品的使用种类和剂量等方面均具有重要价值。

需要注意的是，临床检测都有标准化的检测方案，可以直接上机调用建立好的内置模板，使用比较方便。

流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理及注意事项

流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它通过检测细胞表面和内部分子的存在和数量，从而可以对细胞进行高度特异性的分析和分类。

在临床诊断、生物医学研究以及药物开发等方面都有着重要的应用。

其中，流式细胞术检测淋巴细胞亚群，可以帮助我们更好地了解免疫系统的功能状态，对于免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。

本文将从原理和注意事项两个方面，深入探讨流式细胞术检测淋巴细胞亚群的相关知识。

**一、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理**1. 标本处理流式细胞术检测淋巴细胞亚群的首要步骤是标本处理。

通常情况下，我们会收集外周血进行检测。

在实际操作中，需要抗凝剂进行处理，避免血液凝固，从而保证细胞的完整性。

2. 抗体染色标本处理完成后，接下来是抗体染色。

我们会选择特定的单克隆或多克隆抗体，将其与待检测的淋巴细胞结合。

这些抗体会携带着荧光标记，通过激光的激发，可以将淋巴细胞亚群进行精准识别。

3. 流式细胞分析染色完成后，样本会被注入到流式细胞仪中，通过激光的激发和散射光的检测，可以将不同淋巴细胞亚群进行高效、高速的分析。

在这一步骤中，流式细胞仪会根据荧光信号的强度和特异性来对淋巴细胞进行分类和计数。

4. 数据分析通过计算机对流式细胞仪获取的数据进行分析和解读，我们可以得到淋巴细胞亚群的比例、数量和表达特征等信息，从而更好地了解免疫系统的状态和功能。

**二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的注意事项**1. 样本保存在进行流式细胞术之前，我们需要认真保存样本，避免细胞的损伤和变性。

通常情况下，标本需要在4摄氏度下保存，并尽快进行检测，避免细胞的失活和降解。

2. 抗体选择在进行抗体染色时，需要根据实际情况选择合适的抗体，保证其对于待检测的淋巴细胞具有高度的特异性和亲和性。

还需要注意避免抗体的交叉反应，以免对结果的准确性造成影响。

3. 仪器校准流式细胞仪作为检测设备，需要定期进行校准和质控。

新版流式淋巴细胞亚群检测技术原理

B 细胞
GM-CSF, TGF-
CD8+ 抗原肽+ 感染病毒的 FasL 穿孔素, 粒酶，IFN-, -细胞免疫
CTL I 类分子靶细胞
TNF-, TNF-
T4细胞增高
提醒体内存在细菌等病原微生物感染，主要见于临床多种细菌性感染性疾病。
器官移植发生排斥反应支气管哮喘 SLE活动期某些免疫增强药物旳有效成果注意:昼夜变化（傍晚旳峰值可为上午旳两倍）
常用荧光素
荧光素分子 FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7
激发光波长（nm）
488 488 490 633 488 488
发射光波长（nm）
525 575 675 660 670 755
中文名异硫氰酸荧光素藻红蛋白多甲藻叶绿素蛋白别藻青蛋白藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
药物/放化疗等）急慢性肝炎患者呼吸道感染患者胰岛素依赖型糖尿病患者
谢谢大家！
免疫荧光染色
FCM可检测下列细胞成份：表面标识物胞浆标识物核内标识物可溶性成份
联合CD45旳四色方案
第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色标识，主要能够检测 T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同旳亚群
CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5
T4/T8细胞比值与肿瘤
恶性肿瘤患者术前T4/T8细胞比值低，手术后比值恢复正常
当发生癌转移时,T3、T4细胞数明显降低旳同步T8细胞数明显增多
T4/T8比值明显降低,提醒恶性肿瘤患者晚期细胞免疫功能更低,预后更差
B细胞旳功能
①产生抗体
②提呈抗原 ③免疫调整
B细胞增高

流式细胞术分离法

流式细胞术分离法一实验目的掌握流式细胞术分离T、B细胞的原理与方法。

二实验原理流式细胞术（FCM）是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物微粒等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。

将荧光标记的单克隆抗体加入从外周血液中分离的单个核细胞悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，即可很快的得到T、B细胞及亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞（18×106个细胞/h）的速度分离收集无菌的淋巴细胞，纯度可以达到90％~99％，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。

流式细胞仪由激光光源系统、气控单细胞层流系统、光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。

工作原理为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液在氮气压力下同时进入流室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳定层流，由喷嘴高速射下（1000~5000个细胞/s），与垂直而来的激光束交汇。

在混合细胞中，由于细胞大小、胞内颗粒多少及DNA含量等不同，使激光产生不同的散射，分别由散射光检测器接受；细胞上着染的荧光燃料在激光激发下，发射出荧光，由荧光检测器接收，所有信号自动传送入电子计算机分析处理，迅速获得细胞类群及其数量的信息。

由高频超声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系统，在分析鉴别不同细胞类群的基础上，使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离，最后将细胞分别收集于不同的容器内。

三实验器材1器具恒温培养箱、流式细胞仪、水浴锅、水平式离心机、离心管、冰箱、烘箱、吸管、滴管、微量加样器等。

2 材料RPMI-1640、FITC-抗CD3单克隆抗体（FITC为异硫氰酸荧光素）、CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）、分离单个核细胞所需试剂。

四实验方法1用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107/mL。

实验一外周血淋巴细胞的分离

• 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（ horseradish peroxidase, HRP ）和碱性磷酸酶（ Alkaline phosphatase, AP），它们与抗体结合不影响抗体活性，这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。
Enzyme-linked immunoabsobant assays
融合剂
• PEG： • 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质
双分子层不稳定，引起细胞融合。 • 分子量：1500-2000
HAT选择性培养
HAT: 次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶（thymidine, T）
细胞的DNA生物合成有两条途径：
• 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 • 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。
实验四
B淋巴细胞杂交
杂交瘤的目的 --- 制备单克隆抗体
杂交瘤技术的基本原理
具有分泌抗体功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞. （Hybridoma）
• 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能在HAT选择培养液中生存下来。
实验步骤：免疫脾细胞的制备
处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓瘤细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清 •骨髓瘤细胞:脾细胞为1:10 •一个脾脏可获约108个细胞