生物化学分析课件第1章生物大分子的分离纯化技术
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生物化学实验@层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)
注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（1-2倍床体积）继续 平衡一段时间，以备下步实验使用。
4、蛋白质混合样品的分离
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪 吸取标准蛋白溶液0.5mL ，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓 慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵 （开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后 用3-5mL/10min的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定 A280，自动收集器收集时间为10min每管。最后作出洗脱曲线 （由记录仪完成）。
凝胶层析分离蛋白质
本次试验分两次完成。 1、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。 2、上样分离，打印图谱等。
生物大分子制备方法基本设计思路
流程：选材→破碎→抽提→浓缩→分离纯化 (各种层析技术） →检测纯度（电泳技术） 生化实验三大分离技术： 离心技术 层析技术 电泳技术
层析技术分离生物大分子
二、各类凝胶的结构和性能
1.
葡聚糖凝胶（Sephadex）
SephadexG50、 SephadexG75、 SephadexG100、 2.琼脂糖凝胶（sepharose） Sepharose2B、4B、6B 3.聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel-p）
4、蛋白质混合样品的分离
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面）。打开出水口，使残 余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪 吸取标准蛋白溶液0.5mL ，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓 慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，同时打开恒流泵 （开始收集！），开始记录！待溶液渗入胶床后，关闭出水口， 用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后 用3-5mL/10min的速度开始洗脱，同时用核酸蛋白检测仪测定 A280，自动收集器收集时间为10min每管。最后作出洗脱曲线 （由记录仪完成）。
凝胶层析分离蛋白质
本次试验分两次完成。 1、讲解技术原理，装柱练习，连接装置等。 2、上样分离，打印图谱等。
生物大分子制备方法基本设计思路
流程：选材→破碎→抽提→浓缩→分离纯化 (各种层析技术） →检测纯度（电泳技术） 生化实验三大分离技术： 离心技术 层析技术 电泳技术
层析技术分离生物大分子
二、各类凝胶的结构和性能
1.
葡聚糖凝胶（Sephadex）
SephadexG50、 SephadexG75、 SephadexG100、 2.琼脂糖凝胶（sepharose） Sepharose2B、4B、6B 3.聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel-p）
生物大分子的分离与制备(共89张PPT)
功能基础。随着分子生物学研究的进展，建 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂， 破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。
选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法 。 超声波破碎的有效能量利用率极低 采用快速加热（50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。 但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。
层析法
电泳法
超离心法
透析和超滤
→结晶
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破碎、 溶账和自溶、酶解、化学 处理）
2022/9/24
•盐析（硫酸铵盐析）
•等点电沉淀
•有机溶剂沉淀 •离心
依据原理
• 分子大小 • 溶解度
• 电荷性质 • 吸附性质
• 生物亲和力
胞内物质——破坏细胞壁或细胞膜后提取
细胞破碎的主要方法： 机械破碎 溶胀和自溶 化学处理：如丙酮、氯仿、甲苯、SDS等
生物酶降解
2022/9/24
细胞破碎技术
破碎方式
机械法
非机械法
固体剪切 作用
液体剪切 作用
干燥 处理
珠磨法 压榨 高
压
研磨
匀
2022/9/24
浆
超 酶溶法 声 破 碎
溶胞 作用
选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法 。 超声波破碎的有效能量利用率极低 采用快速加热（50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。 但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。
层析法
电泳法
超离心法
透析和超滤
→结晶
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破碎、 溶账和自溶、酶解、化学 处理）
2022/9/24
•盐析（硫酸铵盐析）
•等点电沉淀
•有机溶剂沉淀 •离心
依据原理
• 分子大小 • 溶解度
• 电荷性质 • 吸附性质
• 生物亲和力
胞内物质——破坏细胞壁或细胞膜后提取
细胞破碎的主要方法： 机械破碎 溶胀和自溶 化学处理：如丙酮、氯仿、甲苯、SDS等
生物酶降解
2022/9/24
细胞破碎技术
破碎方式
机械法
非机械法
固体剪切 作用
液体剪切 作用
干燥 处理
珠磨法 压榨 高
压
研磨
匀
2022/9/24
浆
超 酶溶法 声 破 碎
溶胞 作用
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
2. 透析
自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
生化技术课件1
Fischer Warburg Haworth Kuhn，Karrer Riehard Kuhn Butenandt
德国 德国 英国 瑞士 德国 德国
研究血红素和叶绿素，合成了血红 素 发现呼吸酶及作用方式 用透视式（Haworth式）表示单糖 的环状结构 测定了VB2的结构，阐明了VB2 与 辅酶的关系 研究类胡萝卜素和维生素 发现了性激素
美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码 方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨 酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有 tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家 Khorana提出按预定的序列合成核酸分子的方 法。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。 法国生物学家Lwoff因发现溶原现象， Jacob和生物化学家Monod由于发现操纵子， 而分享1965年诺贝尔生理医学奖。
1945 1946 1947
1947
1948
发现糖代谢中的酶促反应
发明了电泳技术并发现血清蛋白的 组分
1950 1952
Kendall Hench Reichstein
英国生物化学家Sanger还于1953年确定了 牛胰岛素中氨基酸的顺序而获得1958年的诺贝 尔化学奖。 1956年Arthur Kornberg发现了DNA聚合酶I， 美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷 酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信 息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。两人 分享了1959年诺贝尔生理医学奖。
生物大分子分离纯化技术(159页)
沉降a动力学的b等密度的流体动力流体动力流体动力流体动力机械作用静电引力静电引力静电引力静电引力静电引力电动力静电引力电动力渗透力流体动力温度梯度重力结晶格子能重力离心力离心力表面能范德瓦氏力位阻效应静电引力极化度分子筛效应扩散偶极作用缔合和解离效应渗透作用渗透缔合和解离效应分子摩擦力极化度动电作用分子摩擦力极化度动电作用表面能分子筛效应分子摩擦效应分子筛效应电动力分子筛效应分子筛效应表面能吸附分子摩擦效应扩散分子摩擦效应f2f2f2f2f2f1f1f1和和f2平衡作用f1f1和和f2f2f2f2f1f1平衡作用极性位阻因素离子性质分子大小极性因素分子大小极性因素离子性质离子性质离子性质分子大小离子性质离子性质分子大小离子性质分子大小分子大小分子大小分子大小形状分子大小分子大小介质密度细胞外液细胞内液发酵液预处理细胞分离细胞破碎碎片分离提取精制成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀重结晶浓缩调ph离心研磨法双水相吸附离子交换干燥絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌过滤超滤膜分离成型结晶图11生物工业下游技术一般工艺过程三
（5）生物大分子分离方法多采用温和的 “多阶式”方法进行。 一个生物分子的分离制备常常少则 几个，多至十几个步骤，并不断变换各 种分离方法，以达到纯化目的。
（6）对其均一性的评定常常是有条件的Leabharlann Baidu 与化学上纯度的概念并不完全相同。
（7）严格防止污染。 外界污染、 体系中重金属离子、 细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。
（5）生物大分子分离方法多采用温和的 “多阶式”方法进行。 一个生物分子的分离制备常常少则 几个，多至十几个步骤，并不断变换各 种分离方法，以达到纯化目的。
（6）对其均一性的评定常常是有条件的Leabharlann Baidu 与化学上纯度的概念并不完全相同。
（7）严格防止污染。 外界污染、 体系中重金属离子、 细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。
生物化学及分子生物学人卫第八版常用分子生物学技术的原理及应用公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件
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25～30 次循环后，模板DNA含量能 够扩大100万倍以上。
第15页目录
PCR体系基本构成成份
• 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • Mg2+
第16页目录
PCR基本反应环节
变性Байду номын сангаас95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
第17页目录
二、PCR技术主要用途
第29页目录
DNA序列自动分析原理及结果图
蓝色
绿色 荧光
红色 荧光
荧光
ddG ddA
ddC
ddT
黄色 荧光
电泳
第30页目录
第四节
基因文库
Gene Library
第31页目录
基因文库(gene library) 是指一个包括了某一生物体所有DNA序列
克隆群体。 • 基因组DNA文库 (genomic DNA library) • cDNA文库(cDNA library)
有类似表型突变酵母，能够恢复(rescue) 正常表型片段中所含有基因即可能为致病基 因。这种试验称为功效互补试验 (functional complementation assay)。
Nucleic Acid Sequence Analysis
分子生物学 第一章 绪论 PPT课件
对人类而言： 22+X+Y+mtDNA
基因组
• 一个生物的所有基因 • 一套完整单体的遗传物质总和 • 人类基因组计划
Human Genome Project,HGP
人 于1990年正式启动 类 识别人类DNA中所有基因 基 测定人类DNA的30亿碱基对的序列 因 将这些信息储存到数据库中 组 开发出有关数据分析工具
型，搞清楚了生物遗传的分子机制 3. 60年代，确定了遗传信息的传递方式：
DNA→RNA→protein
1.DNA is the genetic material
DNA is the genetic material
The genetic material of phage T2 is DNA.
诺贝尔生理和医学奖
诺贝尔生理和医学奖
诺贝尔化学奖 诺贝尔生理和医学奖
1975年 D.Baltimore 逆转录酶，DNA病毒
诺贝尔生理和医学奖
H.M.Temin
R.Dolbeco
1978年 W.Arber
DNA限制性内切酶
诺贝尔生理和医学奖
D.Nathens
H.O.Smith
1980年 P.Berg
1.准备和酝酿阶段 蛋白质 DNA
2.建立和发展阶段 中心法则 蛋白质结构与功能
3.深入发展阶段 重组DNA技术 基因组研究 基因表达调控 细胞信号转导
生物化学分离技术
生物化学分离技术
生物化学分离技术是一种利用生物化学原理和方法实现物质分离的
技术。它充分利用了生物分子的特异性、活性和稳定性，在分离、纯
化和制备生物活性物质方面具有独特优势。本文将分别介绍凝胶电泳、层析技术和亲和层析技术这三种常见的生物化学分离技术，并讨论它
们的原理、应用和发展前景。
一、凝胶电泳
凝胶电泳是一种利用凝胶作为电泳介质、电场作用下生物大分子迁
移的技术。凝胶的作用是将待测样品分离开来，可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或者琼脂糖-聚丙烯酰胺复合凝胶等。凝胶电泳通常分
为蛋白质凝胶电泳和核酸凝胶电泳。
凝胶电泳的原理是根据生物大分子在电场作用下的电荷、尺寸和形
状的不同，通过凝胶的孔隙大小和分子间的互作用力来实现分离。具
体操作时，待测样品被加载到凝胶的孔隙中，然后施加电压使其迁移。当样品达到凝胶中孔隙的尺寸限制时，分子便停止迁移。
凝胶电泳在生物化学领域具有广泛的应用。在蛋白质分析中，它可
以用于鉴定、定量和比较不同样品中的蛋白质成分；在核酸分析中，
可以用于测定DNA或RNA的大小、纯度和含量。此外，凝胶电泳还
可以用于分离和检测细胞内代谢产物、药物和毒素等。随着生物技术
的快速发展，凝胶电泳技术也在不断更新和改进，例如多色荧光标记
技术和二维凝胶电泳技术等，进一步拓展了其应用范围。
二、层析技术
层析技术是一种基于物质在固定相和流动相之间的分配差异进行分
离的技术。固定相可以是凝胶、树脂、硅胶等。根据操作方式和固定
相类型的不同，层析技术可分为分离层析、亲和层析、离子交换层析
等多种形式。
层析技术的操作原理是：根据分离成分在固定相和流动相之间分配
生物分子的分离纯化课件
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
• 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失， 样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后 续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。
• 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法， • 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
细胞 细胞悬液 红细胞 细菌、病毒
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
影响提取效果的因素
（1）pH值 （2）盐浓度（即离子强度） （3）温度 （4）水解酶 （5）搅拌与氧化 （6）有机溶剂
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子 的污染应降至最低程度；
3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时 应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
保持核酸的完整性
在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对 核酸的破坏。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
• 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失， 样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后 续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。
• 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法， • 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
细胞 细胞悬液 红细胞 细菌、病毒
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
影响提取效果的因素
（1）pH值 （2）盐浓度（即离子强度） （3）温度 （4）水解酶 （5）搅拌与氧化 （6）有机溶剂
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子 的污染应降至最低程度；
3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时 应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
保持核酸的完整性
在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对 核酸的破坏。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物大分子分离纯化-原理与技术
检测柱效 检测分离度 减少上样体积 降低流速 使用更小的介质颗粒的介质 连接2根层析柱
34精品课件
2020/8/16
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的应用
• 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白
质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分 开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30
Bio-Beads S-X介质——
中草药和天然产物活性成分分离纯化
高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、 杂环化合物
多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体
Bio-Beads S-X1
600
14,000
Bio-Beads S-X3 Bio-Beads S-X8 Bio-Beads S-X12
1,000 400
31精Байду номын сангаас课件
MacroPrep Methyl HIC
MacroPrep t-Butyl HIC
Profinity IMAC Profinity Epoxide Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel, DEAE, CM Affi-Prep Polymixin Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化
95% water
34精品课件
2020/8/16
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的应用
• 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白
质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分 开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30
Bio-Beads S-X介质——
中草药和天然产物活性成分分离纯化
高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、 杂环化合物
多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体
Bio-Beads S-X1
600
14,000
Bio-Beads S-X3 Bio-Beads S-X8 Bio-Beads S-X12
1,000 400
31精Байду номын сангаас课件
MacroPrep Methyl HIC
MacroPrep t-Butyl HIC
Profinity IMAC Profinity Epoxide Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel, DEAE, CM Affi-Prep Polymixin Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化
95% water
生物化学分离技术及其应用
生物化学分离技术及其应用生物化学分离技术是一种将生物大分子分离出来的技术，常用于分离纯化药物、蛋白质和核酸等生物大分子。随着生物技术的发展，越来越多的分离技术被开发出来，这些技术有着不同的原理和应用场景。
一、用于分离和纯化蛋白质的方法
1. 电泳分离
电泳分离是一种将带电的分子通过电场力进行移动，从而实现分离的方法。电泳分离方法广泛应用于蛋白质、核酸等分子的分离和纯化。电泳分离蛋白质最常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，其原理是将蛋白质样品分别加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，使各种不同大小、极性、电荷和形态的蛋白质分子在凝胶内向阳极移动，从而实现蛋白质的分离。
2. 亲和层析法
亲和层析法是利用配体和其所结合的分子生物学机制，以非共
价结合的方式对大分子进行分离纯化的一种方法。亲和层析法可
以通过将具有亲和作用的色谱柱或磁珠与待分离蛋白质成分接触，利用其亲和力选择性地结合蛋白质分子并进行分离纯化。亲和层
析法采用的配体有：抗体、亲和标记、染色体蛋白、金属离子等。
3. 透析分离
透析法是以溶液之间的浓差梯度为基础的一种分离方法。通过
将混合物放置在半透膜中，利用醋酸纤维与传统透析溶液接触，
从而达到由浓的向稀的透析的效果。因为大分子转移速度慢，所
以可以通过膜孔径和物质浓度调节，使大分子停留在较短的时间
内完成透析和分离。
二、用于分离和纯化核酸的方法
1. 凝胶电泳法
凝胶电泳法是在凝胶中进行电场分离的方法，凝胶由聚合物
（如琼脂糖和聚丙烯酰胺）通过交联形成，可以将分子依据大小
和电荷进行电泳分离。凝胶电泳法可以分离不同长度的核酸分子，并且可以通过染色体以及电泳过程中加入的荧光剂，来观察到分
2019_2020学年高中生物第4章生物化学与分子生物学技术实践第1节生物成分的分离与测定技术课件苏教版选修1
3.凝胶色谱法分离血红蛋白 (1)样品处理：以低速短时间离心分离红细胞，获得被洗净的红 细胞。 (2)血红蛋白的释放、分离和透析 ①用蒸馏水和甲苯破裂红细胞，释放出血红蛋白，得到混合液。 ②离心混合液，过滤除去沉淀层，用分液漏斗分离出红色透明 液体。 ③用磷酸缓冲液透析红色透明液体 12 h。
(3)凝胶的制备：用蒸馏水溶胀交联源自文库萄糖凝胶，制成凝胶悬浮 液。
(2)分类：根据蒸馏过程中原料放置的位置，可以将水蒸气蒸馏 法划分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。
(3)适用范围：适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破 坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分 的沸点多在 100 ℃以上，并在 100 ℃左右有一定的蒸气压。中药的 挥发油、某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱以及某些小分 子的酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏。
2．水蒸气蒸馏装置的安装 (1)正确安装蒸馏装置 ①固定热源——酒精灯。 ②固定蒸馏瓶，保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。 ③安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。 ④连接冷凝管，保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连； 下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。
⑤连接接液管(或称尾接管)。 ⑥将接收瓶瓶口对准接液管的出口。 ⑦将温度计固定在蒸馏瓶瓶口处，使温度计水银球的上限与蒸 馏瓶侧管的下限处在同一水平面上。
⑤冷凝管中水流方向：从下方进水，上方出水，与蒸气流向相 反。
生物大分子的分离纯化技术
（2） pH值
蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与 pH 值有关。过 酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内.
偏离等电点 碱性— pH<pI 酸性– pH>pI
（3） 温度 低温有利(一般0-4℃)，但有例外,丙酮酸羧化酶(25 ℃)
(4)水解酶：
细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的 蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致 蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑 制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶 丧失活性。 如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采用 68％的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调节），在13－15℃抽 提3h，可得到较高的回收率。因为68％乙醇可使胰蛋白酶暂 时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂Ca2+，酸性环境也抑制 酶蛋白活性。 RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高，很 容易使RNA降解，所以每一步都严格控制RNase，可采用DEPC （焦碳酸二乙脂）处理，带手套操作，提取液中加强的变性 剂异硫氰酸胍等措施。
1.动物组织：
选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织 为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和 脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时， 这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但 几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。 脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原 料变质影响纯度操作和制品的率。常用的脱脂方法有：人工 剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮， 乙醚）中脱脂；采用快速加热（50℃左右），快速冷却的方 法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。
生物化学PPT课件
光 学 异 构
手性碳原子引起。 1个手性碳原子上 相连的各原子或基团 的空间排布有两种， 互为镜像，称为对映
体。
对映异构体化学性质几乎完全相同，但使 偏振光的平面旋转相反地方向，但角度相 同。
具有n个手性碳原子的分子，有2n个立体异构体
构 象 异 构
• 由于C–C单键的旋转，使分子中其余原子或基团 的空间取向发生改变，从而产生种种可能的有差 别的立体形象，这种现象称为构象异构。
内容分布
2.实验部分(24学时）
实验 (共6个实验)
推导性或计算性的内容较少，因此，它不同于 理科而更近似于文科，记忆的东西多，巧妙记 忆成为学好生化的一个重要方法。
课程特点：概念性、描述性的内容居多，
要求：
认真听讲，做好笔记。 课后复习，及时消化。 最好能预习一下
参考书目
1.《生物化学》王镜岩，全面，繁多，不易懂。 2. Lehninger ：Principles of Biochemistry 3. Stryer：Biochemistry 国际通用的最佳生化教材，全面，图多。
• 生物体系存在两类不同水平的作用力： • 一类是生物元素借以结合成为生物分子的 强作用力--共价键。 • 另一类是决定生物分子高层次结构和生物 分子之间借以相互识别、结合及作用的弱 作用力--非共价相互作用（次级键）。
非共价作用力
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要求：除要求分离方法简便，选择性好，效率高外，还必须能够尽可 能保持生化物质的生物活性（分子结构与构型）；通常要求低温、洁 净、温和（溶剂、pH等）的条件。
2020/8/1
第1章 生物大分子的分离纯化技术（3）
生物大分子分离纯化的的一般步骤：
确定目标生物大分子的用途，科研、开发还是要发现新的物质； 建立相应且可靠的分析测定方法（关键）； 通过文献调研和预备性实验，掌握目标生物大分子的物理化学性质； 生物材料的破碎和预处理； 分离纯化方案的选择和探索（最困难的过程）； 生物大分子制备物均一性（即纯度）的鉴定。要求达到一维电泳一条
生物化学分析课件第1章生物大分子的分离纯化技术
Biochemical Analysis
生化分析源于生命科学的蓬勃发展，是分析化学第三次变革（20世纪 70年代）的产物，属于分析化学的分支。
相对于分析化学（测量和表征物质的组成和结构的学科），生 化分析主要侧重于：Bio-related, in situ(原位) , in vivo(活体), real time(实时), non-destructive(无损), single molecular and single cell level analysis as well as techniques of characteristics of biomoleculars. 本课程涉及内容 生命活性物质（蛋白质、核酸、氨基酸、糖、酯等）的分析 利用生物化学技术（酶法、免疫、核酸杂交等）进行的分析 生物大分子的分离纯化技术（沉淀、膜、离心、层析、电泳等）
2020/8/1
先修课程及参考书
先修课程
仪器分析、生物化学、物理化学（动力学部分）
参考书
生化分析，李元宗，高教出版社，2003 Analytical Biochemistry(3rd Edition), D J Holme, 世界图书出版社, 1999 Bioanalytical Chemistry, Susan R. Mikkelsen, John Wiley, 2004 生命分析化学，汪尔康，科学出版社，2006
学时 3 3 6 6 6 3 5 4 4 4 4
周次 1 2
3~4 5~6 7~8
9 10~11
11~14 分组 进行
考试方式及成绩评定
期末考试
时间：第14周 方式：开卷 题型：选择、填空、计算、问答
成绩评定
平时成绩（出勤）：10% 实验成绩：40% 考试成绩：50%
2020/8/1
第1章 生物大分子的分离纯化技术（1）
光等分光光度法）、气相色谱和液相色谱法、电泳法、核磁共 振及质谱法等。 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速 、简便。
2020/8/1
3. 生物大分子的物理、化学性质
在水和各种有机溶剂中的溶解性； 在不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性； 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性； 各种物理性质如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电
2020/8/1
Analytical techniques the key to life Science
研究生命现象、了解生命本质和生命过程是现代自然科学发展过程中 的基本问题之一。 随着科技的不断发展，科学家们已开始着手从分子水平来研究生命过 程，如：生命的本质是什么？从无生命如何产生生命，从细胞到整体 生物，由生到死的生命过程中事件是如何发生？生命的起源和进化， 进化的动因是什么？生物如何对环境中的有毒有害物质作出应答？生 物如何复制自身，如何传递信息等等。 目前已对上述重要问题有了一定的认识（其中分析技术起到了关键性 的作用），但远未解决，因此这将是今后重要的研究领域，分析化学 将大有作为。
带、二维电泳一个点或HPLC和HPCE都是一个峰； 产物的浓缩，干燥和保存。
2020/8/1
2. 生物大分子的分析测定方法
可分为生物学和物理/化学测定方法 生物Βιβλιοθήκη Baidu测定方法：酶的各种测活方法、免疫化学方法、蛋白质
含量的各种测定法和放射性同位素示踪法等； 物理/化学测定方法：比色法、光谱法（紫外/可见、红外和荧
2020/8/1
21世纪生命科学领域的热点
——分析化学家面临的挑战
生命的基础物质研究：研究、发现新的生命活性物质；阐明大分子的 高级组装结构 遗传物质的作用：垃圾DNA（不编码蛋白质的DNA，约占基因组的 0%）的作用；为什么人体蛋白质中的氨基酸都是L构型，这与遗传 物质间有什么关系？等等 酶结构和酶催化功能的关系研究 脑科学：神经细胞的信息传递功能及大脑的学习、记忆和思维功能等 的研究 从分子到细胞：无生命的分子是如何跨越一个鸿沟变成生物系统的（ 如细胞）？即分子以上细胞以下这个层次的研究 基因（蛋白质、金属、代谢物）组学的研究
2020/8/1
授课内容及学时分布
理论课 32学时
实验课 16学时
2020/8/1
授课内容 生物大分子分离纯化技术 电泳 酶法分析 免疫分析 氨基酸、蛋白质分析 酯的分析和糖的分析 核酸分析和流动注射分析 过氧化物酶的米氏常数测定 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 酶联法测定血清中葡萄糖的含量 脱辅基血红蛋白的制备与重组
蛋白质、酶、核酸与多糖等生物大分子是生命现象的基本体现者，其 结构与功能的研究，对于了解生命活动规律，阐明生命现象本质，指 导工业生产和医药实践，以致整个自然科学都有着重大的理论和实践 意义。 生物大分子结构与功能的研究，是以能够达到足够纯度的生物大分子 的制备工作为前题，否则就无从谈起。 随着生命科学飞速发展对各种专一的工具酶、基因载体质粒、基因片 段等生物制品的需求，使得从各种来源的生物材料中分离、制备各种 规格的大分子并采用高特性方法进行快速灵敏的测定成为一个非常迫 切的要求。
2020/8/1
第1章 生物大分子的分离纯化技术（2）
生物大分子分离纯化的特点与要求
特点：生物材料组成极其复杂，常包含几百乃至几千种化合物； 许多生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤繁多；许多生物大分 子离开生物体内的环境时极易失活，如何防止分离过程中失活是生物 大分子提取制备最困难之处；生物大分子的分离纯化几乎都是在溶 液中进行，温度、pH值、离子强度等参数的综合影响难以准确估计 和判断。
2020/8/1
第1章 生物大分子的分离纯化技术（3）
生物大分子分离纯化的的一般步骤：
确定目标生物大分子的用途，科研、开发还是要发现新的物质； 建立相应且可靠的分析测定方法（关键）； 通过文献调研和预备性实验，掌握目标生物大分子的物理化学性质； 生物材料的破碎和预处理； 分离纯化方案的选择和探索（最困难的过程）； 生物大分子制备物均一性（即纯度）的鉴定。要求达到一维电泳一条
生物化学分析课件第1章生物大分子的分离纯化技术
Biochemical Analysis
生化分析源于生命科学的蓬勃发展，是分析化学第三次变革（20世纪 70年代）的产物，属于分析化学的分支。
相对于分析化学（测量和表征物质的组成和结构的学科），生 化分析主要侧重于：Bio-related, in situ(原位) , in vivo(活体), real time(实时), non-destructive(无损), single molecular and single cell level analysis as well as techniques of characteristics of biomoleculars. 本课程涉及内容 生命活性物质（蛋白质、核酸、氨基酸、糖、酯等）的分析 利用生物化学技术（酶法、免疫、核酸杂交等）进行的分析 生物大分子的分离纯化技术（沉淀、膜、离心、层析、电泳等）
2020/8/1
先修课程及参考书
先修课程
仪器分析、生物化学、物理化学（动力学部分）
参考书
生化分析，李元宗，高教出版社，2003 Analytical Biochemistry(3rd Edition), D J Holme, 世界图书出版社, 1999 Bioanalytical Chemistry, Susan R. Mikkelsen, John Wiley, 2004 生命分析化学，汪尔康，科学出版社，2006
学时 3 3 6 6 6 3 5 4 4 4 4
周次 1 2
3~4 5~6 7~8
9 10~11
11~14 分组 进行
考试方式及成绩评定
期末考试
时间：第14周 方式：开卷 题型：选择、填空、计算、问答
成绩评定
平时成绩（出勤）：10% 实验成绩：40% 考试成绩：50%
2020/8/1
第1章 生物大分子的分离纯化技术（1）
光等分光光度法）、气相色谱和液相色谱法、电泳法、核磁共 振及质谱法等。 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速 、简便。
2020/8/1
3. 生物大分子的物理、化学性质
在水和各种有机溶剂中的溶解性； 在不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性； 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性； 各种物理性质如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电
2020/8/1
Analytical techniques the key to life Science
研究生命现象、了解生命本质和生命过程是现代自然科学发展过程中 的基本问题之一。 随着科技的不断发展，科学家们已开始着手从分子水平来研究生命过 程，如：生命的本质是什么？从无生命如何产生生命，从细胞到整体 生物，由生到死的生命过程中事件是如何发生？生命的起源和进化， 进化的动因是什么？生物如何对环境中的有毒有害物质作出应答？生 物如何复制自身，如何传递信息等等。 目前已对上述重要问题有了一定的认识（其中分析技术起到了关键性 的作用），但远未解决，因此这将是今后重要的研究领域，分析化学 将大有作为。
带、二维电泳一个点或HPLC和HPCE都是一个峰； 产物的浓缩，干燥和保存。
2020/8/1
2. 生物大分子的分析测定方法
可分为生物学和物理/化学测定方法 生物Βιβλιοθήκη Baidu测定方法：酶的各种测活方法、免疫化学方法、蛋白质
含量的各种测定法和放射性同位素示踪法等； 物理/化学测定方法：比色法、光谱法（紫外/可见、红外和荧
2020/8/1
21世纪生命科学领域的热点
——分析化学家面临的挑战
生命的基础物质研究：研究、发现新的生命活性物质；阐明大分子的 高级组装结构 遗传物质的作用：垃圾DNA（不编码蛋白质的DNA，约占基因组的 0%）的作用；为什么人体蛋白质中的氨基酸都是L构型，这与遗传 物质间有什么关系？等等 酶结构和酶催化功能的关系研究 脑科学：神经细胞的信息传递功能及大脑的学习、记忆和思维功能等 的研究 从分子到细胞：无生命的分子是如何跨越一个鸿沟变成生物系统的（ 如细胞）？即分子以上细胞以下这个层次的研究 基因（蛋白质、金属、代谢物）组学的研究
2020/8/1
授课内容及学时分布
理论课 32学时
实验课 16学时
2020/8/1
授课内容 生物大分子分离纯化技术 电泳 酶法分析 免疫分析 氨基酸、蛋白质分析 酯的分析和糖的分析 核酸分析和流动注射分析 过氧化物酶的米氏常数测定 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 酶联法测定血清中葡萄糖的含量 脱辅基血红蛋白的制备与重组
蛋白质、酶、核酸与多糖等生物大分子是生命现象的基本体现者，其 结构与功能的研究，对于了解生命活动规律，阐明生命现象本质，指 导工业生产和医药实践，以致整个自然科学都有着重大的理论和实践 意义。 生物大分子结构与功能的研究，是以能够达到足够纯度的生物大分子 的制备工作为前题，否则就无从谈起。 随着生命科学飞速发展对各种专一的工具酶、基因载体质粒、基因片 段等生物制品的需求，使得从各种来源的生物材料中分离、制备各种 规格的大分子并采用高特性方法进行快速灵敏的测定成为一个非常迫 切的要求。
2020/8/1
第1章 生物大分子的分离纯化技术（2）
生物大分子分离纯化的特点与要求
特点：生物材料组成极其复杂，常包含几百乃至几千种化合物； 许多生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤繁多；许多生物大分 子离开生物体内的环境时极易失活，如何防止分离过程中失活是生物 大分子提取制备最困难之处；生物大分子的分离纯化几乎都是在溶 液中进行，温度、pH值、离子强度等参数的综合影响难以准确估计 和判断。