PCR污染的产生及防治

合集下载

PCR实验室污染与对策

PCR实验室污染与对策PCR（Polymerase Chain Reaction）实验室是进行核酸分析和生物学研究的重要场所。

然而，由于PCR实验室使用高灵敏度的技术，可能会受到外源性DNA污染的影响，导致结果的失真甚至错误。

因此，PCR实验室污染的问题需要引起重视，并采取相应的对策来减少对实验结果的影响。

外源性污染主要指的是在实验室环境中引入外部DNA污染源。

这些污染源可能包括实验室用具（如罗氏管、管盖、显微镜片等）、实验材料（如引物、模板DNA等）、工作人员（如手部皮肤上的DNA）以及空气中的微生物等。

为了减少外源性污染，可以采取以下对策：1.消毒和清洁实验室：实验室应定期进行彻底的清洁和消毒，包括工作台、工具和设备等。

使用消毒剂对工作台和设备进行彻底的消毒，防止污染源的交叉感染。

3.使用无DNA污染的试剂和材料：选用经过严格筛选和检测的PCR试剂和材料，确保其无DNA污染。

同时，使用专门为PCR实验设计和包装的罗氏管和管盖，减少外源性DNA污染的可能。

4.严格的实验室操作规范：建立和执行严格的实验室操作规范，包括实验室的通风设施、培训工作人员、制定标准操作流程等。

工作人员应按照规范操作，遵守实验室操作规程，确保实验的准确性和可靠性。

内源性污染是指实验过程中引入的内源性DNA污染。

内源性污染通常是由前一PCR扩增反应的产物污染了下一PCR反应。

1.严格控制实验操作的顺序：按照从低到高浓度的样品进行PCR扩增。

首先进行阴性对照，检测PCR反应体系中是否存在污染。

然后进行低浓度样品的扩增，最后进行高浓度样品的扩增，以减少内源性污染的可能。

2.应用反转录酶酶和RNA不是DNA模板：在RNA模板的PCR扩增反应中，可以使用反转录酶酶将RNA转录成cDNA。

由于RNA是DNA的模板，反转录过程不会引入外部DNA污染，从而减少内源性污染的可能。

3.使用消除污染酶：在每一PCR扩增反应中加入消除污染酶，可以在扩增反应结束后对DNA污染进行降解。

PCR实验中如何避免和减少污染的可能性

PCR实验中如何避免和减少污染的可能性PCR实验是基于核酸水平的微观样本实验，而这些微观样本对温度、ph值等实验环境非常敏感，在尽力维护样本的保存环境的同时，核酸样本污染也成为不可避免的话题。

“易查不易察”，污染来的悄无声息，今天未名雷蒙特就给大家简单介绍一下PCR实验中如何避免和减少污染的可能性。

PCR实验室的防污染方法：1、合理的实验室分区：试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品，包括移液器等器具应专用，空气、物品流向依次为：试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区，不可逆行。

2、清洁的实验用品：实验室自配试剂（去离子水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。

枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。

3、正确的实验操作：实验应在超净工作台内进行，工作台内应放置PCR专用的微量离心机、各量程的移液器和其他必须物品。

实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换，在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区交叉污染。

装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或加样器的风险；谨慎开启反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。

吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行，遵守“慢吸快打”原则，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以避免气溶胶产生的交叉污染。

PCR试剂建议小量分装，以减少反复冻融、重复取样次数；多样本PCR反应时，先配制反应混合液分装至反应管中，最后加入样本核酸，请勿同时开盖，尽量保证单人单管，实现完全闭管操作。

实验试剂应与样品和PCR产物分开保存，不应放于同处。

PCR扩增实验完成后及时将反应管取出，用一次性手套将产物反应管包裹丢弃，保证管盖紧闭。

4、规范的实验设计：应遵循实验室内部质量控制的相关规定，实验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，全程质控实验过程，验证PCR反应的可靠性，并协助判断扩增系统的可信性。

荧光PCR定量质量控制及防污染措施

荧光PCR定量质量控制及防污染措施解放军第三0⼆医院王海滨写在课前的话近⼏年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越⼴泛。

但是如何进⾏治疗控制以及出现污染后怎样进⾏清除污染？本⽂主要讲述怎样来防⽌污染的产⽣。

⼀、荧光PCR定量的概述（⼀）荧光PCR定量的原理实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加⼊荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进⾏定量分析的⽅法。

常规的PCR也就是电泳PCR，它是合成⼀个正向引物和反向引物为⽬的模板，即DNA或RNA作为⼀个模板扩增，扩增后通过跑电泳的⽅式来检测它存在与否，是相对量的变化。

由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的⼏率⽐较⾼。

近⼏年 PCR 扩增时在参⼊⼀对引物的同时参⼊单个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时， Taq 酶的5'端～3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增⼀条 DNA 链，就有单个荧光分⼦构成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物构成完全同步。

通过荧光物质参⼊和TapMan探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增到检测都在⼀个封闭的状态。

荧光集团⽬前临床常⽤的有两个，⼀个是SYBR green，⼀个是TapMan探针。

SYBR green是⼀类荧光染料，能与所有的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针。

变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。

在扩增的过程中由变性到负性扩出了另⼀条链和模板DNA进⾏退⽕变成双链。

这时SYBR green染料与 DNA 双链结合,发出荧光信号。

⽤SYBR green荧光染料来作为指⽰剂时，中间要加⼀个溶解曲线来证实它的特异性的问题。

动物疫病PCR检测实验室的污染与对策

动物疫病PCR检测实验室的污染与对策动物疫病PCR检测实验室在进行病原体检测过程中容易出现污染，这可能会导致检测结果不准确，进而影响动物疫情的判断与控制。

为了保证实验室的环境和操作符合规范，降低PCR检测的污染风险，需要采取一系列的对策。

实验室的环境卫生应保持良好。

实验室应该定期进行清洁消毒，确保实验台面、设备、试剂和容器都处于干净的状态。

尤其是PCR试剂和消耗品等易受污染的物品，应妥善保存并定期更换。

空气质量也应受到关注，使用合适的空气过滤系统来减少病原体传播的风险。

实验人员应该接受专业的培训，熟悉PCR检测技术的操作规范。

操作人员应该穿戴适当的防护装备，如实验服、手套和口罩，以减少人员对样品的污染。

实验操作应该遵循严格的无菌操作原则，尽量减少无关的操作步骤，避免引入外源性污染。

样品处理应当细心。

在样品分离和提取过程中，应避免样品的交叉污染，使用单次性的组织研磨器和离心管以减少样品污染的风险。

对于已经提取的核酸样品，要避免反复冻融，以免引入附加的污染。

第四，引物和探针的设计应当合理。

应选择特异性高、不易产生引物二聚体和无特异扩增的引物和探针，以减少PCR反应中的非特异性信号。

引物和探针的制备和使用应遵循规范操作，避免交叉污染。

第五，实验室应建立正样品和负样品的对照系统。

每批样品包括正样品和负样品，正样品是已知含有病原体的样品，负样品是无病原体的样品。

严格控制对照样品，包括引物和探针的批次，可有效减少实验操作带来的污染。

第六，实验室应定期进行质量控制和验证。

包括针对实验室的空白对照、使用纯水作为模板的对照以及正样品的复核等。

这将有助于检测潜在的污染源并排除错误结果。

实验室应建立污染事件的记录和处理制度。

一旦发现实验室的污染事件，应立即采取措施进行清理、消毒，并对受影响的样品进行重测。

同时对涉事人员进行追踪和教育，防止类似事件再次发生。

动物疫病PCR检测实验室的污染是需要高度关注的问题。

通过加强实验室环境卫生、提高实验操作的规范性和设计合理的引物探针，采取全面的质控和验证措施，可以有效降低PCR检测的污染风险，提高检测结果的准确性和可靠性。

PCR反应的污染与预防污染的措施20191204

主混合物
Mg2+
和
或
Mn2+
和
dCTP dGTP dUTP dATP
Taq DNA 多聚酶 rTth DNA 多聚酶
AmpErase 生物素标记的引物
标准实验室的组成及其功能（2）
• 标本处理区（ Sample processing laboratory）：标本的保存，目的核酸的提取、贮存，目的核酸的添加以及cDNA的合成。
标准品的稀释(管子离心后5min打开,以避免气溶胶的产生。不能剧烈振荡标准品与阳性对照) • (4)正确使用微量加样器 • (5)定期用10%的次氯酸钠清洁微量加样器与工作台面 • (6)换气设备应正常工作.
2.酶法防止PCR产物的遗留污染
• 限制性核酸内切酶法。
• 修饰引物，使扩增产物被某种酶切割。
DNA 衍生化，这些加合物可防止污染的 DNA作为反应的底物。
1. 各实验室绝对独立 2. 有独立的进风口与出风口
标准实验室的组成及其功能（1）
• 前PCR区（Pre-PCR laboratory）：又称试剂贮存与准备区，用于试剂的制备、分装、贮存以及配制PCR反应的“主混合物”
• UNG消解法
UNG（脲嘧啶DNA糖基化酶）消解法原理
• 1）在PCR反应体系中加入UNG，并用dUTP替代dTTP，扩增产物含有dUTP 。
• 2）UNG可以去除遗留污染DNA中的dU， DNA聚合酶会在这些位点处停滞。
• 3）无dU的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂。
以dUTP替代dTTP的PCR扩增产物，“ ”表示dUTP
Target RNA or DNA

PCR实验室的污染与对策

（五）体会
PCR检测过程中，防止污染是很重要的一项工作。只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应特别注意反应体系被痕量DNA模板污染，这是造成假阳性最大的可能。
通常我们对PCR实验室污染的预防是采取不同操作分区进行、分装试剂、改进实验操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭或浸泡、紫外线照射等。而对于实验室的通风方面没有给予足够的重视，
PCR实验室的污染与对策
河北医科大学第三医院冯忠军
PCR技术是一种体外核酸扩增技术，模拟自然DNA复制过程，通过重复高温变性、低温退火、中温延伸等简单的3 个温度循环，将靶DNA扩增数百万倍，显示极高的敏感性。
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
将两种批号的HBV试剂拿到其他规范的PCR实验室检测，也显示试剂没有问题。
该实验室用消毒液擦拭工作台面后，打开所有的紫外灯照射一天，将所使用加样器、离心管、Tip头、手套、记号笔、记录本等都更换掉，再将标本进行检测，结果全部标本仍然为“阳性”。
第二天，仍然用消毒液擦拭工作台面后，再打开所有的紫外灯照射一天，将HBV 标本重新检测，同时设臵了两个阴性对照 (A和B)，
据计算，一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
三、PCR实验室污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染、什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.
PCR实验，不在于能否扩增出目的片段（阳性结果）来，而是在于是不是有重复性以及有没有设臵对照。
仅含扩增反应混合液的对照管的功能：
☻监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性。

PCR注意事项

PCR操作规程1. PCR试剂要做好预混和分装：所有的PCR试剂都应进行小量分装，PCR反应液应尽可能预先配制好，然后再小量分装，在-20℃下保存，以减少重复加样次数，从而避免污染机会。

另外，PCR试剂、PCR反应液应当与样品及PCR产物分开保存，不可放于同一冰盒或冰箱。

2. 吸样枪污染防护：吸样枪是一个非常容易发生污染的设备。

如操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘在枪头上，将会成为一个严重的污染源，因而使用吸样枪时要格外小心，吸样要慢，并尽量一次性完成，忌多次抽吸，避免发生交叉污染或气溶胶污染。

3. 减少PCR循环次数：以PCR产物达到检测水平为宜。

4. 防止操作人员污染：使用一次性手套、吸头、小离心管。

5. PCR产物的电泳检测时间:一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。

因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。

若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。

PCR实验常见污染的原因及对策

则，各个区域实验用品及加样器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，以破坏残留的脱氧核糖核酸或核糖核酸。在不同处理区域进行相应的工作，样本处
种，由于其反应特异性强，操作简单、快速，对纯度要求低，且灵敏度高等优点，被广泛应用于兽医实验室
检疫检验
ＰＣＲ实验常见污染的原因及对策
牛可可（河南省新乡市新乡县农牧局４５３００３）
聚合酶链式反应（ＰＣＲ）是分子生物学技术的一
毒剂擦拭清洁，紫外光照射时距离应小于９Ｏ厘米，过夜消毒。工作人员在操作过程中一定要遵循单一方向原
克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较
常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外
在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具
计要求严格，但是在基层实验室实际操作中还会遇到一些污染问题。在实验过程中，极其微量的污染都会造成实验结果的不准确以致实验失败。
１原因
环境污染，门把手、实验台、操作架、离心机、电泳盒等设备仪器污染。工作人员操作不严谨造成污染。没有做到单一方向原则，手套、加样滴头等污染。样本交叉污染。样本收集时，采样工具和容器消

避免PCR实验室交叉污染的预防措施

避免PCR实验室交叉污染的预防措施PCR实验室交叉污染是一个常见但严重的问题。

交叉污染可能导致错误的实验结果，并浪费大量的时间和资源。

为了避免PCR实验室交叉污染，以下是一些预防措施：1.设立区域：按照操作流程将实验室划分为不同的区域。

例如，将制备PCR反应体系的区域和扩增反应的区域分隔开来，确保实验者在不同的区域操作。

2.空间隔离：确保设备、试剂和操作区域的有效隔离。

使用独立的PCR工作站，在每个工作站上进行不同的PCR实验，并且在不同的PCR实验之间进行清洁和消毒。

3.重复实验器具：在进行PCR实验之前，确保所有实验器具都进行彻底的清洁和消毒。

最好为每个PCR实验使用新的试剂盒和器具。

4.清洁实验台和仪器：在每次实验之前和之后，对实验台和设备进行彻底的清洁和消毒。

使用含酒精的消毒剂对实验台面、机器表面和仪器的每个部分进行清洁，并确保完全干燥。

5.使用负控制：为了确保结果的准确性，应该在每次PCR实验中设置负对照。

负对照通常是使用无DNA模板的反应体系。

这有助于排除实验中的任何污染。

6.分离样品：在进行PCR实验之前，确保每个样品都在不同的管子中操作，并在操作过程中避免将不同样品的器具接触。

每次更换样品时，应彻底清洁操作区域。

8.操作员培训和规范操作：确保所有操作员都经过PCR实验室的培训，并且了解交叉污染的风险和如何避免。

开展定期的回顾培训，以确保操作员持续遵循规范操作。

9.使用控制措施：避免使用可能产生污染的物品，例如手套、实验室衣、口罩等。

确保动作轻柔，减少颗粒物和污染的产生。

10.定期消毒实验室：除了日常清洁之外，定期对实验室进行消毒，以减少细菌和病毒的存在。

特别应关注常接触的表面，如门把手、操作台面等。

通过采取上述预防措施，实验者可以最大程度地减少PCR实验室交叉污染的风险，准确获取实验结果，并确保实验的可靠性。

PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施

PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施2022年5月29日中午12:30开始PCR实验室假阳性频率增高,考虑可能出现实验室污染，检测工作立即停止，首先，查找污染源和明确污染范围。

经排查本次实验室污染的主要来源可能是部分配置好的反应体系放置时间过久、实验室二区出现扩增产物的污染。

一、发生污染的原因分析。

1.核酸检测工作频次过高，导致每批样本检测之间没有足够时间消毒。

2、核酸检测人员短缺，检测人员需要多次往返二区、三区，极容易导致扩增产物的污染。

二、实验室污染的处理：1.生物安全柜的操作台消毒处理：使用5000mg∕L含氯消毒剂进行喷洒消毒。

消毒液需要现用现配，24小时内使用。

2.实验室台面、地面、物体表面等的消毒处理：立即使用润湿有5000mg∕L含氯消毒剂的毛巾擦拭、消毒。

清洁、消毒通风系统滤网。

采用房间固定和可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。

3.清理污染物时：严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。

整改措施：1.严格实验室功能分区确保实验室人、物及空气单向流动核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区一样本制备区T扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。

空气流向应按照从试剂储存和准备区一样本制备区一扩增区一扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。

2、力口强实验室检测安全管理(1)基本要求核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，并应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施，包括手套、口罩和隔离衣等。

开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定实验室生物安全相关程序文件及实验室生物安全操作失误或意外的处理操作程序，并有记录。

(2)实验室前安全要求应使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精进行桌面、台面及地面消毒。

消毒液需每天新鲜配制，不超过24小时。

转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。

转运桶开启后，使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精对转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。

动物疫病PCR检测实验室的污染与对策

动物疫病PCR检测实验室的污染与对策动物疫病PCR检测实验室是用于检测动物疫病的重要场所，它的存在对于动物疾病的检测和预防具有非常重要的意义。

实验室环境的污染问题一直存在着，如果不及时采取有效的对策，将会对实验室的工作产生严重的影响，而且还可能对实验室工作人员和动物健康造成威胁。

对动物疫病PCR检测实验室污染问题的认识和对策的制定至关重要。

1. 空气污染：实验室通常会产生大量的粉尘、细菌、病毒等微生物颗粒，这些颗粒会悬浮在空气中形成空气污染，对实验室的工作环境和动物健康造成威胁。

2. 地面污染：实验室地面可能会受到化学试剂的溅洒，或者动物排泄物的污染影响，导致地面污染的问题。

3. 设备污染：实验室中使用的设备和仪器可能会受到微生物污染，例如PCR仪、离心机等。

4. 人员污染：实验室工作人员长时间在实验室内工作，容易受到环境污染的影响，把外部的污染带入实验室。

以上污染问题如果不及时处理，将会对实验室的工作和动物健康带来严重影响。

1. 空气净化：通过安装空气净化器和通风系统，及时清除实验室内的空气污染，保持室内空气的清新。

2. 地面清洁：定期对实验室地面进行清洁和消毒，防止地面污染的问题。

4. 人员防护：实验室工作人员要做好个人防护，例如佩戴口罩、手套等，避免外部污染物进入实验室。

5. 室温控制：保持实验室的温度和湿度稳定，避免微生物的滋生和繁殖。

6. 定期检测：定期对实验室进行环境检测和微生物检测，及时发现和处理污染问题。

通过以上对策的制定和实施，可以有效解决动物疫病PCR检测实验室的污染问题，保障实验室的工作顺利进行，同时也保障实验室工作人员和动物的健康安全。

在实验室的日常管理中，还需要加强对环境污染的认识，加强实验室管理，加强人员的督导，提高实验员的素质水平，严格执行实验室卫生制度，及时排查隐患，加强清洁消毒，最大限度地减少外部环境对实验室的污染。

实验室还要加强对于环境消毒的技术研究，选择适合的消毒剂和技术，确保对于实验室内的环境进行有效的消毒，最大限度地减少污染对实验结果的影响。

PCR实验室的污染及其防范措施

2021年第3期（总第284期）卫生检疫35PCR 实验室的污染及其防范措施陈永1，杨莲辞2，常定发1（1.云南省泸西县动物疫病预防控制中心，云南泸西 652400；2.云南省泸西县动物卫生监督所，云南泸西）中图分类号：S851.2+1 文献标识码：C 文章编号：1007-1733（2021）03-0035-02 随着动物疫病检测需求增加，PCR 基因扩增实验室业务量有所加大。

开展PCR 检测，很可能会出现实验室污染，影响实验质量和效果，造成假阳性，同时也会给实验人员健康造成损害。

1 PCR 实验室污染检测评估（1）因PCR 检测的样品及其产物污染无色无味，主观很难判断，应定期对实验室操作台、地板、设备、器具等采集棉拭子样进行检测，评估是否存在污染。

样品要规范编号记录，以便追溯。

（2）查看实验室最近疑似污染实验检测报告，看阴性对照（水）Ct 值（反应管内营光信号达到设定的值时所经过的循环数）。

阴性对照（水）Ct ＞38，轻微污染；35＜Ct ＜38，中等污染；Ct ＜35，严重污染。

如只是阴性对照污染，样品中仍有阴性，则可能是样品交叉污染或操作不当，通过规范仔细的重复操作以避免污染。

如所有的曲线都呈阳性，而且阴性对照和许多标本的线性相似，则考虑是系统污染，如检测试剂污染或气溶胶污染。

（3）试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA 或RNA ，进行PCR 扩增，以监测试剂是否污染。

2 污染的来源2.1 阳性样本或阳性样本核酸的污染此类污染多发生于样品处理间，造成样品间的污染。

在采集的样品中，如存在阳性样品，在样品的采集、放置、运输的过程中，由于封装不严溢出于容器外，导致污染容器、样品的交叉污染等；实验过程中，移液器使用不当，吸液时回枪手速过快导致的移液器枪头部分被阳性样本污染；样品加热裂解核酸后，立即打开仪器热盖，反应管突然遇冷导致崩开，溅出核酸；核酸释放后，未离心，管盖上有液体，溅出导致的污染；吸取阳性对照的枪头，处理不当造成的污染；由于通风不良，病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致交叉污染。

如何防止PCR实验室气溶胶污染

如何防止PCR实验室气溶胶污染PCR实验室气溶胶污染是一个严重的问题，因为气溶胶中可能含有目标DNA分子，从而导致PCR结果的假阳性或假阴性。

以下是防止PCR实验室气溶胶污染的一些建议。

1.设计合理的实验室空气流动：PCR实验室应设计为正压实验室，保持空气流动的方向由干净区域向污染区域。

同时，应确保实验室具有足够的空气交换率。

2.安装滤芯：在实验室的空气处理系统中安装高效的HEPA（高效颗粒空气过滤器）滤芯，以去除空气中的细菌和病毒。

滤芯需要定期更换，以确保其有效性。

3.限制实验人员数量：为减少气溶胶体积，限制实验室内人员的数量，并确保实验室的工作区域充足。

4.穿戴合适的实验室服装：PCR实验室工作人员应穿戴合适的实验室服装，包括帽子、口罩、手套和实验室外套。

这些措施可以减少人员对实验室空气的污染。

5.定期清洁实验室：定期清洁实验室工作台面、设备和地面，以确保无尘和清洁的工作环境。

6.分离样品处理区域：将样品处理区域与PCR反应区域分离开，避免PCR样品的处理过程中产生气溶胶。

7.管理实验液体废弃物：正确处理和处置实验液体废弃物，避免气溶胶污染进一步蔓延。

8.使用封闭系统：尽量使用封闭系统进行实验操作，如PCR机的封闭盖，可以减少气溶胶污染的可能性。

9.进行负压实验室：对于特别容易产生气溶胶的实验，可以考虑使用负压实验室。

这种实验室会抽取实验室内的空气，并将其排出到室外，减少了气溶胶污染扩散的可能性。

10.定期测试气溶胶污染：定期测试实验室内的气溶胶污染水平，以评估防控措施的有效性，并采取必要的改进措施。

综上所述，防止PCR实验室气溶胶污染需要综合考虑实验室设计、人员行为、清洁和控制措施等方面的因素。

通过合理的管理和实施相关防护措施，可以有效减少气溶胶污染对PCR实验结果的影响。

PCR实验中的污染预防及处理

PCR实验中的污染预防及处理一．污染的预防进行PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR 污染或杜绝污染的出现。

（一）划分操作区：目前，普通PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和PCR 扩增；3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。

如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。

切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

（二）分装试剂：PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。

所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA 和其他来源的DNA：1．PCR 用水应为高压的双蒸水；2．引物和dNTP 用高压的双蒸水在无PCR 扩增产物区配制；3．引物和dNTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。

（三）实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。

因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；2. 使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。

若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。

pcr测定中的污染主要来源于

pcr测定中的污染主要来源于
PCR实验室测定中的污染主要有以下四种来源：
一、样本间交叉感染。

收集样本的容器被污染或样本密封不严导致外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。

二、实验试剂污染。

主要是在PCR组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。

加样过程中，因为PCR试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板（管）处于0℃，但这个过程也充满污染风险。

三、扩增产物污染。

大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR 反应管意外开盖，这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。

因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

四、克隆质粒污染。

作为阳性质控品的克隆质粒外溢。

pcr的局限性

pcr的局限性PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、生物学研究等领域。

然而，PCR也存在一定的局限性。

本文将探讨PCR技术在实际应用中的局限性，并提出一些可能的解决方案。

一、样本污染PCR技术对样本的纯净度要求较高。

即使微小的外源污染也可能引入假阳性结果。

样本污染可能来自实验环境、试剂、仪器设备，或者操作者本身。

特别是在目标DNA含量很低的情况下，污染对PCR结果的影响更为明显。

解决方案：1. 严格控制样本处理过程中的污染。

在实验室环境中，应定期消毒操作台面和仪器设备，避免细菌与DNA的交叉污染。

2. 采用质量可靠的试剂和消耗品，并遵循厂家提供的操作指南。

3. 为每一个PCR反应设置阴性对照，以及必要的阳性对照，以确定实验过程中是否出现样本污染。

二、特异性PCR的特异性是指只扩增目标序列而不扩增其他非特定序列。

然而，由于基因组的复杂性和相似序列的存在，PCR扩增产物的特异性可能受到影响。

特别是在分子标记较短或目标序列与非特定序列相似度较高时，特异性会成为一个问题。

解决方案：1. 根据序列的特点设计特异性引物。

可以使用生物信息学工具检查引物序列是否存在非特定反应的可能性，并进行必要的修正。

2. 选择适当的扩增条件和试剂配方，如调节退火温度、引物浓度、试剂浓度等，以提高特异性。

3. 验证扩增产物的特异性，可以采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、测序、或相关的分子生物学技术进行检测。

三、定量准确性PCR通常被用于定量目的，例如测定基因表达水平或病原体载量。

然而，PCR的定量准确性常受到多种因素的限制，包括反应效率、扩增曲线的线性范围、引物的选择和环境条件等。

解决方案：1. 使用标准曲线法进行定量。

通过制备一系列已知浓度的参比样品，构建标准曲线，以根据扩增产物的信号强度计算未知样品的目标物含量。

2. 优化PCR反应条件，如试剂浓度、退火温度、扩增循环数等，以提高反应效率和准确性。

PCR实验室防污染措施及应急处理方法

PCR实验室防污染措施及应急处理方法PCR（聚合酶链式反应）实验室是进行核酸扩增实验的关键场所，为了保证实验结果的准确性和可靠性，需要采取一系列的防污染措施以及应急处理方法。

一、实验室防污染措施：1.实验室空间划分：将实验室分成不同区域，包括扩增前处理区、样本DNA提取区、嵌合反应区和扩增产物分析区。

各个区域应设立合适的物理屏障，防止交叉污染。

2.空气处理系统：实验室内应安装高效过滤器和通风系统，确保室内空气质量良好。

减少空气中的DNA和RNA等污染源。

3.无菌操作：在PCR实验室中进行工作时，必须采取无菌操作技术，包括穿戴无菌手套和口罩，避免颗粒、细菌和真菌的污染。

4.设立正常控制组和负空白对照组：对于每个PCR实验批次，应设置正常的样本对照组和无模板反应的负空白对照组，以确保扩增产物的准确性和特异性。

5.实验室设备清洁与消毒：定期对PCR仪、离心机、移液器等实验设备进行清洁和消毒，以减少交叉污染的发生。

6.样本处理区和实验重叠区分离：为了避免扩增前杂交污染，应将样本处理区和实验重叠区分隔开，分别使用不同的工作区域和实验仪器。

二、应急处理方法：1.污染样品的处理：一旦检测到污染样品，应立即停止实验，并将污染的试管和其他实验材料放入注射器中，用10％次氯酸钠溶液彻底清洗。

污染的工作台、仪器等表面也要进行消毒处理。

2. 扩增产物污染的处理：若扩增产物遭受到外源DNA污染，可使用外源DNA降解酶如DNase或Exonuclease I降解外源DNA。

然后，用新的试剂和陶瓷粉、洗涤缓冲液等彻底清洁实验器具。

3.实时监测和紧急停电措施：对PCR实验过程中的机器、电脑和监测设备等进行定期检查，确保正常工作。

同时，应安置备用电源设备，一旦停电时能立即启动备用电源，保证实验的连续性。

4.废液处理：将PCR废液最好两次分离处理，首先将其放入安全密闭的容器中，然后经过高温或化学处理，彻底灭活。

总之，PCR实验室的防污染措施与应急处理方法的实施对于保障实验结果的准确性和可靠性至关重要。

PCR实验室发生污染后处理方法

PCR实验室发生污染后处理方法1.环境消毒：将PCR实验室中的每个工作台面、设备、工具等物品进行彻底的清洁和消毒，消毒方法可以使用70%酒精擦拭，对于无法擦拭的设备可用消毒液浸泡消毒。

2.更换耗材：将被污染的耗材（例如：PCR试管、吸嘴、移液器等）清理或隔离，以防止二次污染，同时更换新的耗材。

3.换气处理：开窗通风，确保实验室内外的空气流通，将可能存在的污染物排除。

4.建立严格的规范操作流程：加强对操作人员的培训，确保实验室操作符合规范，减少操作过程中对实验室环境造成的污染。

5.定期检测：定期对PCR实验室进行污染检测，使用空白对照进行负控实验。

如果检测到污染，应及时采取措施清除污染物，并做好记录。

6.样品检测方法：对样品进行进一步分析，确认是否被污染，如果样品已经被污染，应剔除使用，重新采集新的样品进行实验。

7.剔除污染源：如果PCR实验室中存在大量污染源，如陈旧的试剂、过期的耗材等，应及时清除和替换。

8.质量控制：建立质量管控体系，要求实验室人员在每次实验开始前，对PCR实验室的工作台、设备进行检查，确保实验环境符合要求。

9.合理使用实验室设备：合理使用PCR仪器和其他实验室设备，定期对仪器进行维护和保养，确保其正常工作，减少设备对实验室环境的污染。

10.建立实验室安全管理体系：加强实验室安全意识，建立实验室安全管理制度，定期进行实验室安全隐患排查，及时处理储存存在风险的试剂和化学品。

总结：PCR实验室污染的处理方法主要包括环境消毒、更换耗材、换气处理、建立规范操作流程、定期检测、样品检测方法、剔除污染源、质量控制、合理使用实验室设备和建立实验室安全管理体系等。

通过采取合适的处理措施，可以有效避免PCR实验室污染对实验结果的干扰。