拟南芥叶片DNA提取方法
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
植物叶片DNA提取步骤
.
'. 植物叶片DNA提取方案
CTAB 法
基本步骤如下：①取鲜样0．2 g 左右置研钵中，加2％不溶性PVP、液氮研磨至粉末状，转入2 mL 离心管；②加入0．7 mL 65℃预热的CTAB 提取液，混匀，65℃水浴30 min；③加入等体积酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1），混匀，室温10 000 r／min离心10 min；④取上清液，重复步骤③1～2 次；⑤取上清液，加1／2 体积的5 mol／L NaCl，加2／3体积的异丙醇，置－20℃冰箱2 h，沉淀DNA；4℃、10 000 r ／ min 离心10min；⑥弃上清，用70％乙醇溶液洗沉淀2 次，风干，用50 μL TE溶解；⑦加入无DNase 的RNase 至终浓度为10 μg／μL，37℃保温30 min，－20℃保存备用。
(8)加入终浓度5099／ml的RNase，37℃保温1h；
(9)用等体积的氯仿／异戊醇抽提1次，12000rpm，离心10min；(10)上清液中加入O．1倍体积的Nacl，2倍体积的无水乙醇，冰箱中-20℃放置0．5h，12000rpm，离心10min，去上清液；(11)用70％的无水乙醇洗涤沉淀2次，自然干燥后溶于50plTE；）
2%CTAB提取液：100 mmol／L Tris－HCl（pH8.0），1.4 mol／L NaCl，20 g／L CTAB，20 mmol／L EDTA，1％β－巯基乙醇（用前加）。
TPS简易法抽提DNA
TPS简易法抽提DNA1. 取2cm长的水稻/拟南芥叶片放在1.5ml的离心管中,加入250ul的TPS抽提液,用1ml的枪头将叶片捣碎。
2.将捣碎的叶片放入75℃的水浴中温育20-30min。
3. 12000rpm，离心10min。
4. 吸取上清液（约250ul）于新的1.5ml离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀，-20o C放置20-30min，后12000rpm，离心10min。
5. 弃上清,加入500ul-1ml 70% 的乙醇,离心,12000rpm,10min。
6.弃上清,将沉淀干燥,加入30ulddH2O溶解. PCR反应时取0.8-1ul 即可(10ulPCR 体系)。
附:TPS配方100ml：母液V/W 终浓度1M Tris-HCl (PH8.0) 10ml 100mM0.5M EDTA (PH8.0) 2ml 10mMKCL 7.45g 1MddH2O 至100ml母液配制：1M Tris-HCl (pH7.4 7.6 8.0)⏹组分浓度1M Tris-HCl⏹配制量1L⏹配制方法1.称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
pH值浓盐酸7.4 约70ml7.6 约60ml8.0 约42ml4.将溶液定容至1L。
5.高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1o C，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
0.5M EDTA (pH8.0)⏹组分浓度0.5M EDTA⏹配制量1L⏹配制方法1.称取186.1g Na2EDTA ∙2H2O，置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌。
3.用NaOH调节pH值至8.0（约20g NaOH）。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。
4.加去离子水将溶液定容至1L。
植物DNA提取——拟南芥
【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。
2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。
3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。
4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。
【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。
在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。
研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。
此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。
β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。
经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。
分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。
抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。
Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
植物叶片DNA提取步骤
植物叶片DNA提取方案
CTAB 法
基本步骤如下：①取鲜样0．2 g 左右置研钵中，加2％不溶性PVP、液氮研磨至粉末状，转入2 mL 离心管；②加入0．7 mL 65℃预热的CTAB 提取液，混匀，65℃水浴30 min；③加入等体积酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1），混匀，室温10 000 r／min离心10 min；④取上清液，重复步骤③1～2 次；⑤取上清液，加1／2 体积的5 mol／L NaCl，加2／3体积的异丙醇，置－20℃冰箱2 h，沉淀DNA；4℃、10 000 r ／ min 离心10min；⑥弃上清，用70％乙醇溶液洗沉淀2 次，风干，用50 μL TE溶解；⑦加入无DNase 的RNase 至终浓度为10 μg／μL，37℃保温30 min，－20℃保存备用。
(8)加入终浓度5099／ml的RNase，37℃保温1h；
(9)用等体积的氯仿／异戊醇抽提1次，12000rpm，离心10min；(10)上清液中加入O．1倍体积的Nacl，2倍体积的无水乙醇，冰箱中-20℃放置0．5h，12000rpm，离心10min，去上清液；(11)用70％的无水乙醇洗涤沉淀2次，自然干燥后溶于50plTE；）
2%CTAB提取液：100 mmol／L Tris－HCl（pH8.0），1.4 mol／L NaCl，20 g／L CTAB，20 mmol／L EDTA，1％β－巯基乙醇（用前加）。
植物叶片DNA提取步骤
植物叶片DNA提取步骤1.样品准备：首先，选择新鲜、健康的植物叶片作为DNA提取的样品。
尽量避免使用受伤、病变或已枯萎的叶片。
同时，准备一些冰盒和冷藏离心机，以便稍后的步骤中将样品保持低温。
2.细胞破碎：将准备好的叶片样品放入液氮中快速冷冻，以阻止酶的活性和DNA降解。
随后，使用液氮马达磨碎样品，使细胞破碎并释放DNA。
也可以用杵和研钵来研磨样品。
研磨过程中可以加入一些液氮以保持低温。
3.DNA溶解：将破碎的样品转移到一个离心管中，并加入DNA溶解缓冲液。
这个缓冲液通常包含盐类、螯合剂和酶，以帮助去除细胞内的蛋白质和其他杂质。
将混合液在4°C下孵育一段时间，使DNA从细胞中溶解出来。
4.蛋白质沉淀：将溶解的样品通过离心将细胞残渣和大部分蛋白质沉淀到管底。
用一个小孔穿刺器将上清液吸走，注意不要吸入底部的沉淀物。
也可以将上清液转移到另一个清洁离心管中。
5.DNA纯化：将上清液中的DNA加入等体积的异丙醇中，轻轻混合数次，以沉淀DNA。
异丙醇可以使DNA从溶液中分离出来。
然后使用离心将DNA沉淀物沉积到离心管的底部。
将上清液去除，注意不要干扰沉积的DNA。
接下来，使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA沉淀物，以去除任何残留的盐或蛋白质。
离心去除乙醇，然后使用无菌纯水重新溶解DNA。
6.DNA的储存：将纯化好的DNA溶液转移到一个经过消毒的离心管中，并存放在低温的冰箱或冷冻柜中。
DNA的保存温度一般为-20°C或更低才能保持其稳定性。
可以在提取的DNA上进行测序、PCR或其他遗传学实验。
总结：植物叶片DNA提取步骤包括样品准备、细胞破碎、DNA溶解和纯化。
样品准备需要选择新鲜健康的叶片，而细胞破碎则使用液氮或研磨来释放DNA。
DNA溶解时需要使用缓冲液帮助溶解，而蛋白质沉淀和DNA纯化则用于去除杂质。
最后，DNA可以在低温下保存并用于后续实验。
通过这些步骤，可以从植物叶片中高效地提取到DNA，并用于分子生物学研究。
拟南芥基因组DNA的提取
拟南芥基因组DNA的提取
以生长良好的野生型拟南芥幼叶为材料，采用CTAB法提取基因组总DNA。
操作步骤：
（1）将CTAB提取液先在65℃水浴锅中预热；
（2）在液氮中研磨拟南芥幼嫩叶，在离心管中加入800μL粉末，然后加入800μL CTAB提取液，65℃保温30min以上；
（3）加入酚：氯仿：异戊醇=400:384:16，混匀，室温静置1分钟；
（4）4℃，12000rpm离心机中离心2min，取上清，加入氯仿：异戊醇=768:32，混匀，室温静置1min；
（5）4℃，12000rpm离心机中离心2min，取上清，加入氯仿800μL异丙醇，混匀，室温静置10min；
（6）4℃，12000rpm离心机中离心15min，取上清；
（7）在上清液中加入800μL的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心机中离心2min，弃上清；
（8）加入30μLddH2O，放入-20℃的冰箱中备用。
实验2 RT-PCR分析拟南芥叶片
表达的定量研究，是一种常用的具有很高灵敏度和特异性的基因表达检测方法。
RT-PCR方法有定量RT-PCR和半定量RT-PCR法，定量PCR法对实验仪器和 样本处理的要求较高，而半定量PCR法对试验条件的要求不高，它的主要特点 是选择一个比较标准(control)又称为内参基因，以消除试验误差，样本间用于 比较的值不是绝对值，而是相对值，因此称半定量RT-PCR法。
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反 应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 .
PCR参数设置
① ② 98℃预变性3分钟后开始以下循环 98℃ 30 sec
Tm
72℃
30 sec
1 min
26 循环（PPH） 24 循环（ACT2）
③ 72℃ 5 min ④ 4 ℃ 保温
PCR过程约1小时20分钟
取 5-10 µL 的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条 带亮度的不同来确定表达量的多少。 在一次半定量 PCR 分析中，每个样品至少设两个重复。
内参基因的设定为了保证实验结果的可靠与准确可在为了保证实验结果的可靠与准确可在pcrpcr扩增目的基因时加入一对扩增目的基因时加入一对内参照基因的特异性引物同时扩增内参内参照基因的特异性引物同时扩增内参dnadna作为对照
实验二 半定量RT-PCR分析拟南芥叶片PPH基因表达
田亚楠
实验目的
1、了解植物叶绿素酶基因的功能 2、掌握半定量RT-PCR操作方法
关于PPH基因
Step1 拟南芥叶片总RNA提取
提取质量较好的RNA：28 S和18 SRNA带型完整， 无明显拖尾现象，无明显的降解。
Step2 基因组DNA的去除 ★
简单粗暴提取拟南芥DNA-1
Simple, but robust and highly scalable protocol简单粗暴法提取DNA1. 四片以上叶子的苗龄时，取一片适当大小（0.5-1cm2均可，没必要太大）；2. 加钢珠和500μL extraction buffer，磨样3min，12000rpm离心10min（时间不可太短，否则无法充分分层）；3.吸取400 ~450μL上清（尽量不要吸到叶片组织沉淀）至1.5mL离心管，加等体积异丙醇（或2倍体积冰乙醇）沉淀，-20℃放置30min左右，离心5min；4.倒掉乙醇，加500μL 75%乙醇，泡洗10min后倒掉75%乙醇，可重复洗1遍；5.晾干（最好过夜），加100μL ddH2O溶解，约1hr后即可取1μL左右直接做PCR（10μL的PCR体系）模板。
说明：1.extraction buffer配方（1L）：12.1 g Tris, 28.1 g NaCl, and 18.6 g EDTA（实是乙二胺四乙酸二钠即EDTA Na2，加水溶解并定容至1L；分子生物学实验一般都是用的EDTA Na2，所以一般默认简称EDTA）2.本方法改编自：Alonso J M, Stepanova A N. Plant Functional Genomics:Methods and Protocols[M].2nd ed. Humana Press, 2015. 326-335（大家可以看看这本书，方法挺全）3.此法提取DNA，室温放2个月做PCR没有问题，没有试过放更长时间（更长时间建议还是放-20℃冰箱）。
检测2Kb片段扩增成功（更长片段没有试过，可用于做TAIL PCR）。
因没有用氯仿、异戊醇抽提，全程可不用在通风橱操作。
所提DNA中蛋白含量稍高，加水后有白色不溶物属正常现象，不影响PCR。
拟南芥基因组DNA微量提取方法的改良
１ １ 材 料 ．
试 验材 料 为 温 室 内培 养 的 拟 南 芥 Ｃｌｍ ｉ 态 型 野 生 ｏ ｂａ生 ｕ 型 ； Ｚ ＳＫ 转 ｍ Ｐ １基 因 （ 物 表 达 载 体 为 ｐ ｒｅ０２ 植 Ｇ ｅｎ０ ９—３ Ｓ— ５
作者简介 ： 邹华文（ ９ ３ ）授， 研究方 向
（ 接第 ５ 上 １页 ）
切 口处 有 愈 伤 组 织产 生 ， 一结 论 与他 人研 究 相 一致 。不 这
定根 的形成依赖于许 多因素 ， 中植物生长调 节物质可 能起 其 着决定性作用 。细胞 分裂素 、 长素 比例决定 了培养物形态 生 发 生的方 向， 高浓度 的细胞分裂 素往往无一例 外地抑制根 的 形成 。本试验也得 出类似 的结论 ， 即生长素在“ 柠檬雪 ” 离 体生根 中起决定性作 用 ， 单一的 ６一 Ａ不 能诱 导其 生根。在 Ｂ 植 物组织培养快繁不定根 的诱导 中， 多数趋 向于通过适 当稀 释无机盐 的浓度 来促进生 根 ， 柠檬雪 ” “ 生根 也符合 此趋 向： １２ 培养基生根优于 ＭＳ 而 Ｎ Ａ和 Ｉ Ａ按一定浓度配合 ， ／ ＭＳ ， Ａ Ｂ
—
ＨＣ 为提取溶剂 ， １ 简单研磨后 以牛血清蛋 白溶液 回溶 ， 离心后 的上清液 即可直接 用于 Ｐ Ｒ检测 。该 方法大大 简化 Ｃ
了传统提取方法 的步骤 ， 缩短了提取 时间 ， 而且完全避免 了对一些有机 溶剂的使用 ， 克服 了传统 方法 中由于酚 的残 留 带来 的后续 Ｐ Ｒ等操作上的困难 ， Ｃ 完全可 以满足 以 Ｐ Ｒ扩增 为基 础的试验需要 。 Ｃ
功 能 基 因组 学 的研 究 中起 着 非 常 重要 的作 用 。在 涉 及 到拟 南
法和 Ｃ Ａ Ｔ Ｂ法， 这些方法各有优缺点及应用范 围 ， 但都存 在
植物生理学实验实验八 拟南芥基因组DNA的
• 活性氧H2O2是植物叶绿体中光合电子传递和某些酶学反应的天然产物。 在逆境伤害、机体损伤、细胞分裂、酶反应等方面都可能涉及到H2O2的 氧化作用。H2O2可与DNA、类脂化合物和蛋白质反应，引起细胞损伤。 植物叶绿体和胞质中，一个主要的H2O2清除系统称为抗坏血酸一谷胱甘 肽(AsA—GSH)循环，其中抗坏血酸过氧化物酶APX是关键酶。因此， APX表达量的高低和活性的变化直接关系到植物抵抗胁迫的能力。
②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热 变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为 模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新 的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变 性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复 制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
二、核酸电泳
吸取PCR产物5 ul加入琼脂糖凝胶，120 V 电泳10 min，利用凝胶成像系 统拍照。
实验注意事项
• 低温离心机需配平，在老师指导下使用。严禁私自调试。 • 酚：氯仿刺激性较大，注意使用安全。 • DNA琼脂糖电泳中的EB毒性很大，注意使用一次性PE手套
3. 加入1 ml 酚：氯仿，反复振荡数次，以促使蛋白提取充分。
4. 4 ℃ 12000 rpm 离心10 min，取上清到新的离心管中
5. 加入4 ℃预冷的异丙醇 500 μl ，-20 ℃放置10 min。
6. 4 ℃ 12000 rpm 离心10 min，弃上清，沉淀既是粗提的基因组DNA。
拟南芥——精选推荐
拟南芥⽤农杆菌介导法将拟南芥miR395d基因转⼊油菜中的⽅法研究⽬的基因的来源⽬前由于油菜的核酸序列库相对较⼩,通过⽣物信息学分析尚未在油菜中找到miR395前体序列,⽽油菜与拟南芥同属于⼗字花科,亲缘关系⽐较近,且miR395在各物种间序列保守,因此为了进⼀步研究miR 395对油菜中sulfate trans porter 2; 1和ATP硫酸化酶的作⽤机制, 提⾼油菜在缺硫等逆境中的适应性,本研究采⽤PCR⽅法从拟南芥中克隆到了miR395d前体基因。
⽬的基因的研究近况MicroRNAs(miRNAs)是⼀类内⽣、⾮编码蛋⽩长度约为21～24个核苷酸的单链⼩分⼦RNA在⽣物体内起着基因转录后的调控作⽤作为重要的调节分⼦,miRNA参与⽣命过程中⼀系列的重要进程, 包括⽣长发育、信号转导、病毒防御、造⾎过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发⽣等也有⼀些研究报道指出,miRNA在调节植物对环境胁迫如⼲旱、盐害和养分胁迫反应等⽅⾯起着重要的作⽤。
⽬的基因作⽤机理⽬前在拟南芥中已有研究证实,miR39与硫同化途径中的第1个关键酶ATP硫酸化酶mRNA (APS1、APS3、APS4)存在互补序列。
经初步Northern杂交分析显, 缺硫植株中的miR395被诱导表达, ⽽APS的积累量明显减少, 表明拟南芥miR395在缺硫条件下参与对其靶基因APS1的负调控。
此外, 5′RACE结果显⽰, 编码拟南芥的⼀个低亲和硫转运体sulfate trans porter 2; 1 ( AST68)的mRNA 也是miR39的⼀个靶基因, 说明miR395在植物硫同化和转运途径中可能起到了⾮常重要的调节作⽤。
实验意义油菜作为⼀种重要的油料和经济作物, 在硫的吸收、转运及代谢中同样需要硫转运体和ATP 硫酸化酶的协助为研究miR395对油菜中sulfate trans porter 2;1和ATP硫酸化酶的作⽤机制, 提⾼油菜在缺硫等逆境中的适应性, 采⽤PCR⽅法从拟南芥中克隆到了miR395d前体基因, 并构建过表达载体, 通过采⽤根癌农杆菌介导法将miR395d前体基因导⼊⽢蓝型油菜特选号中, ⽬前已获得了转基因植株。
叶片提取DNA细则
2.1 取一元硬币大小嫩叶，放入2ml的离心管，放入钢珠，置于液氮中，直至液氮止沸，
置于样品研磨仪30s 50HZ粉碎重复2次；
2.2 加入900ulDNA提取液（CTAB），漩涡混匀（约10s）后。
65℃水浴30min，间隔10min
用力颠倒混匀数次；
2.3 加入800ml的氯仿：异戊醇（24:1），上下颠倒混匀至不分层（手动60rpm，5min），
12000rpm离心10min。
2.4 吸取上清液转移到另一2ml离心管中【根据需要去除RN；加入2ul RNAse 酶（10mg/ml），
混匀后37℃水浴30min】，重复2.3步骤。
2.5 吸取上清液转移至另一2ml离心管中，加入600ul 预冷的异丙醇（-20℃）缓慢摇动约
30次，静置5min，絮状DNA成团析出。
2.6 用剪口枪头吸取DNA，转移至盛有1ml的70%乙醇的离心管中，洗涤两次（手动60rpm，
1min），无水乙醇再洗涤一次（1-2小时，如需要，可隔夜）。
2.7 倒掉无水乙醇，离心管侧翻放置，静置约2-3h，晾干DNA，加入200ul 超纯水或TE
溶液（浓度约为200ng/ul），手动摇动后，放置冰箱上层（4℃左右），待充分溶解后备用。
线粒体提取
线粒体提取缓冲液A（100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10g/ml pepstatin A）。
缓冲液B（pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A）。
1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。
2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。
3、匀浆液经4层纱布过滤。
滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（1）。
4、于2,600g 离心15 min（Beckman J2-HS），弃沉淀。
上清取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（2）。
5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。
6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。
从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（3）。
7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和8 ml/ 1.8 M sucrose。
介质均用缓冲液B配制。
8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。
9、然后以24000rpm离心90 min（SW28 Beckman rotor）。
10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。
11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。
13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（4）。
14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80℃。
一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法
一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法
杨双;阮燕晔;樊金娟;张立军
【期刊名称】《沈阳农业大学学报》
【年(卷),期】2005(036)001
【摘要】报道了一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法.该方法可在常温下进行DNA提取,而且样品用量少,仅需10mg左右,用100μL重蒸水回溶DNA沉淀所获得的粗提液可直接用于PCR检测.结果表明:应用该法提取的DNA完整性好,PCR 效果佳,适用于拟南芥转基因植株鉴定.
【总页数】2页(P99-100)
【作者】杨双;阮燕晔;樊金娟;张立军
【作者单位】沈阳农业大学,生物科学技术学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,生物科学技术学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,生物科学技术学院,沈阳,110161;沈阳农业大学,生物科学技术学院,沈阳,110161
【正文语种】中文
【中图分类】S637.9
【相关文献】
1.一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法 [J], 徐平丽;赵晋平;孟静静;李保龙;李新国;郭峰
2.拟南芥基因组DNA微量提取方法的改良 [J], 邹华文;李翠花;王彩丽
3.一种简单快速的拟南芥基因组DNA的微量提取方法 [J], 邹华文;黄丛林
4.一种简单快速的拟南芥基因组DNA的微量提取方法 [J], 邹华文;黄丛林
5.一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法 [J], 徐平丽; 赵晋平; 孟静静; 李保龙; 李新国; 郭峰
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一种简单快速的拟南芥基因组DNA的微量提取方法
一种简单快速的拟南芥基因组DNA的微量提取方法邹华文;黄丛林【摘要】报道了一种专供PCR分析的快速微量提取拟南芥基因组DNA的方法。
该法大大简化了传统提取方法的步骤,而且用氯仿-异戊醇代替传统的酚,克服了由于酚的残留带来的后续PCR等操作上的困难。
用该法提取的DNA样品质量较高,特别适合一些突变体及转基因植株的PCR初步鉴定。
【期刊名称】《长江大学学报：医学卷》【年(卷),期】2006(000)011【总页数】4页(P)【关键词】DNA提取;拟南芥（Arabidopsisthaliana）;PCR【作者】邹华文;黄丛林【作者单位】长江大学农学院;北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心;湖北荆州【正文语种】中文【中图分类】Q943.2作为一种模式植物，拟南芥(Arabidopsis thaliana)在植物功能基因组学的研究中起到非常重要的作用，目前全世界的许多实验室都开展了以拟南芥为对象或工具的研究工作。
在涉及到拟南芥的分子操作中，有许多工作需要提取单株DNA用于PCR分析检测，例如突变体的筛选、遗传转化后代的筛选等。
面对几十甚至几百株待检测的拟南芥植株，其工作量之大是显而易见的。
而目前应用于植物总DNA 的提取方法均比较繁琐，而且周期较长[1～3]。
本研究在参考几种常见的DNA提取方法[1～3]的基础上，摸索出一种简单的DNA提取方法，可以快速有效地进行拟南芥基因组DNA的微量提取，并能有效地用于后续的PCR检测。
1 材料与方法1.1 材料试验材料为温室内培养的拟南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia生态型野生型及转基因株系；提取液为：0.2 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)、0.5% SDS、0.25 mol/L NaCl、1% β-巯基乙醇；异丙醇、氯仿、异戊醇等试剂均为分析纯。
1.2 DNA提取方法(1)取新鲜的拟南芥叶片2～3片加入2 mL的Eppendorf管中，加入液氮，玻璃棒研碎；(2)研磨以后，加入600～700 μL 的提取液，混匀，然后在60 ℃下水浴20～60 min；(3)4 ℃下12 000 r/min离心10 min；(4)取上清液至一新管，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，4 ℃下12 000 r/min 离心7 min；(5)取上清液至一新管，加入70%体积的异丙醇，混匀，4 ℃下12 000 r/min离心15 min；(8)弃上清，70%乙醇洗2次沉淀，吹干；(9)溶于20～30 μL含有0.1 mg/mL RNase的ddH2O中。
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拟南芥叶片DNA提取方法
提取液配方:
Edward´s buffer: 主要成分是：NaCl，Tris-HCl（PH=7.5），EDTA （PH=8），SDS。
NaCl，Tris-HCl主要是调节溶液的PH，维持一定的离子浓度,提供一个缓冲液的环境，防止核酸被破坏；
EDTA主要是二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子，锰离子，镁离子等和EDTA结合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA；
SDS主要是和蛋白质结合，使其变形沉淀，从而利于DNA的提取，减少和清除蛋白质杂质，裂解细胞。
配方：每升中加入EDTA 9.3g， SDS 5g， NaCl 14.6g， Tris 24.2g 相当于Tris 200mM PH=7.5 EDTA 25mM PH=8
注意：Tris与EDTA 应当分别配好调PH值
器材：灭菌的研磨棒，离心管，配好的DNA提取液，1000μl的移液枪，预冷的异丙醇，离心机，70％的乙醇，灭菌水
拟南芥DNA粗提步骤：
１．选取两片适当大小的叶片放入1.5ml离心管（已标记）中，研磨至匀浆状；
２．加入DNA提取液200μl溶解，同时再次磨样，使之彻底为匀浆，摇匀；
３．在13400rpm条件下，离心10min，取上清至另一新离心管（同标记）中，弃去沉淀，（切记：宁少勿沉淀）；
４．加入150μl异丙醇（-20℃预冷）至管中，摇晃混匀，室温放置5min，析出DNA；
５．在13400rpm下，离心5 min，弃上清，留沉淀；
６．向沉淀中加入300μl、70%的乙醇，进行洗涤，然后在13400rpm 下，离心5 min，重复一次；
７．倒出乙醇，在超净工作台上吹干，加入70μl灭菌水溶解，13400rpm下，离心5 min，吸取上清液，转至另一新管中备用。