花粉管通道法在小麦转基因中的应用

花粉管通道法在小麦转基因中的应用
摘要介绍了花粉管通道法的创立、特点及其在小麦育种中的应用概况，分析了花粉管通道法转化的优点及存在的不足。

关键词花粉管通道法；小麦；外源DNA
文献标识码 A
扩大种质资源，提高品种抗性，增加产量，改良品质是小麦育种工作者的一大难题。

远缘杂交是扩大种质资源的重要途径之一，但存在很多问题，花粉管通道法即可以解决远缘杂交出现的问题。

花粉管通道转基因技术是以DNA片段杂交假说为理论基础，直接将带有目的性状的供体遗传物质或目的基因导入受体植株而创造变异材料，通过筛选获得具有目标性状的后代，以达到改良品种的目的。

近年来，花粉管通道法与其他的基因导入方法交融在一起，被人们普遍接受并广泛用于小麦转基因育种中，成为小麦品种改良、新品种培育和创造新物种的重要方法。

1花粉管通道法转化理论的创立及特点
1.1花粉管通道法转化理论的提出1975年Pandey以烟草为材料，将供体品种的花粉经射线杀死后与受体品种的新鲜花粉混合授粉，获得了供体花色性状的变异，认为经过照射杀死的花粉其遗传物质可不通过配子融合而发生基因转化。

20世纪80年代初，我国学者周光宇成功地将外源海岛棉DNA导人陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，正式创立了花粉管通道法。

1995年Chong等报道了用该法转化小麦，经过筛选、Northern Not鉴定以及对表达产物的检测，获得了小麦转基因植株。

1999年牟红梅等通过花粉管将抗虫基因、选择标记基因导入小麦中，抗性筛选、PCR和Southern杂交表明，外源基因已转入。

至此，花粉管通道法已在多种作物中获得成功，确定了其在直接转化法中的地位。

1.2花粉管通道法转化特点国内外科学家对花粉管导人外源基因的机理进行了许多研究。

1990年Potrykus研究认为受体组织的细胞同时具备再生感受态和转化感受态的细胞，是转化成功的关键。

受精过程中分化程度很高的卵细胞在同精子接触的一刻开始，就发生急剧的脱分化过程。

受精后形成合子，消除了分化特征而变成核大、质浓和分裂活跃的细胞，具备再生及转化感受态细胞的特点。

花粉管通道法正是利用这一特点，在此时将外源DNA引入运行的花粉管内，使之有机会参与受精过程，达到转化的目的。

另外。

从小麦受精过程的细胞形态学分析，当花粉管在花柱内向胚囊行进时，花柱被横向切断，此时滴加在断口上的外源DNA可以被断面上的任何细胞吸收，其中也有花粉管。

如果含外源DNA 的花粉管进入胚囊并参加受精，基因转化就可能发生。

2花粉管通道法在小麦转基因育种中的应用
在小麦中用花粉管通道法进行转基因的研究时，供体DNA一般是从其他供体植物的叶片中直接提取DNA。

外源DNA的分子量大小要合适。

作为供体的DNA有植物基因组DNA和含目标基因的质粒DNA。

2.1外源DNA的导入及变异采用花粉管通道法导入外源DNA，先于受体开花前，按照常规杂交育种的方法进行整穗、去雄、套袋。

去雄3～5d后，收集同一品种的花粉进行人工授粉。

授粉2h后剪去柱头的1／3，将质粒DNA或外源DNA滴于剪切后的柱头上。

做好标记，套袋，自然结实后收获种子。

DNA导入后，当代收获为D0代种子。

变异一般D0代就会出现，但也有D0代与受体表型无明显区别，D2代才表现出变异的报道，也发现个别株系到D4代才出现变异。

表现出的变异大部分可以在后代中稳定下来，一般要到D3、D4代才能稳定。

刘生祥等在D1代就选出了抗条锈且其他性状优良的品系，同时发现，也有变异在后代中消失的。

刘学春等对D1的性状变异进行分析，发现同一性状的变异频率会由于供体或受体的不同而发生变化，同时还发现不同供体导入同一小麦受体，同一供体导人不同小麦受体，它们的变异谱不同，且变异范围差别较大，不同的供体DNA导入到同一小麦，D1代同一性状的变异趋势不同。

而刘根齐等发现，导人种内DNA比导人种间或属间外源DNA，其子代的表型变化更小，稳定更快。

这可能是由于种内DNA与其受体基因组的遗传差异小于远缘DNA的缘故。

2.2转基因效率花粉管通道法在小麦转基因中的效率，以单一基因作为供体，一般效率在0.2％～0.6％；以外源总DNA、目标性状多个的变异率为4％～8％，也有人得到了30％以上的转基因效率。

倪建福等以矮秆、红粒、不抗条中29号的小麦品种为受体，用花粉管通道法将高粱基因组DNA导入，在D1代存活的13株中，发现了4株变异株。

2.3转基因小麦新品系花粉管通道法在小麦育种中取得了优异的成绩，转入普通小麦的外源DNA，包括种内的，也有来自小麦族的其它属植物，如大赖草、簇毛麦，也有来自玉米、高粱、豌豆等不同族、不同科的植物。

已经育成了多个新品种(系)，如长穗冰草DNA导入的抗旱耐盐新品种济南18号、大麦DNA导入出现的抗白粉病变异株系、BYDV-GPV株系缺失复制酶基因导入出现的抗黄矮病毒株系、芦苇草DNA导入的抗盐新品系、高粱DNA导入的抗条锈白粒新品系、转入优质亚基的转基因品系、含耐盐基因HV Al的转基因小麦等。

王立新等将白粉病抗性好的复壮30和小白冬麦的基因组DNA导入农艺性状较好的北农6号中，获得了抗白粉病小麦新种质。

随着基因工程的发展，转基因小麦新品系会越来越多。

3花粉管通道法转化的优点
目前，从花粉管通道法转化的结果看，有如下优点：①直接得到转化种子，
无需经过组培，减少了基因型的影响。

②操作简便经济，育种家可直接在大田工作。

③大量快捷，每年可获大量转化种子，提供一定数量的群体，供转基因后代的遗传学研究和育种之用。

④转化频率高。

4花粉管通道法转化的不足
在花粉管通道法转基因取得巨大成绩的同时，也发现小麦花粉管通道法转基因的研究大多集中在对后代变异的分析，期望找到有应用价值的变异株系，而对花粉管通道法机理的研究较少，不同实验的结实率和转化率差异太大，各种影响因素还没有得到充分的研究。

因此，应加强外源DNA导入后对受体DNA的作用机理研究，进一步优化各种转化条件，提高转化效率，使花粉管通道法在转移外源基因上发挥更大的作用。