秀丽线虫综述 (1)

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现阶段研究已发现了十几个控制细胞 凋亡的基因，这些凋亡基因之间通过 遗传相互作用组成一条线性的调控途 径控制细胞程序性死亡，包括凋亡的 激活阶段、凋亡的起始 、凋亡细胞的 清除及凋亡细胞内部的 DNA 降解
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EGL-1：促凋亡蛋白，属 BCl—2蛋白家族，与哺乳动 物BAD、BIK/NBK及HRK同 源
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饲养与冻存
设备试剂： 大肠杆菌OP50 —— 大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型,作为 秀丽隐杆线虫的食物。
NGM培养基——1000ml的NGM培养基内加有:3gNaCl,2.5g蛋 白胨,17g琼脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液 (pH=6.0)25ml,975ml蒸馏水,灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固 醇溶液(5mg/ml乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的 CaCl 21ml
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M9缓冲液——每升缓冲液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或 6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜现 用现配
S缓冲液——0.1mol/LNaCl,0.05mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓 冲液(pH=6.0)
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秀丽隐杆线虫的饲养及研究用途
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By 王传杰
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介绍
• 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）,属于线形动物 门、线虫纲。体形非常小,成虫只有1mm左右。 线 虫 是 细 胞 定 数 动 物 ， 两性 成虫 只有 9 5 9 个 体 细 胞 ， 雄 性 成 虫 只 有 1 0 3 1 个 体细 胞 ， 其 中 1 3 1个 细 胞 注 定 要 接 一 定 的发 育 程 序 陆续 死 亡 。 神 经 系 统解 剖结 构 十 分 简 单 ， 仅有 3 0 2个细 胞 ， 约 占整 个 动 物 体 细 胞 总 数 的 三 分 之 一 。它身体透明,能感 知气味和味道,对光线、温度有反应。研究者很容易在显 微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察
注射后的线虫正上 方，由于与油互不 相溶，缓冲液会渗 入油下使线虫浮起 ． 一般等待 2～ 5
固定垫上，操纵微操使注射针 体． 固定 器进行注射，能观 min，线虫活力恢
与玻片边缘相撞，若针头尖端 撞破，可观察到有液泡自动渗
好后的操 作要迅速， 否则线虫
察到注射液在性腺 中快速流动，注射
复，身体开始游动 ，即可挑至培养板
➢ 基因组学和功能蛋白组学的研究
➢ 其他（MAPK 信号传导 、 TGF- b 信号传递途径 、衰老和年龄及脂
肪代谢等）
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方法 —— 线虫基因显微注射
显微注射技术是线虫研究领域的常用技术，对 线虫进行转基因操作的一种高效且相对简单的 方法，主 要用于研究线虫突变种系的功能恢复 (mutant rescue)、特定基因的过表达或异位表 达、标 签 蛋白的 表达、特 定 蛋白 质 结构域 的功 能、DNA 或 RNA 调节元件的分析及 RNA 干扰等． 此外，这项转基因技术对于特 异表型的筛选也是个强有 力 的 工具 ， 并 且 它还 可 用于 将人 工 合 成 mRNAs 或其他分 子接引入细胞
于注射。在注射液中加入终浓 度约 10 mg/L 的线虫基因组 DNA，则会有效地提高转基因 效率。 将一小玻片放在加了注射油的
琼脂糖固 定垫上， 调整线虫 使性腺暴 露，滴加 注射油覆 盖整个虫
镜下找到线虫，使 性腺聚焦在正确的 平面． 操作微操或 轻移滑动载物台， 将注射针尖刺入性 腺． 启动微量加压
显微注射后的整合
•目前常用的整合方法有：用 y射线和 X射线照射，或用光敏剂补骨脂素 加长波紫外线照射整合(TMP/UV integration)． 基本策略是大量筛选经 •射线照射过的转基因线虫，一般挑取数百只 F1 代繁殖，筛选 F4 代， 检测是否有 100%的转基因表达，若是则说明整合成功． 一般一次整合 能得到若干个独立种系，可选择最好的一个进行实验．
液溶解）
用冰M9缓冲液清洗虫体
置4℃环境20min，1000r离心弃去上清
将虫体转入事先准备好的EP管中，置于-80℃
冰箱冻存（可保存2个月），需要时取出室
温解冻重置培养基 精选课件
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wenku.baidu.com 研究范围
➢ 细胞程序性死亡的遗传调控机制 ➢ RNAi 及其作用机制 ➢ 秀丽线虫的功能基因组学及其他研究 ➢ 低氧应答模式生物
CED-9:抗凋亡蛋白,与 人体bcl-2同源
CED-4:促凋亡蛋白,同 源体为Apaf-1
CED-3:凋亡蛋白,与
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设备
• 显微注射全套仪器 • 琼脂糖固定垫 • 添 加 了 4% 葡萄糖 (glucose) 的 M9 缓 冲
液
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注射步骤
制剂及破针
固定虫
注射
恢复
将纯化的 DNA 溶解在 Tris-
注射时将 将琼脂糖固定垫放 在体视显微镜下，
EDTA(TE)缓冲液中即可接用 线虫挑至 在载物台上，40x物 滴加恢复缓冲液至
出
容易脱水 而死
后的性腺被液体充 满．
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上，20℃ 常规培养 ．
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子代目的基因表达检测
注射后约 3 天，观察孵出的 F1 代是否有目的 DNA 表达． 目前，线虫外源基因表达的标记通常 用：a． 荧光蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，但 需要确定荧光蛋白的连接不影响目的蛋白的功能； b． 目的基因与荧光标记基因共注射；c． 目的基因 与具有明显表型的标记基因共注射，我们通常使用易观察的 pmyo-3::TDimer II作为 荧光标记，它在所有体壁肌肉细胞表达精，选转课基件因效率高且本身对线虫的行为 和功1能6 没有 影响。
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喂养方法
➢ 用冰M9缓冲液清洗虫体 ➢ 置4℃环境20min ➢ 1000r离心，弃上清,沉淀物用M9缓冲液重悬 ➢ 置4℃环境20min 弃上清 ➢ 取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌OP50的 NGM培养基上 ➢将培养基放置到16℃生化培养箱中，72h后可繁育至第二 代
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• 冻存 准备1mlEP管，加入700ul30%甘油（s缓冲