秀丽线虫综述 (1)

设备
• 显微注射全套仪器 • 琼脂糖固定垫 • 添 加 了 4% 葡萄糖 (glucose) 的 M9 缓 冲 液
注射步骤
制剂及破针
固定虫
注射
恢复
将纯化的 DNA 溶解在 TrisEDTA(TE)缓冲液中即可接用 于注射。在注射液中加入终浓 度约 10 mg/L 的线虫基因组 DNA，则会有效地提高转基因 效率。 将一小玻片放在加了注射油的 固定垫上，操纵微操使注射针 与玻片边缘相撞，若针头尖端 撞破，可观察到有液泡自动渗 出
能得到若干个独立种系，可选择最好的一个进行实验．
现阶段研究已发现了十几个控制细胞 凋亡的基因，这些凋亡基因之间通过 遗传相互作用组成一条线性的调控途 径控制细胞程序性死亡，包括凋亡的 激活阶段、凋亡的起始 、凋亡细胞的 清除及凋亡细胞内部的 DNA 降解
EGL-1：促凋亡蛋白，属 BCl—2蛋白家族，与哺乳动 物BAD、BIK/NBK及HRK同 源 CED-9:抗凋亡蛋白,与 人体bcl-2同源 CED-4:促凋亡蛋白,同 源体为Apaf-1
秀丽隐杆线虫的饲养及研究用途
By 王传杰
介绍
• 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）,属于线形动物 门、线虫纲。体形非常小,成虫只有1mm左右。 线 虫 是 细 胞 定 数 动 物 ， 两性 成虫 只有 9 5 9 个 体 细 胞 ， 雄 性 成 虫 只 有 1 0 3 1 个 体细 胞 ， 其 中 1 3 1个 细 胞 注 定 要 接 一 定 的发 育 程 序 陆续 死 亡 。 神 经 系 统解 剖结 构 十 分 简 单 ， 仅有 3 0 2个细 胞 ， 约 占整 个 动 物 体 细 胞 总 数 的 三 分 之 一 。它身体透明,能感 知气味和味道,对光线、温度有反应。研究者很容易在显 微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察
M9缓冲液——每升缓冲液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或 6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜现 用现配 S缓冲液——0.1mol/LNaCl,0.05mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓 冲液(pH=6.0)
喂养方法 用冰M9缓冲液清洗虫体 置4℃环境20min 1000r离心，弃上清,沉淀物用M9缓冲液重悬 置4℃环境20min 弃上清 取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌OP50的 NGM培养基上 将培养基放置到16℃生化培养箱中，72h后可繁育至第二 代
需要确定荧光蛋白的连接不影响目的蛋白的功能； b． 目的基因与荧光标记基因共注射；c． 目的基因 与具有明显表型的标记基因共注射，我们通常使用易观察的 pmyo-3::TDimer II作为
荧光标记，它在所有体壁肌肉细胞表达，转基因效率高且本身对线虫的行为 和功能 没有 影响。
显微注射后的整合
•目前常用的整合方法有：用 y射线和 X射线照射，或用光敏剂补骨脂素 加长波紫外线照射整合(TMP/UV integration)． 基本策略是大量筛选经 •射线照射过的转基因线虫，一般挑取数百只 F1 代繁殖，筛选 F4 代， 检测是否有 100%的转基因表达，若是则说明整合成功． 一般一次整合
功能基因组学和功能蛋白组学 的研究
秀丽线虫的蛋白质相互作用网 络也已初步建立，结合 RNAi 等反向遗传学手段 可以有效地 开展相关研究
基于秀丽线虫与人在多种生命活动调控机制 上的相似性 可以用秀丽线虫为动物模型进 行药物筛选
药物筛选
本次汇报结束，谢谢
• 冻存 准备1mlEP管，加入700ul30%甘油（s缓冲 液溶解）
用冰M9缓冲液清洗虫体
百度文库
置4℃环境20min，1000r离心弃去上清
将虫体转入事先准备好的EP管中，置于-80℃ 冰箱冻存（可保存2个月），需要时取出室 温解冻重置培养基
研究范围
细胞程序性死亡的遗传调控机制 RNAi 及其作用机制 秀丽线虫的功能基因组学及其他研究 低氧应答模式生物
CED-3:凋亡蛋白,与 ICE(caspase家族)同 源
低氧能够引起秀丽线虫发生相应的生理和行为学变 化，并可保护机体免受缺氧损伤。秀丽 线虫的低氧诱导因子(HIF-1)的恒定性调控通路和人 类的相应通路之间具有高度保守性，因此秀丽线虫 也已成为研究低氧应答调控通路进化保守性的重要 工具之一。阐明秀丽线虫的低氧应答机制将为了解 人类低氧相关疾病的发病机制提供有价值的线索。
注射时将 线虫挑至 琼脂糖固 定垫上， 调整线虫 使性腺暴 露，滴加 注射油覆 盖整个虫 体． 固定 好后的操 作要迅速， 否则线虫 容易脱水 而死
将琼脂糖固定垫放 在载物台上，40x物 镜下找到线虫，使 性腺聚焦在正确的 平面． 操作微操或 轻移滑动载物台， 将注射针尖刺入性 腺． 启动微量加压 器进行注射，能观 察到注射液在性腺 中快速流动，注射 后的性腺被液体充 满．
饲养与冻存
设备试剂： 大肠杆菌OP50 —— 大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型,作为 秀丽隐杆线虫的食物。 NGM培养基——1000ml的NGM培养基内加有:3gNaCl,2.5g蛋 白胨,17g琼脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液 (pH=6.0)25ml,975ml蒸馏水,灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固 醇溶液(5mg/ml乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的 CaCl 21ml
首个时序调控的miRNA 基因 lin-4发现于线虫，转 录后形成两种长度的RNA，较小的一个与基因lin14的mRNA互补配对阻碍其翻译，随后又发现了类 似作用的let-7.
衰老和寿命控制机制
DAF-16 蛋白可以转运到细胞核中激活 靶基因转录时 线虫的寿命就可延长 反 之则缩短
RNAI机制研究 根据线虫细胞内相关蛋白 保守性，在全基因组范围 内筛选功能蛋白，并对比 于人相关调节机制研究
在体视显微镜下， 滴加恢复缓冲液至 注射后的线虫正上 方，由于与油互不 相溶，缓冲液会渗 入油下使线虫浮起 ． 一般等待 2～ 5 min，线虫活力恢 复，身体开始游动 ，即可挑至培养板 上，20℃ 常规培养 ．
子代目的基因表达检测
注射后约 3 天，观察孵出的 F1 代是否有目的 DNA 表达． 目前，线虫外源基因表达的标记通常 用：a． 荧光蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，但
基因组学和功能蛋白组学的研究
其他（MAPK 信号传导 、 TGF- b 信号传递途径 、衰老和年龄及脂
肪代谢等）
方法 —— 线虫基因显微注射
显微注射技术是线虫研究领域的常用技术，对 线虫进行转基因操作的一种高效且相对简单的 方法，主 要用于研究线虫突变种系的功能恢复 (mutant rescue)、特定基因的过表达或异位表 达、标 签 蛋白的 表达、特 定 蛋白 质 结构域 的功 能、DNA 或 RNA 调节元件的分析及 RNA 干扰等． 此外，这项转基因技术对于特 异表型的筛选也是个强有 力 的 工具 ， 并 且 它还 可 用于 将人 工 合 成 mRNAs 或其他分 子接引入细胞
低氧环境
秀丽线虫的非HIF一1介导的低氧应答通路
胰岛素／胰岛素样受体DAF-2通路
热休克蛋白及其它
秀丽线虫中低氧诱导因子HIF—1介 导的低氧应答
秀丽线虫的氧感知神经回路
通过研究miRNA在线虫细胞内对于靶 基因翻译表达的阻碍作用，为疾病治疗 提供新手段，特别是探究其对RNA病毒 侵染的抑制作用