基因工程(3).ppt
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基因工程ppt课件
的 基
出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有
本 内
相应变化的个体进一步培养、研究。
容
例：用棉铃饲喂棉
铃虫，如虫吃后不出现
中毒症状，说明未摄入
中
央
电
教
馆
资
源
中 心
21
目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
基 因 工 程 的 基 本 内 容
中
央
电
教
馆
资
央
电
教
馆
资
源
中 心
15
提取目的基因
将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。
取出 DNA
用限制酶 切断DNA
目前被较广泛 提取使用的目的基 因有：苏云金杆菌 抗虫基因、人胰岛 素基因、人干扰素 基因、种子贮藏蛋 白基因、植物抗病 基因等。
提取目的基因的方法（一）
基 直接分离基因——鸟枪法
因 工
将供体生物的DNA用限制
程 的
酶切割为许多片段，再用运载
基 本Biblioteka 体将这些片段都运载到受体生
内 物的不同细胞中去。只要有一
容 个细胞获得了需要的目的基因
并得以表达，基因工程就算成
功了。
中 央
该法最大的缺点是带有很
电 教
大的盲目性，工作量大，成功
馆
资 源
率低。且不能将真核生物的基
中 心
16 因转移到原核生物中去。
用限制酶 切成许多
源
中 心
22
几种限制性内切酶
返回
基 因 工 程 的 基 本 内 容
中
央
电
教
基因工程第三章
由pSC101派生来的载体。
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
基因工程第三章
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
基因工程第三章
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
基因工程第三章
三、质粒载体的构建
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
基因工程第三章
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
基因工程第三章
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
基因工程第三章
三、质粒载体的构建
基因工程载体(质粒)(三)
从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞
(高频重组细胞)。
F因子是雄性决定因子，F+ 细胞表面可以形成 一种叫做性须（pilus）的结果，它促使F+ 经 性须进入F- 细胞。F- 细胞则变为F+ 细胞。F因 子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄 主染色体一道转移。但F因子的这种整合过程 是可逆的。在一定条件下，Hfr细胞又可重新 变为F+或F-细胞。 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角度 考虑
常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有： 四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉 素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo） 等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成 AmPr，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒 称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素 抗性基因
新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重 组体： ①HA ②Luaferase ③GFP ④便于检测的多肽
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。 如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1 是一种可以
钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将 外源DNA片段插入到会导致选择性基因(Ampr，Tetr等)失活的位点。如
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程3大肠杆菌表达系统
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核糖 体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效率 的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
5、容易进行代谢调控；
6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、
链霉菌等；
2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物
细胞等。
一、真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
TAG
TAAGGAGG（N）8
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
• • • • • 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
转录水平
翻译水平
（1）启动子
要使克隆的外源基因高水平表达的最佳 启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达 水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为 重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的 方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理 （如热）和化学（如IPTG）诱导 。
（5）翻译终止密码
对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条 件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆 菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码 子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
5、容易进行代谢调控；
6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、
链霉菌等；
2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物
细胞等。
一、真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
TAG
TAAGGAGG（N）8
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
• • • • • 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
转录水平
翻译水平
（1）启动子
要使克隆的外源基因高水平表达的最佳 启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达 水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为 重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的 方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理 （如热）和化学（如IPTG）诱导 。
（5）翻译终止密码
对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条 件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆 菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码 子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。
人教版高中生物选修3课件：专题一基因工程(选修三)
质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
的工具
运载 工具
专题1-2
目的基因的获取
基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
(一）、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。 也可以是一些具有调控作用的因因 化学方法直接人工合成
1、基因表达载体的组成
目的基因 启动子: 一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的 首端。是RNA聚合酶识别和结合的部位， 有了它才能驱动基因转录mRNA，最终 获得蛋白质。 终止子: 一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的尾端。使 转录在所需要的地方停止。 标记基因等 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因 的细胞筛选出来，如青霉素基因。
③目的基因是否翻译出蛋白质
检测方法: 抗原—抗体杂交
2、个体生物学水平的鉴定
例2、回答有关基因工程的问题因工程的问题： （1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后， 可能产生粘性末端，也可能产生___ 平 末端。若要在限制酶切割目 的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生 _____ 相同（相同，不同）粘性末端的限制酶。 （2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛 素基因及其启动子等，其中启动子的作用是 提供RNA聚合酶 特异性识别结合位点，驱动基因转录 。在用表达载体转化大肠杆菌时， 2+ Ca 常用 处理大肠杆菌，以利于表达载体进入：为了检测胰岛 素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与 DNA—RNA分子杂交 mRNA杂交，该杂交技术称为 。为了检测胰岛 素基因转录的mRNA是否翻译成 _，常用抗原胰岛素原（蛋白质） 抗体杂交技术。 如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的 基因插入农杆菌Ti质粒的 T—DNA 中，然后用该农杆菌感染植物 细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的 染色体 上。
的工具
运载 工具
专题1-2
目的基因的获取
基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
(一）、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。 也可以是一些具有调控作用的因因 化学方法直接人工合成
1、基因表达载体的组成
目的基因 启动子: 一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的 首端。是RNA聚合酶识别和结合的部位， 有了它才能驱动基因转录mRNA，最终 获得蛋白质。 终止子: 一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的尾端。使 转录在所需要的地方停止。 标记基因等 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因 的细胞筛选出来，如青霉素基因。
③目的基因是否翻译出蛋白质
检测方法: 抗原—抗体杂交
2、个体生物学水平的鉴定
例2、回答有关基因工程的问题因工程的问题： （1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后， 可能产生粘性末端，也可能产生___ 平 末端。若要在限制酶切割目 的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生 _____ 相同（相同，不同）粘性末端的限制酶。 （2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛 素基因及其启动子等，其中启动子的作用是 提供RNA聚合酶 特异性识别结合位点，驱动基因转录 。在用表达载体转化大肠杆菌时， 2+ Ca 常用 处理大肠杆菌，以利于表达载体进入：为了检测胰岛 素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与 DNA—RNA分子杂交 mRNA杂交，该杂交技术称为 。为了检测胰岛 素基因转录的mRNA是否翻译成 _，常用抗原胰岛素原（蛋白质） 抗体杂交技术。 如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的 基因插入农杆菌Ti质粒的 T—DNA 中，然后用该农杆菌感染植物 细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的 染色体 上。
基因工程概论(3)
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3’ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5’
Zn2+
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A… 5’
gap
核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）：
TdT的基本特性：来自小牛胸腺
不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5’ p 3’ HO
3’ HO
TdT
5’ p 3’ HO AAAAAAAAAAA
Co2+
dATP AAAAAAAAAAAAAA OH 3’
p 5’
3 基因工程的基本条件
B 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征
质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA
考斯质粒（cosmid）
载体的功能及特征 载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
DNA pol I
5’ ppp dN Mg2+
3’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） ：
Klenow 酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得C端三分之二的大 肽段，即为Klenow酶。 Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
… 3’
… 5’
基因工程：第三章 大肠杆菌基因工程
诱导 高效转录
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
高效转录 O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控
lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基
底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
高水平转录 阻遏蛋白
l噬菌体启动子PL / PR
受CI阻遏蛋白阻遏
阻遏作用
常采用温度敏感型突变cI857
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，
Ptrp
PL便可介导目的基因的表达。但
在大型细菌培养罐中迅速升温非
常困难，因此常使用一个双质粒
控制系统，用色氨酸间接控制目
的基因表达。 Ptrp
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达水平高，遗传较稳定 优良的工业性能： 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统
一、大肠杆菌表达系统的优缺点 你有不足，但你仍是最爱——缺点
缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖 基化蛋白、结构复杂的蛋白等） 胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵 体），分泌机制不完善 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
组成型与诱导型启动子
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
高效转录 O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控
lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基
底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
高水平转录 阻遏蛋白
l噬菌体启动子PL / PR
受CI阻遏蛋白阻遏
阻遏作用
常采用温度敏感型突变cI857
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，
Ptrp
PL便可介导目的基因的表达。但
在大型细菌培养罐中迅速升温非
常困难，因此常使用一个双质粒
控制系统，用色氨酸间接控制目
的基因表达。 Ptrp
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达水平高，遗传较稳定 优良的工业性能： 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统
一、大肠杆菌表达系统的优缺点 你有不足，但你仍是最爱——缺点
缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖 基化蛋白、结构复杂的蛋白等） 胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵 体），分泌机制不完善 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
组成型与诱导型启动子
遗传与基因工程PPT课件
3、运输工具 基因操作步骤
12
◆不同种类的蛋白质的基因所含的外显子和内含 子的数目和长度是不同的。
34
成果与发展前景 ◆每个编码蛋白质的基因都含有若干个外显子和内含子
与医药卫生
与农牧业20食20品年业10月2日
8
与环境保护
比较：原核细胞和真核细胞基因的异同
第一节细胞质遗传 相同点：都是由能够编码蛋白质的编码 细胞质遗传概念 区和具有调控作用的非编码区组成的。
与农牧业20食20品年业10月2日 与环境保护
基因工程的成果和发展前景
2
第一节 细胞质遗传
（一）、细胞质遗传概念：由细胞质遗传物质控制的遗传现象。
第一节细胞质遗传
细胞质遗传概念 质体 含叶绿素 叶绿体 含胡萝卜素 有色体 不含色素 白色体
细胞质遗传特点
物质基础
紫茉莉花质体的遗传
第二节基因结构
原核基因结构 真核基因结构 原、真基因异同 人类基因组计划 第三节基因工程 基因操作工具
第二节基因结构
原核基因结构 真核基因结构
RNA聚合酶 结合位点 调控遗传信息的表达
原、真基因异同
人类基因组计划 编码区：能够转录为相应的信史RNA，进而指导蛋白 第三节基因工程 质的合成，能够编码蛋白质的区段。
基因操作工具
1、剪刀 2、针线
非编码区：有调控遗传信息表达的核苷酸序列。
3、运输工具 基因操作步骤
白色 绿色 花斑
白色 绿色 花斑 白色 绿色 花斑 白色 绿色 花斑
白色 绿色 白色 绿色 花3 斑
（二）、细胞质遗传的特点
第一节细胞质遗传 细胞质遗传概念
1、F1总是表现为母本性状－－母系遗传
细胞质遗传特点
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
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• ACGT即Adenine, Cytosine, Guanine, 和 Thymine的根基 (base)。
• DNA的兩個鍵以互補的方式配對結合，即A對 T，C對G。
• 一個DNA大概有3000個根基配對(base pair)， 這相當於1000個氨基酸，氨基酸組成蛋白質。
基因工程的應用
• 基因圖和我們日常 的生活有什麼關係?
• 隱私的問題 • 家庭的問題 • 研發的問題 • 權益的問題 • 歧視的問題
基督徒如何看待基因工程？
• 妥善防範的原則 • 健康生態的原則 • 自主節制的原則 • 無害檢驗的原則 • 使人獲益的原則 • 機會均等的原則
結論
• 求神賜給我們智慧，帶領我 們正確地去使用這些科技， 做好管家的職份。
• 農牧業 • 複製 (克隆：Clone)
• 疾病治療 • 法醫鑑定 • 健康檢查
基因工程的應用
基因工程引起的倫理問題 (I)
• 人是否可以改變生物體的基因？ • 基因治療是「治療」或是「強
化」? • 人有權決定「存留」或「毀壞」
胚胎嗎? • 人可以複製或clone(克隆)動物甚
至人嗎？
基因工程引起的倫理問題 (II)
基因工程
什麼是基因(Gene) ？ •基因是生物的遺傳密碼，細胞分 裂時，可以一代一代傳下來。 •基因是染色體上特定的DNA序列， 它是製造蛋白質的藍圖。
DNA
• Deoxyribose Nucleic Acid 去氧醣核酸，是 細胞核裏的大分子。
• DNA是由兩條鍵螺旋結合，每條鍵以ACGT排 列組合而成。
• 在神的許可下，基因工程不 但可以提高人生活的品質， 並且在我們的身上榮耀神。
• DNA的兩個鍵以互補的方式配對結合，即A對 T，C對G。
• 一個DNA大概有3000個根基配對(base pair)， 這相當於1000個氨基酸，氨基酸組成蛋白質。
基因工程的應用
• 基因圖和我們日常 的生活有什麼關係?
• 隱私的問題 • 家庭的問題 • 研發的問題 • 權益的問題 • 歧視的問題
基督徒如何看待基因工程？
• 妥善防範的原則 • 健康生態的原則 • 自主節制的原則 • 無害檢驗的原則 • 使人獲益的原則 • 機會均等的原則
結論
• 求神賜給我們智慧，帶領我 們正確地去使用這些科技， 做好管家的職份。
• 農牧業 • 複製 (克隆：Clone)
• 疾病治療 • 法醫鑑定 • 健康檢查
基因工程的應用
基因工程引起的倫理問題 (I)
• 人是否可以改變生物體的基因？ • 基因治療是「治療」或是「強
化」? • 人有權決定「存留」或「毀壞」
胚胎嗎? • 人可以複製或clone(克隆)動物甚
至人嗎？
基因工程引起的倫理問題 (II)
基因工程
什麼是基因(Gene) ？ •基因是生物的遺傳密碼，細胞分 裂時，可以一代一代傳下來。 •基因是染色體上特定的DNA序列， 它是製造蛋白質的藍圖。
DNA
• Deoxyribose Nucleic Acid 去氧醣核酸，是 細胞核裏的大分子。
• DNA是由兩條鍵螺旋結合，每條鍵以ACGT排 列組合而成。
• 在神的許可下，基因工程不 但可以提高人生活的品質， 並且在我們的身上榮耀神。