连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响研究

－ 223. 6 López － Candales A，Rajagopalan N，Gulyasy
B. Differential strain and velocity generation along the right ventricular free wall pulmary hypertension ［J］． Can J Cardiol， 2009， 25 ( 3) : e73 － 77. 7 朱雯，黄国倩，颜平，等 . 应用速度向量 成像技 术评 价右室整体及 局 部 功 能 ［J］． 中国超声医学杂志，2010，7 ( 26) : 623 － 627.
外，还存在三维空间上的扭转运动，这些 可能在一定程度上解释了为何本研究结果 显示左、右心室心肌从基底段至心尖段收 缩期峰值应变的趋势相反，这可能与右心 室独特的解剖结构及心脏整体呈 “拧麻 花” 样的扭转运动有关。
综上所述，T2DM 患者在无心功能减 低的临床 表 现 及 心 脏 整 体 收 缩 功 能 减 低 前，左、右心室心内膜下心肌纵向收缩期 峰值应变与正常人比较已有显著减低，说 明 T2DM 患者早期出现局部心肌收缩功能 减低。 参考文献 1 林诗彬，龚渭冰 . QTVI 及 RT － 3D 超声心
( 收稿日期: 2012 － 02 － 10; 修回日期: 2012 － 05 － 15) ( 本文编辑: 刘莉)
·2083·
Effect of Phillyrin on Gene Expression of Influenza A Virus Nucleoprotein DUAN Lin － jian，ZHANG Qing，WANG Nong － rong，et al. Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006，China
动图评价原发性高血压患者右心功能 ［J］． 中国热带医学，2010，10 ( 6) : 751 － 754. 2 Amundsen BH，Helle － Valle T， Edvardsen T， et al. Noninvasivemyocardial strain measurement by speckle tracking echocardiography validation against sonomicrometry and tagged magneticresonance imaging ［J］． J Am Coll Cardiol，2006，47 ( 4) : 789 － 793. 3 石小红，邓又斌，杨好意，等 . 定量组织 速度成像技术评价非胰岛素依赖型糖尿病 患者心内膜下心肌缺血 ［J］． 中华超声影
【Abstract】 Objective To investigate the effect of phillyrin on gene expression of influenza A virus nucleoprotein after transfection. Methods Hela cells were transfected with NP gene of influenza A virus，and Influenza A virus colloidal gold method was used to detect the phillyrin supernatant and intracellular nucleoprotein expression，and RT － PCR was used to detect the NP gene copy number. Results NP recombinant plasmid group contained high level influenza A virus nucleoprotein. Empty plasmid group，liposome group and Hela cells group mainly did not contain influenza A virus nucleoprotein. Phillyrin supernatant contained no or little influenza A virus nucleoprotein. Phillyrin contained low level intracellular influenza A virus nucleoprotein. RT － PCR calibration curve showed the correlation was 0. 998 and the efficiency was 97. 4% . 48 h after four times transfection，NP gene expression level was ( 2. 05 ± 0. 3) × 105 copy number / μl in Phillyrin group， ( 61. 5 ± 15. 0) × 105 copy number / μl in recombinant plasmid group，significantly higher than Phillyrin group. The difference of NP gene expression level between Phillyrin group and recombinant plasmid group was statistically significant ( t = 7. 672，P ＜ 0. O5) . Conclusion Phillyrin can inhibit the expression of Influenza A virus NP gene after transfection.
·2082·
·中医·中西医结合研究·
连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响研究
段林建，张 清，王农荣，杨 斌，何士勤，孙 坚
【摘要】 目的 探讨连翘苷对甲型流感病毒核蛋白 ( NP) 基因转染后表达的影响。方法 将甲型流感病毒 NP 基因转染 Hela 细胞，用甲型流感病毒胶体金法检测连翘苷对转染后细胞内和上清核蛋白表达情况，用实时定量反转录 聚合酶链反应 ( RT － PCR) 检测 Hela 细胞内 NP 基因的拷贝数。结果 NP 重组质粒组甲型流感病毒核蛋白含量高。空 质粒组、脂质体组、Hela 细胞组基本不含甲型流感病毒核蛋白。连翘苷组上清无或可能含有微量核蛋白。连翘苷组胞 内甲型流感病毒含量不高。RT － PCR 校正曲线相关性为 0. 998，效率为 97. 4% 。重复 4 次转染后 48 h 连翘苷组 NP 基 因表达量为 ( 2. 1 ± 0. 3) × 105 拷贝数 / μl，NP 重组质粒组 NP 基因表达量为 ( 61. 5 ± 15. 0) × 105 拷贝数 / μl，连翘苷 组 NP 基因表达量低于 NP 重组质粒组，差异有统计学意义 ( t = 7. 672，P ＜ 0. 05) 。结论 连翘苷可以抑制甲型流感病 毒 NP 基因转染后表达。
【关键词】 连翘苷; 甲型流感病毒; NP 基因 【中图分类号】 R 285 【文献标识码】 A 【文章编号】1007 － 9572 ( 2012) 06 － 2082 － 03
doi: 10. 3969 / j. issn. 1007 － 9572. 2012. 06. 101 基金项目: 国家自然科学基金项目 ( 30860351) ; 江西省卫生厅中医药科研基金 ( 2008ZZ0014) 作者单位: 330006 江西省南昌市，南昌大学医学院 ( 段林建，张清) ; 南昌大学第四附属医院 ( 王农荣，杨斌，何士勤，孙坚) 通讯作者: 孙坚，330002 江西省南昌市，南昌大学第四附属医院; E － mail: cdsfysj@ yahoo. com. cn
心室游离壁各节段心肌收缩期峰值应变显 著低于正常对照组，表明右心室局部心肌 收缩功能也受到了损害。本研究中 T2DM 组患者右心室收缩功能均减低的原因可能 有如下方面: 右心室室壁较薄，且以纵行 肌为主，糖尿病微血管病变导致心内膜下 纵行心肌缺血; 左右心室通过共同的血 供、肌纤维解剖、室间隔和心包实现其在 解剖学上的一体化，所以左右心室收缩功 能在一定程度上相互影响; 糖尿病时伴随 的一系列神经、体液因素的异常参与了作 用［5］。两组 中 右 心 室 游 离 壁 基 底 段 至 心 尖段收缩期峰值应变逐渐减小，这应该与 右心室游离壁基底段在右心室射血中发挥 的作用大于心尖段有关。以往也有研究认 为右心室 游 离 壁 的 速 度 存 在 此 种 改 变 趋 势［6］，但是 对 于 应 变 是 否 存 在 梯 度 仍 有 争议。造成这种差异的原因除了与观察人 群及使用仪器不同有关外，还可能与采用 不同的成像技术有关。右心室心尖部较基 底部心 肌 薄、肌 小 梁 多［7］，因 此，心 底 部较心尖部具有更大的形变和主动运动能 力是合理的。众所周知，心脏射血是一个 非常复杂的过程，除了二维方向上的收缩
【Key words】 Phillyrin; Influenza A virus; NP Gene

甲型流感具有突然暴发、迅速扩散、季节性流行等特点， 严重威胁全球人类健康。中草药为祖国传统医学的宝藏，用于 治疗甲型流感越来越普遍。连翘 ( Forsythia suspensa) 为木犀 科植物，味苦、无毒、性微寒，具有清热解毒、消肿散结之功 效，常用于治疗风热感冒［1］。连翘为双黄连、银翘散等 40 余 种药物的 重 要 成 分， 具 有 明 确 的 体 外 抗 流 感 病 毒 作 用［2］ 。 本 研究结合中医理论及现代分子生物学技术，通过甲型流感病毒 核蛋白 ( nucleoprotein，NP) 基因的转染，观察 连翘 苷对 NP 基因转染后表达的影响。 1 材料与方法 1. 1 主要材料 真核质粒 pcDNA3. 1 ( + ) / NP 由本室制备; 引物根据 ( GenBank / NCB，GI: 8486129) 毒株的 NP 基 因全 长序 列 设 计 如 下 NP － R1467: CGGGTTCGTTGCCTTTTCGTC、 NP － 1033: TGGATGGCATGCCACTCTGC; 连翘苷 ( 南京泽朗 医药科技有限公司，纯度 98% ) ; Hela 细胞株由南昌大学医学 院微生物教研室馈赠; DMEM 基础培养基、Opti － MEM 培养 基 ( USA，Gibco) ; 胎牛血清 ( USA，Hyclone) ; 感受态细菌 DH5α 由本室制备及保存; 质粒抽提纯化试剂盒 ( USA，Genomed) ; 甲型流感病毒 NP ( 胶体金法) 检测试剂盒 ( 北京， 阿斯可来) ; LipofectamineTM 2000、RNA 抽提试剂盒、第一链 cDNA 合成试剂盒、反转录聚合酶链反应 ( RT － PCR) 试剂盒 ( USA，invitrogen) 等。 1. 2 仪器 二氧化碳 ( CO2 ) 培养箱 ( USA，Shellab) ; 超低 温冰箱 ( JAPAN，SANYO) ; Ⅱ级生物安全柜 ( 北京，东联哈 尔) ; 洁净工作台 ( 上海，博讯) ; 恒温恒湿振荡器 ( 太仓， 华利达) ; 电子天 秤 ( 北京，赛多利斯) ; 倒置 显微镜 ( JAPAN，Olympus ) ; UV － 2450 紫外分光光度计 ( 日本，岛津) ; 台式高 速 冷 冻 离 心 机 ( 湖 南，凯 达 ) ; 移 液 器 ( USA， Glison) ; 聚合酶链式反应 ( PCR) 仪 ( 美国，伯乐) 等。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 实验药物制备 电子天平微量称取连翘苷 2 mg 溶于 10 μl 浓度为 100% 的二甲基亚砜 ( DMSO) 中，加入 9. 99 ml 无 抗生素的生长液，配制的连翘苷原液浓度为 200 μg / ml，DMSO 终浓度为 1% ，充分混匀后用 φ0. 22 μm 滤器过滤 6 次。